專利名稱：：反式－4－羥基－l－脯氨酸的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及工業(yè)上制造反式-4-羥基-L-脯氨酸的方法，所說反式-4-羥基-L-脯氨酸可以作為N-乙酰羥脯氨酸(用作消炎藥)、碳雜青霉烯系抗生素等醫(yī)藥品的合成原料或食品添加劑使用，而且本發(fā)明還涉及用于該制造方法中的含有L-脯氨酸-4-羥化酶基因而且使脯氨酸合成系統(tǒng)活性增強的轉(zhuǎn)化體。利用微生物制造反式-4-羥基-L-脯氨酸的方法已知有如下一些報道。1)利用屬于大腸桿菌屬的微生物，由4-羥基-2-酮戊二酸制造反式-4-羥基-L-脯氨酸的方法(特開平3-266995)，2)利用細(xì)菌或霉類直接發(fā)酵生產(chǎn)的方法(EuropeanPatentAp-plicationEPO547898A2、特開平5-236980、特開平6-245782)，3)利用屬于鏈霉菌屬的微生物，由L-脯氨酸制造反式-4-羥基-L-脯氨酸的方法[J.Biol.Chem.、254卷、6684-6690頁(1979年)，Biochem.Biophys.Res.Comm.、120卷，45-51頁(1984年)，TetrahedronLetters，34卷，7489～7492頁(1993年)，TetrahedronLetters、35卷，4649～4652頁(1994年)]。以前的反式-4-羥基-L-脯氨酸的制造方法中由于存在有如下一些問題，工業(yè)化生產(chǎn)困難，這些問題是1)由于是由4-羥基-2-酮戊二酸等制造反式-4-羥基-L-脯氨酸，基底物價格高而且很難買到，2)反式-4-羥基-L-脯氨酸的生產(chǎn)效率低，3)參與反式-4-羥基-L-脯氨酸制造的酶的活性很弱。而有關(guān)參與反式-4-羥基-L-脯氨酸制造的酶有如下報道，即有從指孢囊菌(Dactylosporangiumsp.)RH1精制L-脯氨酸-4-羥化酶的報道(特開平7-322885)，以及由上述的屬于鏈霉菌屬的微生物精制該酶的報道[Biochem.J.、313卷，185-191(1966)]。另外還有編碼在2-酮戊二酸和2價鐵離子存在下，具有使游離的L-脯氨酸轉(zhuǎn)換成反式-4-羥基-L-脯氨酸活性的L-脯氨酸-4-羥化酶的基因可從上述的指孢囊菌(Dactylosporangiumsp.)RH1篩選出，獲得含有L-脯氨酸-4-羥化酶基因的質(zhì)粒pRH71，再構(gòu)建在色氨酸串聯(lián)啟動子控制下使L-脯氨酸-4-羥化酶基因表達的質(zhì)粒pTr2-40H，在大腸桿菌中表達活性的報道(日本農(nóng)藝化學(xué)會1996年度大會、講演要旨集257頁)。使用活性高的L-脯氨酸-4-羥化酶，找出利于工業(yè)上制造反式-4-羥基-L-脯氨酸的方法。另一方面已弄清楚了有關(guān)脯氨酸生物合成途徑中的酶和其基因存在于大腸桿菌等生物中[J.Gen.Microbiol.、118卷、287-293(1980年)，Blochim.Biophys.Acta、104卷、397-404(1965年)]。而脯氨酸生物合成例如在大腸桿菌等生物中作為生物合成途徑中的第一酶γ-谷氨酰激酶(GK)可以通過產(chǎn)物脯氨酸的反饋抑制被調(diào)節(jié)[Biochim.Biophys.Acta、192卷、462-467(1969年)]。另外，已知通過使編碼GK的基因ProB產(chǎn)生變異，生成使反饋抑制顯著減少的GK，制造出脯氨酸高生產(chǎn)株[Mol.Gen.Genet.、182卷、82-86(1981年)，J.Becteriol.、156卷、1249-1262(1983年)，以及J.Bacteriol.、164卷、1088-1093(1985年)]。作為使該ProB引起了變異的基因已知有ProB74，已知ProB74的變異點通過將編碼區(qū)5′端開始的319號的G換成A，結(jié)果使得從ProB蛋白的N末端的第107號天冬氨酸變成了天冬酰胺[Gene、64卷、199-205(1988年)]。參與脯氨酸分解的酶系、編碼該酶系的基因、以及基因的調(diào)控也通過對大腸桿菌、沙門氏菌等研究逐漸清楚了[J.Bacteriol.、146卷、895-901(1981年)，J.Mol.Biol.、148卷、21-44(1981))。利用使脯氨酸生物合成系統(tǒng)的活性增強的菌株制造反式-4-羥基-L-脯氨酸的方法還沒有報道。本發(fā)明的課題在于為了更利于工業(yè)上利用L-脯氨酸-4-羥化酶有效地制造反式-4-羥基-L-脯氨酸，提供了一種含有L-脯氨酸-4-羥化酶基因、帶有使該基因高效表達的重組DNA、并且使脯氨酸生物合成系統(tǒng)的活性增強的轉(zhuǎn)化體，以及利用該轉(zhuǎn)化體能很便宜地工業(yè)上制造反式-4-羥基-L-脯氨酸的方法。本發(fā)明是有關(guān)反式-4-羥基-L-脯氨酸的制造方法的發(fā)明，其特征是將含有編碼在2-酮戊二酸和2價鐵離子存在下能作用于游離的L-脯氨酸生成反式-4-羥基-L-脯氨酸的具有L-脯氨酸-4-羥化酶活性的蛋白質(zhì)的基因的DNA片段重組入載體里，得到帶有重組DNA并且使L-脯氨酸生物合成系統(tǒng)的活性增強的轉(zhuǎn)化體，然后培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化體，以該培養(yǎng)物、菌體或它們的處理物作為酶源，在2-酮戊二酸和2價鐵離子存在下，于水性介質(zhì)中將L-脯氨酸轉(zhuǎn)換成反式-4-羥基-L-脯氨酸，再從水性介質(zhì)中獲得生成的反式-4-羥基-L-脯氨酸。以下詳細(xì)地說明本發(fā)明。與本發(fā)明有關(guān)的L-脯氨酸-4-羥化酶是一種在2-酮戊二酸和2價鐵離子存在下，使游離的L-脯氨酸羥基化生成反式-4-羥基-L-脯氨酸的酶。含有編碼本發(fā)明的L-脯氨酸-4-羥化酶的DNA的質(zhì)粒，例如有pRH71等。含pRH71的大腸桿菌大腸桿菌SOLR/pRH71于平成7年3月2日以FERMBP-5025保藏于工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所，地址是日本國茨城具筑波市東1丁目1番3號(郵政編碼305)。為了使L-脯氨酸-4-羥化酶基因在宿主細(xì)胞中表達，首先用限制性酶類或DNA分解酶類將含有L-脯氨酸-4-羥化酶基因的DNA片段作成含有該基因的適當(dāng)長度的DNA片段，然后插入表達載體中啟動子的下游，再將該表達載體導(dǎo)入適合該載體的宿主中。作為宿主，可以表達目的基因的都可以使用。例如除了可以使用屬于大腸桿菌屬、沙雷代菌屬、棒狀桿菌屬、短頸細(xì)菌屬，假單胞菌屬、芽胞桿菌屬等屬的微生物菌株外，也可使用酵母菌株或動物細(xì)胞宿主等。作為表達載體、可以使用能在上述宿主中獨立復(fù)制或者可重組入染色體中，在可以轉(zhuǎn)錄L-脯氨酸-4-羥化酶基因的位置中含有啟動子的載體。以大腸桿菌等微生物作為宿主時，L-脯氨酸-4-羥化酶表達載體在微生物中獨立復(fù)制的同時，最好是由啟動子、核糖體結(jié)合序列、L-脯氨酸-4-羥化酶基因、轉(zhuǎn)錄終止序列構(gòu)成，含有控制啟動子的基因更好。作為表達載體，例如有pBTrp2、pBTac1、pBTac2(以上都是BoehringerManheim出售)、pKYP10(特開昭58-110600)、pKYP200[Agric.Biol.Chem.，48卷，669-675(1984年)、pLSA1[Agric.Biol.Chem.，53卷，277(1989年)]、pGEL1[Proc.Natl.A-cad.Sci.，USA，82卷，4306(1985年)]、pBluescript(STRATA-GENE公司)、pTrs30[由E.ColiJM109/pTrs30(FERMBP-5407)制備]和pTrs32[由E.ColiJM109/pTrs32(FERMBP-5408)制備]。作為啟動子，只要是在大腸桿菌等宿主中能表達的即可。例如，可以用trp啟動子(Ptrp)、lac啟動子(Plac)、PL啟動子、PR啟動子等，以及來自大腸菌或噬菌體等的啟動子。另外也可以采用像將2個Ptrp串聯(lián)的啟動子(Ptrpx2)、tac啟動子那樣人為設(shè)計改變的啟動子。作為核糖體結(jié)合序列，只要是在大腸桿菌等宿主中能表達的即可，但最好是采用將核糖體結(jié)合序列和起始密碼之間留出適當(dāng)?shù)木嚯x(例如6-18堿基)的質(zhì)粒。L-脯氨酸-4-羥化酶基因只要是編碼L-脯氨酸-4-羥化酶的基因哪種都可以用，但為了使該基因的DNA序列變成最適合于在宿主微生物中表達的密碼，通過替換堿基可以作到高效表達。以大腸桿菌作為宿主，作成最適合表達的密碼，作為替換了堿基的L-脯氨酸-4-羥化酶基因的具體例子給出了序列號1等表示的堿基序列。該基因表達中的轉(zhuǎn)錄終止序列雖然未必需要，但最好是在緊靠著結(jié)構(gòu)基因的下面配置轉(zhuǎn)錄終止序列。作為宿主可以使用大腸桿菌XL1-Blue、大腸桿菌XL2-Blue、大腸桿菌DH1、大腸桿菌MC1000、大腸桿菌KY3276、大腸桿菌W1485、大腸桿菌JM109、大腸桿菌HB101、大腸桿菌No.49、大腸桿菌W3110、大腸桿菌NY49、枯草桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短桿菌屬immariophilumATCC14068、短桿菌屬saccharolyticumATCC14066、短桿菌屬flavumATCC14067、短桿菌屬lactofermentumATCC13869、棒桿菌屬glutamicumATCC13032、嗜乙酰乙酸棒桿菌ATCC13870、微桿菌屬ammoniaphilumATCC15354等。用酵母菌株作宿主時，作為表達載體，例如可以使用YEp13(ATCC37115)、YEp24(ATCC37051)、YCp50(ATCC37419)等。作為啟動子，只要是在酵母菌株的宿主中可以表達的即可。例如可以使用己糖激酶等糖酵解系統(tǒng)的基因的啟動子、gal1啟動子、gal10啟動子、熱休克蛋白啟動子、MFα1啟動子、CUP1啟動子等。作為宿主可以用釀酒酵母、粟酒裂殖酵母、乳酸克魯維酵母、絲孢酵母屬pullulans、河岸許旺酵母等。以動物細(xì)胞作為宿主時，作為表達載體可以使用pcDNAI/Amp、pcDNAI、pcDM8(都是Funacoshi公司出售)等。作為啟動子，只要在動物細(xì)胞中能表達的即可。例如可以用人CMV的IE(im-mediateearly)基因的啟動子等。另外也可以將人CMV的IE基因的增強子與啟動子共用。作為宿主可以使用Namalba細(xì)胞HBT5637(特開昭63-299)、COS細(xì)胞、CHO細(xì)胞等。作為向動物細(xì)胞導(dǎo)入DNA的方法，只要能夠?qū)NA導(dǎo)入動物細(xì)胞的即可。例如可以使用電穿孔法[Miyaji等人Cytotechnology，3，133(1990)]、磷酸鈣法(特開平2-227075)、脂質(zhì)體載體法[PhilipL.Felgner等人Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，84，7413(1987)]。轉(zhuǎn)化株的獲得和培養(yǎng)按照特開平2-227075或特開平2-257891記載的方法進行。為了作到使宿主的脯氨酸生物合成系統(tǒng)的活性增強可以通過以下步驟完成。1)使宿主中的脯氨酸合成系統(tǒng)基因的拷貝數(shù)增加、2)使編碼受到來自脯氨酸反饋抑制的合成系統(tǒng)的基因變異，將編碼來自脯氨酸反饋抑制顯著減少的酶的基因?qū)胨拗鳌?)使脯氨酸的分解活性缺失、或者是通過將上述操作組合起來。脯氨酸合成系統(tǒng)的基因或編碼來自脯氨酸反饋抑制顯著減少的脯氨酸合成系統(tǒng)的酶的基因無論是存在宿主的染色體上還是存在于質(zhì)粒等宿主中的載體上都可以。作為編碼因脯氨酸反饋抑制顯著減少的脯氨酸合成系統(tǒng)酶的基因有proB74基因、DHPrproB基因[gene、39卷、109-112(1984年)]等。另外，使脯氨酸合成系統(tǒng)基因或編碼來自脯氨酸反饋抑制顯著減少的脯氨酸合成系統(tǒng)酶與脯氨酸-4-羥化酶基因共同存在于質(zhì)粒等宿主中的載體上時，兩個基因既可以存在于一個質(zhì)粒上，也可以存在于其它的可能共存的質(zhì)粒上。作為可能共存的質(zhì)粒，例如有，在大腸桿菌中，大腸桿菌素E1系的質(zhì)粒(例如pBR322)和pACYC系的質(zhì)粒、大腸桿菌素E1系的質(zhì)粒和F因子系的質(zhì)粒、大腸桿菌素E1系的質(zhì)粒和R因子系的質(zhì)粒等。為了使脯氨酸合成系統(tǒng)基因在宿主中表達可以使用與上述的L-脯氨酸-4-羥化酶基因的表達同樣的方法。為了使宿主的脯氨酸分解活性缺失，用變性劑處理宿主后，例如就細(xì)菌講，可以選擇在Pro-TTC板上[ApplEnviron，Microbiol，、33卷、434-444(1977年)]形成白色菌落的。另外，在大腸桿菌等生物中通過將轉(zhuǎn)座子插入到put基因的適當(dāng)位置可以使脯氨酸的利用性喪失[Genetics、92卷、741-747(1979年)]，插入轉(zhuǎn)座子后通過耐藥性和上述的Pro-TTC板選擇，也可得到脯氨酸分解活性缺失株。還有通過P1轉(zhuǎn)導(dǎo)[AShortCourseInBacterialGenetics，ALab-oratoryManualandHandbookforEsherichiacoliandRelatedBacteri-a，J.H.Miller，ColdSpringHarborLaboratoryPress，1922，Labo-ratoryManual，pp.263]也可以將脯氨酸分解活性缺失這一特性從因轉(zhuǎn)座子造成的脯氨酸分解活性喪失株轉(zhuǎn)移到別的菌株里。如上所述利用脯氨酸生物合成系統(tǒng)的活性增強的宿主得到的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)可以按通常的方法進行。對用大腸桿菌或酵母菌等微生物作為宿主的轉(zhuǎn)化體進行培養(yǎng)的培養(yǎng)基只要是含有微生物可以利用的碳源、氮源、無機鹽類，可以有效對轉(zhuǎn)化體進行培養(yǎng)的培養(yǎng)基，無論是天然培養(yǎng)基還是合成培養(yǎng)基都可以。作為碳源只要是各種微生物可以利用的就可以，可以使用葡萄糖、半乳糖、蔗糖、含有這些糖的糖蜜、淀粉或淀粉水解物等糖、醋酸、丙酸等有機酸、乙醇、丙醇等醇類。作為氮源可以使用氨、氯化銨、硫酸銨、醋酸銨、磷酸銨等各種無機酸或有機酸的銨鹽、還有其它的含氮化合物以及胨、肉提取物、酵母提取物、玉米漿、酪蛋白水解物、大豆糟和大豆糟水解物、各種發(fā)酵菌體以及其消化物等。作為無機物可以用磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸銅、碳酸鈣等。培養(yǎng)是在振蕩培養(yǎng)或深部通氣攪拌培養(yǎng)等好氧條件下進行。培養(yǎng)溫度最好是15～40℃、培養(yǎng)時間為16～100小時。培養(yǎng)中pH保持在3.0～9.0。調(diào)整pH用無機或有機酸、堿溶液、尿素、碳酸鈣、氨等。根據(jù)培養(yǎng)中的需要，也可以在培養(yǎng)基中添加氨芐青霉素或四環(huán)素等抗生素。在培養(yǎng)以采用了誘導(dǎo)性啟動子的表達載體轉(zhuǎn)化了的微生物時，根據(jù)需要也可以在培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)物。例如，在培養(yǎng)以采用Lac啟動子的表達載體轉(zhuǎn)化的微生物時，培養(yǎng)基中可加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)等，而在培養(yǎng)以采用trp啟動子的表達載體轉(zhuǎn)化了的微生物時可向培養(yǎng)基中添加吲哚丙烯酸(IAA)。在培養(yǎng)以動物細(xì)胞為宿主的轉(zhuǎn)化體時用的培養(yǎng)基通常是RP-MI1640培養(yǎng)基、EagleMEM培養(yǎng)基或使用在這些培養(yǎng)基中添加了胎牛血清的培養(yǎng)基。培養(yǎng)是在5％CO2存在下等條件下進行的。培養(yǎng)溫度最好是35～37℃，培養(yǎng)時間通常為3～7日。另外，根據(jù)培養(yǎng)的需要培養(yǎng)基中也可添加卡那霉素、青霉素等抗生素。這樣培養(yǎng)得到的轉(zhuǎn)化體中，與帶有用作基因源的微生物菌株、例如指狀孢子囊·霉菌-RH1等和帶有pTr2-4OH的重組大腸菌比較，L-脯氨酸-4-羥化酶的生成量顯著蓄積，脯氨酸生物合成活性也高，同時反式-4-羥基-L-脯氨酸的制造可以更高效率地進行。該轉(zhuǎn)化體中L-脯氨酸-4-羥化酶的生成可通過如下步驟檢測。將培養(yǎng)物、菌體或它們的處理物加到適于酶反應(yīng)的水性介質(zhì)中，同時加入L-脯氨酸、二價鐵離子、2-酮戊二酸，根據(jù)需要添加表面活性劑或有機溶劑，檢測生成的反式-4-羥基-L-脯氨酸，就可知L-脯氨酸-4-羥化酸的生成。該酶的活性，在下述測定條件下以1分鐘生成1nmol的反式-4-羥基-L-脯氨酸的活性作為1單位(U)表示。另外，這里微生物菌體包含動物細(xì)胞稱之為菌體。L-脯氨酸-4-羥化酶活性的測定向含有12mML-脯氨酸、24mM2-酮戊二酸、4mM硫酸亞鐵和8mML-抗壞血酸的240mM的MES[2-(N-嗎啉代)乙磺酸]緩沖液(pH6.5)中添加菌體、菌體處理物或酶的標(biāo)準(zhǔn)品等，共計250μl，35℃反應(yīng)10分鐘。然后，將反應(yīng)液于100℃加熱2分鐘，使反應(yīng)停止，用高效液相色譜(以下略記為HPLC)對反應(yīng)液中生成的反式-4-羥基-L-脯氨酸進行定量分析。定量時只要是能定量反式-4-羥基-L-脯氨酸的方法即可，例如使用配體交換色譜柱，如株式會社住化分析中心制SUMICHI-RALOA5000等，用HPLC對反應(yīng)液中的反式-4-羥基-L-脯氨酸進行分離提取后，再通過7-氯-4-硝苯基-2-氧雜-1，3-二唑(以下略記為NBD)進行后柱誘導(dǎo)后再進行檢測的方法(后柱誘導(dǎo)法)，或是將反應(yīng)液中的目的化合物予先進行NBD誘導(dǎo)后再加到使用了HPLC的反相色譜分析，分離NBD誘導(dǎo)物后進行檢測的方法[WilliamJ.LindbladandRobertF.Diegelmann，AnalyticalBio-chemistry、138卷、390～395、1984年](前柱誘導(dǎo)法)等。NBD誘導(dǎo)物的檢測都是通過其熒光(激發(fā)波長503nm、熒光波長541nm)的測定進行的。如上所述，將確認(rèn)在培養(yǎng)菌體中有L-脯氨酸生成的轉(zhuǎn)化體在與上述轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)條件同樣的條件下進行培養(yǎng)，使反式-4-羥基-L-脯氨酸生成蓄積，通過從該培養(yǎng)物中獲取反式-4-羥基-L-脯氨酸，可以制造反式-4-羥基-L-脯氨酸。該培養(yǎng)過程中，也可以根據(jù)需要在培養(yǎng)基中添加2-酮戊二酸和2價鐵離子。通過本發(fā)明制造的反式-4-羥基-L-脯氨酸可以利用上述的后柱誘導(dǎo)法或前柱誘導(dǎo)法進行定量分析。實施例1L-脯氨酸-4-羥化酶高表達質(zhì)粒的構(gòu)建使用AppliedBiosystem公司制的380A.DNA合成儀合成序列號2記載的DNA和序列號3記載的DNA。該合成的DNA的3′末端25bp設(shè)計成互補的序列。該合成DNA中含有編碼來自指孢囊菌(Dactylosporangiumsp.)RH1的L-脯氨酸-4-羥化酶蛋白的N末端部分的堿基序列，但在該堿基序列中，對于來自指孢囊菌(Dactylosporangiumsp.)RH1的堿基序列實施了特定部位的堿基替換為的是使它成為最適于在大腸菌中表達的密碼。以該合成DNA作為引物和模板進行PCR。使用含有0.5UPfuDNA聚合酶(STRATAGENE公司制)、PfuDNA聚合酶用×10緩沖液(STRATAGENE公司制)2μl、DMSO2μl、2.5mMdNTP液各1μl、序列號2記載的和3號記載的合成DNA各2μM的反應(yīng)液20μl，96℃下溫育5分鐘后、然后是96℃-2分鐘、50℃-1分鐘、75℃-1分鐘的溫育過程，重復(fù)進行35次，進行PCR。反應(yīng)結(jié)束后，將該反應(yīng)液加到15％聚丙烯酰胺凝膠上(ATO株式會社制、PagelNPU-15L)，通過電泳運動，確認(rèn)107bp擴增片段的生成。使用日本Ido株式會公司制的Davinchiqun(Pentatslicabali-NB-7000型)回收該107bp擴增片段后，用HindIII和SalI切該片段的兩個末端。使用Bio，Inc.制的MERmaidKit回收HindIII-SalI切后的片段，回收液為16μl。按照參考例1記載的方法作成的質(zhì)粒pTr2-4OHDNA用BamHI和PvuII切后，將反應(yīng)液加到瓊脂糖凝膠上電泳，確認(rèn)生成了2個片段。用BioRad公司制的Prep-A-gene回收該片段內(nèi)含有L-脯氨酸羥化酶的結(jié)構(gòu)基因的長的片段，利用寶酒造公司制的Bluntingkit使其末端平滑后，再使用寶酒造公司制的連接試劑盒，使片段環(huán)化。使用已環(huán)化的質(zhì)粒，按常規(guī)方法轉(zhuǎn)化E.coliJM109，再將該轉(zhuǎn)化體涂布于含有50μg/ml的氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基后于37℃培養(yǎng)1夜。按常規(guī)方法從已生長的轉(zhuǎn)化體的菌落提取質(zhì)粒，通過限制酶消化確認(rèn)其結(jié)構(gòu)。以上結(jié)果可得到去除了pTr2-4OH的一部分序列的質(zhì)粒pTr2-4OHΔ(圖1)。用HindIII和SalI切獲得的質(zhì)粒pTr2-4OHΔDNA后，再將HindIII和SalI處理的上述PCR擴增片段使用寶酒造公司制的連接試劑合插入上述該切斷部位。使用得到的質(zhì)粒，按常規(guī)方法轉(zhuǎn)化E.coliXL1-BlueMRF′株，將該轉(zhuǎn)化體涂布于含有50μg/ml的氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上，于37℃培養(yǎng)一夜。從生長的轉(zhuǎn)化體的菌落中利用常規(guī)方法提取質(zhì)粒，得到質(zhì)粒pWFH1(圖2)。通過限制酶消化確認(rèn)該質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)。利用AppliedBiosystems公司制的堿基序列確定試劑盒(TaqDyeDeoxyTMTerminatorCycleSequencingKit)確定PCR擴增片段的插入部分。序列號1給出了該堿基序列。該質(zhì)粒，除了從結(jié)構(gòu)基因的5′末端5alI部位與來自指孢囊菌(Dactylosporangiumsp.)RH1的堿基序列有一部分不同外，而編碼與來自指孢囊菌(Dactylosporangiumsp.)RH1的L-脯氨酸-4-羥化酶完全相同的氨基酸序列的結(jié)構(gòu)基因DNA片段具有被插入到與Ptrpx2轉(zhuǎn)錄方向同方向的結(jié)構(gòu)(圖2)。如表1所示那樣，帶有pWFH1的轉(zhuǎn)化體與用作基因源的指孢囊菌(Dactylosporangiumsp.)RH1株比較，生產(chǎn)L-脯氨酸羥化酶的效率高1400倍，而與帶有pTr2-4OH的轉(zhuǎn)化體比較，高約5.4倍。表1<tablesid="table1"num="001"><tablewidth="682">菌株菌體活性1)相對活性2)指孢囊菌RH13)0.0281.0E.coliATCC12435/pTr2-4OH4)3.7132E.coliATCC12435/pWFH14)401400</table></tables>1)菌體活性用每1mg濕菌體的酶活性(U/mgwetcells)表示。1U作為每1分鐘生成1nmol的反式-4-羥基-L-脯氨酸的酶活性。2)相對活性是以指孢囊菌(Dactylosporangiumsp.)RH1株生產(chǎn)的酶活性為1表示的。3)是從參考例2記載的反式-4-羥基-L-脯氨酸的生成量算出的菌體活性。4)從實施例8記載的反式-4-羥基-L-脯氨酸的生成量算出的菌體活性。實施例2脯氨酸分解系統(tǒng)缺損株的制作用以下方法破壞參與E.ColiATCC12435的脯氨酸分解的基因putA，造成脯氨酸分解系統(tǒng)缺損株。將國立遺傳學(xué)研究所保存的菌株E.coliME8395株[F-pyrD34trp-45his-68thyA25thideoR33galK35xyl-7mtl-2malA1rpsL118λR(λ)-appAlputA∷Tn5(Mu+)]接種到含有35μg/ml的卡那霉素的LB培養(yǎng)基上，過夜培養(yǎng)。向100μl該培養(yǎng)液中添加P1噬菌體液100μl，混合后放置5分鐘。將該放置液與含有10mMCaCl2的3ml的LB軟瓊脂培養(yǎng)基混合，輔在含有10mMCaCl2的LB瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)7小時。培養(yǎng)后將得到的瓊脂培養(yǎng)基表面的溶菌產(chǎn)物回收到含有10mMCaCl2的2mlLB培養(yǎng)基中。向該回收液中加入0.5ml氯仿，用旋渦混合器混合后，3000rpm離心15分鐘，離心的上清用作P1噬菌體溶菌產(chǎn)物。將該P1噬菌體溶菌產(chǎn)物50μl和在含有10mMCaCl的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)的E.coliATCC12435培養(yǎng)液100μl混合，于37℃靜置20分鐘。將該靜置液與3mlF-top-citrate(F-top-citrateNaCl8.5g/l、檸檬酸二鈉100mM、瓊脂0.7％)混合，涂布于含有35μl/ml的卡那霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)1天。將通過該培養(yǎng)生長的耐卡那霉素株懸浮于0.85％NaCl中，涂布于Pro-TTC板上(K2HPO47g/l、KH2PO43g/l，MgSO40.1g/l、胨2g/1、2，3，5-三苯四唑氯化物0.025g/l、L-Pro2g/l、瓊脂15g/l、pH7.2)，37℃下培養(yǎng)1～2天。通過這樣培養(yǎng)將Pro-TTC板上形成白色菌落的菌株選擇作為喪失分解消化脯氨酸能力的菌株，獲得脯氨酸分解活性缺損株E.coliWT1株。該菌株于平成8年8月7日以FERMBP-5618保藏于工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所，日本國茨城縣筑波市東1丁目1番3號(郵編號305)。實施例3脯氨酸生物合成系統(tǒng)基因proB74和proA表達質(zhì)粒的構(gòu)建通過以下方法將編碼來自大腸菌的γ-谷氨酰激酶的proB基因變換成對脯氮酸的反饋抑制脫敏的變異型基因proB74基因和構(gòu)建編碼來自大腸菌的γ-磷酸谷氨酰還原酶的proA基因的表達載體pPF1。將來自大腸桿菌的含有proB和proA基因的質(zhì)粒pPRO-1[從大腸桿菌K83株(FERMBP-2807)獲得]用EcoRV消化，瓊脂糖凝膠電泳后，利用Prep-A-geneDNAPurificationSystem(BIO-RAD公司制)獲得含有proB基因的一部分約1kb的DNA片段。將該DNA片段與pUC19(寶酒造公司制)的SmaI消化產(chǎn)物連接，得到質(zhì)粒pBAB51(圖3)。通過以下方法將該質(zhì)粒中的proB基因變換成眾所周知的[A.M.DandekarandS.L.Uratsu，J.Bacteri01.170，5943(1988)]的對來自脯氨酸的反饋抑制脫敏的變異型基因proB74。使用AppliedBiosystems公司制的380A·DNA合成儀合成了序列號4給出的寡核苷酸A1和序列號5給出的寡核苷酸A2。以寡核苷酸A1和M13引物M3(寶酒造公司制、目錄號No.3831)作為一組引物，以pBAB51作為模板，通過PCR方法擴增變異型的proB基因proB74基因的部分序列。PCR反應(yīng)級為含有0.1μgpBAB51、寡核苷酸A1和M13引物M3各2μM、1U的TaqDNA聚合酶(寶酒造公司制)、1.6μldNTP混合物(寶酒造公司制、目錄號No.4030)、2μl附加的緩沖液共20μl反應(yīng)液，反應(yīng)過程為94℃-30秒鐘、52℃-30秒、72℃-1分鐘的溫育過程，重復(fù)進行30循環(huán)，最后于72℃溫育5分鐘。利用同樣的方法，以寡核苷酸A2和M13引物RV(寶酒造公司制、目錄No.3830A)作為一組引物，以pBAB51為模板，通過PCR擴增變異型proB基因的部分序列。將PCR擴增的該2種DNA分別進行瓊脂糖凝膠電泳，使用Prep-A-geneDNAPurificationSystem(BIO-RAD公司制)精制。將該2種精制的DNA片段混合后作為模板，用M13引物M3和M13引物RV作為引物，利用與上述同樣的方法，進行PCR和精制，得到含有proB74基因的堿基序列大約1kb的DNA片段。將該DNA片段用Eco0651和SacII消化，得到Eco0651-SacII消化片段。將該消化片段與pPRO-1的Eco-0651-SacII消化DNA片段(約6.8kbp)連接，作成將pPRO-1的proB基因變換成脫敏型proB74基因的質(zhì)粒pPRO74(圖4)。使用AppliedBiosystems公司制380A·DNA合成儀合成序列號6給出的寡核苷酸p1和序列號7給出的寡核苷酸p2。以p1、p2作引物，用質(zhì)粒pPRO74作模板，通過PCR擴增proB74和proA基因。PCR反應(yīng)液20μl其中含有0.1μgpPRO74、p1、p2各2μM、TaKaRaExTaq1U(寶酒造公司制、目錄RR001Q)、1.6μldNTP混合液(寶酒造公司制，目錄號No.4030)，反應(yīng)過程94℃-1分鐘、42℃-2分鐘、72℃-3分鐘溫育，重復(fù)進行30循環(huán)。將該反應(yīng)液進行瓊脂糖凝膠電泳，利用常規(guī)方法提取含有proB74和proA的2370bp的擴增片段，使用GENECLEANIIKIT(BIO101，INC.制)回收該DNA片段。用HindIII和BamHI切回收的2370bpDNA片段，通過乙醇沉淀法得乙醇沉淀。將該沉淀溶解于5μl的TE中，用作proB74和proA片段。使用寶酒造公司制的DNA連接試劑盒將proB74和proA片段與質(zhì)粒pSTV29(寶酒造公司制)的HindIII-BamHI消化的DNA片段連接起來，構(gòu)建成插入了proB74和proA片段的質(zhì)粒。通過常規(guī)方法用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliJM109菌株，然后涂布于含有30μg/ml的氯霉素、0.1mMIPTG、40μg/ml的X-Gal的瓊脂培養(yǎng)基上，于37℃培養(yǎng)過夜。通過培養(yǎng)形成白色菌落的菌株按常規(guī)方法提取質(zhì)粒，通過限制酶消化確認(rèn)該質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)。利用上述方法，可以獲得編碼在脫敏型r-glutamylkinase的N末端結(jié)合了β-半乳糖苷酶的α片段的N末端8個氨基酸殘基(lacZ.Nterm)的融合蛋白的基因和proA基因存在于Plac控制下的質(zhì)粒pPF1(圖5)。序列號8給出了該融合蛋白的結(jié)構(gòu)基因(lacZ.Nterm-proB74)的堿基序列和氨基酸序列。實施例4通過含有脯氨酸生物合成系統(tǒng)基因表達質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體生產(chǎn)反式-4-羥基-L-脯氨酸使用實施例3構(gòu)建的質(zhì)粒pPF1轉(zhuǎn)化實施例2得到的E.coliWT1株，得到轉(zhuǎn)化株E.coliWT1/pPF1。用實施例1構(gòu)建的脯氨酸-4-羥化酶表達質(zhì)粒pWFH1轉(zhuǎn)化實施例2得到的WT1菌株，得到E.coliWT1/pWFH1。從該轉(zhuǎn)化株E.coliWT1/pWFH1，利用氯化鈣方法制作感受態(tài)細(xì)胞，然后導(dǎo)入到實施例3制作的質(zhì)粒pPF1中，將帶有兩個質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化株E.coliWT1/pWFH1/pPF1于含有30μg/ml的氯霉素和50μg/ml的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)，通過選擇生長出的菌落獲得目的轉(zhuǎn)化株。將WT1、WT1/pPF1、WT1/pWFH1和WT1/pWFH1/pPF1分別于含有卡那霉素37.5μg/ml、氨芐青霉素100μg/ml、氯霉素30μg/ml的LB培養(yǎng)基，然后再于含有氨芐青霉素100μg/ml和氯霉素30μg/ml的LB培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)16小時。分別取培養(yǎng)液各100μl移入加了2％(W/V)的碳酸鈣的10ml的Med7培養(yǎng)基(葡萄糖2％、硫酸銨1％、K2HPO40.1％、NaCl0.2％、MgSO40.05％、FeSO40.0278％、CaCl20.0015％、胨0.8％)的粗試管(Φ20×200mm)中，30℃下培養(yǎng)24小時。表2給出了培養(yǎng)上清中的L-脯氨酸和反式-4-羥基-L-脯氨酸的含量。表2</tables>能夠確認(rèn)在帶有脯氨酸生物合成系統(tǒng)基因表達質(zhì)粒pPF1菌株中，L-脯氨酸的生成顯著增加，而L-脯氨酸-4-羥化酶表達質(zhì)粒pWFH1和脯氨酸生物合成系統(tǒng)基因表達質(zhì)粒pPF1的共存的轉(zhuǎn)化體與單獨帶有L-脯氨酸-4-羥化酶表達質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體相比，反式-4-羥基-L-脯氨酸的生成量顯著增加。實施例5L-脯氨酸-4-羥化酶和脯氨酸生物合成系統(tǒng)基因proB74和proA表達質(zhì)粒的構(gòu)建將來自指孢囊菌(Dactylosporangiumsp.)RH1的L-脯氨酸-4-羥化酶基因、脯氨酸生物合成系統(tǒng)基因proB74和ProA的全部基因都保持在單一的質(zhì)粒上，通過以下方法構(gòu)建能使這一質(zhì)粒表達的表達質(zhì)粒pWFP1。以實施例1作成的pWFH1作模板，利用PCR擴增L-脯氨酸-4-羥化酶的結(jié)構(gòu)基因。PCR反應(yīng)液20μl，其中含有0.1μgpWFH1質(zhì)粒、0.5UPfuDNA聚合酶(Stratagene公司制)、2μlPfuDNA聚合酶用×10緩沖液(Stratagene公司制)、2μlDMSO、各種2.5mMdNTP液1μl、序列號9記載的和序列號10記載的合成DNA各2μM，將反應(yīng)液于96℃溫育5分鐘后、按96℃-2分鐘、58℃-1分鐘、75℃-3分鐘溫育過程重復(fù)進行30次循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，將該反應(yīng)液進行瓊脂糖凝膠電泳，利用常規(guī)方法提取含有L-脯氨酸-4-羥化酶基因的大約800bp的擴增片段，使用GENCLEANIIKIT(BIO101，INC.制)回收該DNA片段。該回收DNA片段用HindIII和EcoRI切后，進行瓊脂糖凝膠電泳，使用GENCLEANIIKIT(BIO101，INC.制)回收帶有L-脯氨酸-4-羥化酶基因的HindIII-EcoRI切的DNA片段。將該L-脯氨酸-4-羥化酶基因片段與質(zhì)粒pBluescriptIIKS(+)(Stratagene公司制)的HindIII-EcoRI消化DNA片段通過寶酒造公司制DNA連接試劑盒連接起來，構(gòu)建成插入了L-脯氨酸-4-羥化酶片段的質(zhì)粒pB11-4OH(圖6)。以實施例3作成的pPRO74作模板，通過PCR擴增proB74和proA基因。PCR反應(yīng)液共20μl，其中含有0.1μgpPRO74質(zhì)粒、TakaraExTaq(寶酒造公司制，codeRR001Q)1U、TakaraExTaq用×10緩沖液(寶酒造公司制)2μl、2.5mMdNTP液1.6μl、序列號11和12記載的合成DNA各2μM，按94°-1分鐘、42℃-2分鐘、75℃-3分鐘的溫育過程，重復(fù)進行30次循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，對該反應(yīng)液進行瓊脂糖凝膠電泳，利用常規(guī)方法提取含有proB74和proA基因的大約2.3Kbp的擴增片段，使用GENECLEANIIKIT(BIO101，INC.制)回收該DNA片段?；厥盏腄NA片段用BamHI和EcoRI切后進行苯酚/氯仿處理、乙醇沉淀，回收該DNA片段。將含有proB74和proA基因的DNA片段與上述質(zhì)粒pBII-4OH的HindIII-EcoRI消化DNA片段使用寶酒造公司制的DNA連接試劑盒連結(jié)起來，構(gòu)建含有L-脯氨酸-4-羥化酶基因、proB74和ProA的質(zhì)粒pBII-4OHBA(圖7)。用HindIII和BamHI消化質(zhì)粒pB11-40HBA，進行瓊脂糖凝膠電泳，獲得有L-脯氨酸-4-羥化酶基因、proB74和proA大約3.16Kbp的DNA片段。同時用HindIII和BamHI消化實施例1作成的pWFH1，瓊脂糖凝膠電泳后獲得不含L-脯氨酸-4-羥化酶基因，而含有復(fù)制起點的大約2.6Kbp的DNA片段。用寶酒造公司制的DNA連接試劑盒連結(jié)得到的2個DNA片段。構(gòu)建在色氨酸串聯(lián)啟動子作用下能使L-脯氨酸-4-羥化酶、proB74蛋白質(zhì)、proA蛋白質(zhì)表達的質(zhì)粒pWFP1(圖8)。實施例6利用轉(zhuǎn)化體E.coliWT1/pWFH1/pPF1和E.coliWT1/pWFP1生產(chǎn)反式-4-羥基-L-脯氨酸將轉(zhuǎn)化株WT1/pWFH1/pPF1株于含有氨芐青霉素100μg/ml和氯霉素30μg/ml的50mlMed4G培養(yǎng)基[葡萄糖2％、蛋白胨1％(日本制藥公司制)、酵母提取物0.5％(Difco公司制)、1％NaCl、2％碳酸鈣、pH7.0]，而轉(zhuǎn)化株WT1/pWFP1株于含有氨芐青霉素100μg/ml的50mlMed4G培養(yǎng)基中，分別接種后于30℃振蕩培養(yǎng)16小時。以該培養(yǎng)液作為種子培養(yǎng)液，分別接種于加了2升Med7培養(yǎng)基的5升發(fā)酵罐中，在培養(yǎng)WT1/pWFH1/pPF1株時要添加100μg/ml的氨芐青霉素和30μg/ml氯霉素，而在培養(yǎng)WT1/pWFP1株時，要再添加100μg/ml氨芐青霉素，培養(yǎng)溫度為30℃，攪拌數(shù)為400轉(zhuǎn)/分，通氣量1升/1升培養(yǎng)液/分。同時，在培養(yǎng)WT1/pWFH1/pPF1時，于培養(yǎng)的第8小時添加IPTG使其濃度為0.2mM。另外，兩種菌株在培養(yǎng)到第24小時時都添加抗生素，添加的種類和濃度與開始時加的一樣。培養(yǎng)中適時地向培養(yǎng)液中添加葡萄糖使其濃度大約為1％，使用NH4OH將pH控制在pH6.5下限。而培養(yǎng)5小時以后通過使攪拌數(shù)變化于250～700rpm，將培養(yǎng)液的溶存氧濃度控制在培養(yǎng)開始時的1/15。培養(yǎng)了99小時后，將該培養(yǎng)液離心分離，定量測定離心上清中生成蓄積的反式-4-羥基-L-脯氨酸含量，WT1/pWFH1/pPF1株為156mM(20.5g/l)，WT1/pWFP1株有191mM(25.0g/l)。實施例7利用含有L-脯氨酸-4-羥化酶基因和脯氨酸生物合成系統(tǒng)基因表達質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體生產(chǎn)反式-4-羥基-L-脯氨酸用實施例5構(gòu)建的質(zhì)粒pWFP1轉(zhuǎn)化實施例2獲得的E.coliWT1株，得到轉(zhuǎn)化株E.coliWT1/pWFP1。將WT1/pWFP1于含有氨芐青霉素100μg/ml的LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)16小時。將該培養(yǎng)液100μl接種于裝有2％(W/V)碳酸鈣的10mlMed7培養(yǎng)基的粗試管(Φ20×200mm)中，于30℃培養(yǎng)24小時。該培養(yǎng)上清中的L-脯氨酸是0.56g/l，反式-4-羥基-L-脯氨酸為2.4g/l。實施例8利用轉(zhuǎn)化體菌株生產(chǎn)反式-4-羥基-L-脯氨酸將轉(zhuǎn)化體E.coliATCC12435/pTr2-OH接種于含有50μg/ml的氨芐青霉素的3mlLB培養(yǎng)基中，30℃，振蕩培養(yǎng)一夜，將該培養(yǎng)液離心分離，得E.coliATCC12435/pTr2-4OH的濕菌體。將轉(zhuǎn)化體E.coliATCC12435/pWFH1接種于含有100μg/ml的氨芐青霉素的100mlMed4培養(yǎng)基[蛋白胨(日本制藥)1％、酵母提取物(Difco)0.5％、NaCl1％]中，于30℃振蕩培養(yǎng)16小時。將該培養(yǎng)液接種于加了2升Med7培養(yǎng)基(葡萄糖2％、硫酸銨1％、K2HPO40.1％、NaCl0.2％、MgSO40.05％、FeSO40.0278％、CaCl20.0015％，胨0.4％)的5升發(fā)酵罐中，然后再加入200mML-Pro，培養(yǎng)溫度33℃，通氣量為1升/1升培養(yǎng)液/分，在這樣條件下，培養(yǎng)48小時。溶存氧濃度達到初期值的1/15時，以攪拌數(shù)400轉(zhuǎn)/分作為基準(zhǔn)，700轉(zhuǎn)/分作為上限，通過改變攪拌數(shù)，將溶存氧的濃度控制在初期值的1/15。培養(yǎng)中，為了使L-脯氨酸維持在大約50mM要適時地添加葡萄糖，保證葡萄糖的供給，使用NH4OH，將pH控制在下限6.5。通過培養(yǎng)得到的培養(yǎng)液離心分離，得到E.coliATCC12435/pTr2-4OH和E.coliATCC12435/pWFH1的濕菌體。該兩菌株的濕菌體，根據(jù)需要可以于-20℃冷凍保存，使用時解凍后用。向反應(yīng)液250μl[240mM的MES緩沖液(pH6.5)中含有12mML-脯氨酸、24mM2-酮戊二酸、4mM硫酸亞鐵和8mML-抗壞血酸]加入濕菌體使其最終的濃度為4％(W/V)，35℃反應(yīng)10分鐘。將反應(yīng)液于100℃加熱2分鐘，終止反應(yīng)。將該反應(yīng)液離心分離，定量測定上清中的反式-4-羥基-L-脯氨酸含量，結(jié)果E.coliATCC12435/pTr2-4OH株生成了3mM/l，E.coliATCC12435/pWFH1株生成了16mM/l。相對于L-脯氨酸-4-羥化酶的菌體活性分別為7.5和40U/mg.wetcells。參考例1L-脯氨酸-4-羥化酶表達質(zhì)粒的構(gòu)建使用AppliedBiosystems公司制的380A·DNA合成儀合成序列號13記載的有意義鏈DNA引物和序列號14記載的反意義鏈DNA引物。以該合成的DNA作為引物，用pRH71[通過常規(guī)方法從含有該質(zhì)粒的EscherichiaColiSOLR/pRH71(FERMBP-5025)得到]作模板，進行PCR。PCR反應(yīng)液為20μl，其中含有0.1μgpRH71、有意義鏈和反意義鏈DNA引物各2μM、PfuDNA聚合酶(STRATAGENE公司制)0.125U/μl、DMSO10％、Tris.HCl(pH8.2)20mM、KCl10mM、硫酸銨6mM、氯化鎂2mM、TritonX-1000.1％、BovineSerumAlbu-mine10ng/μl。于96℃溫育5分鐘后，按96℃-2分鐘、58℃-1分鐘、75℃-1分鐘溫育過程，重復(fù)進行30次循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，將該反應(yīng)液進行瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)生成了編碼L-脯氨酸-4-羥化酶的結(jié)構(gòu)基因844bp的擴增片段。利用常規(guī)方法從瓊脂糖凝膠中提取844bp的擴增片段，使用Bio-Rad公司制的Prep-A-gene回收該片段?；厥盏?44bp的DNA片段的兩末端用HindIII和BamHI切，通過乙醇沉淀法，得乙醇沉淀。將該沉淀溶于5μl的TE中。以pBR322作為基本組件，將帶有2個串聯(lián)Ptrp啟動子Ptrp×2的質(zhì)粒pKYP200[Agric.Biol.Chem.48卷，669～675(1984年)]和合成連接體組合制作成ATG載體pTrS32[從E.coliJM109/pTrS32(FERMBP-5408)制備]，然后用HindIII和BamHI切。在該切斷部位，使用寶酒造公司制連接試劑盒插入用HindIII和BamHI切斷處理的上述L-脯氨酸-4-羥化酶結(jié)構(gòu)基因片段。使用得到的質(zhì)粒，按常規(guī)方法轉(zhuǎn)化E.coliXL1-BlueMRF’株，將該轉(zhuǎn)化體涂布于含有50μg/ml的氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過夜。從生長的轉(zhuǎn)化體菌落按常規(guī)方法提取質(zhì)粒，通過限制酶消化確認(rèn)其結(jié)構(gòu)。使用AppliedBiosystems公司制堿基序列確立試劑盒(TaqDyeDeoxyTMTerminatorCycleSequencingKit)確定結(jié)構(gòu)基因部分的堿基序列，證明是序列號15給出的堿基序列。利用該方法得到了插入了編碼與Ptrp×2的轉(zhuǎn)錄方向同方向的L-脯氨酸-4-羥化酶的結(jié)構(gòu)基因的DNA片段的質(zhì)粒pTr2-4OH(圖9)。參考例2利用指孢囊菌(Dactylosporagiumsp)菌體生產(chǎn)反式-4-羥基-L-脯氨酸將SR3培養(yǎng)基(含有葡萄糖1.0％、可溶性淀粉1.0％、酵母提取液0.5％、胰蛋白胨0.5％、肉提取物0.3％和磷酸鎂0.05％，用6NNaOH將pH調(diào)至7.2)分裝于試管中，每管10ml，然后于120℃，滅菌20分鐘。將于HT瓊脂平板培養(yǎng)基培養(yǎng)的指孢囊菌RH1用一鉑制小勺接種于上述培養(yǎng)基中，于28℃振蕩培養(yǎng)2天，作種子培養(yǎng)液用。將Df1培養(yǎng)基(含有可溶性淀粉5％、大豆研磨物1.5％、磷酸二氫鉀0.05％、硫酸鎂·7H2O0.05％和碳酸鈣0.5％，用6NNaOH將pH調(diào)至7.0)分裝于試管中，每管10ml，于120℃滅菌20分鐘。滅菌操作下將上述種子培養(yǎng)液1ml接種于該培養(yǎng)基中，于28℃振蕩培養(yǎng)2天。將所得培養(yǎng)液于8000rpm、4℃下離心10分鐘，得菌體。該菌體用80mMTES[N-三(羥甲基)甲基-2-氨基乙磺酸]緩沖液(pH7，5)洗凈后，離心分離，得濕菌體。將該濕菌體150mg懸浮于1.5ml的反應(yīng)液[向含有4mML-脯氨酸、8mMα-酮戊二酸、4mML-抗壞血酸、2mM硫酸亞鐵的80mMTES緩沖液(pH7.5)中添加1.4％(V/V)的奈敏(ナイミン)溶液(奈敏S-215(日本油脂株式會公司制)4g溶解于二甲苯10ml中)]，于30℃反應(yīng)30分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，將該反應(yīng)液離心分離，對得到的上清中的反式-4-羥基-L-脯氨酸含量進行定量測定的結(jié)果是有84μmol/l反式-4-羥基-L-脯氨酸生成。該菌株相對于L-脯氨酸-4-羥化酶的菌體活性是0.028U/mg，wetcells。根據(jù)本發(fā)明，可以提供工業(yè)上制造作為醫(yī)藥品的合成原料或食品添加劑有用的反式-4-羥基-L-脯氨酸的方法，可以提供用于該方法中的含有L-脯氨酸-4-羥化酶基因而且可使脯氨酸合成系統(tǒng)活性增強的轉(zhuǎn)化體。序列表序列號1序列長度816序列類型核酸鏈數(shù)二條鏈拓?fù)湫椭辨湢钚蛄蟹N類其他的核酸序列ATGCTGACCCCGACCGAACTGAAACAGTATCGTGAAGCGGGCTATCTG48MetLeuThrProThrGluLeuLysGlnTyrArgGluAlaGlyTyrLeu151015CTGATTGAAGATGGCCTGGGCCCGCGTGAAGTCGACTGCCTGCGCCGG96LeuIleGluAspGlyLeuGlyProArgGluValAspCysLeuArgArg202530GCGGCGGCGGCCCTCTACGCGCAGGACTCGCCGGACCGCACGCTGGAG144AlaAlaAlaAlaLeuTyrAlaGlnAspSerProAspArgThrLeuGlu354045AAGGACGGCCGCACCGTGCGCGCGGTCCACGGCTGCCACCGGCGCGAC192LysAspGlyArgThrValArgAlaValHisGlyCysHisArgArgAsp505560CCGGTCTGCCGCGACCTGGTCCGCCACCCGCGCCTGCTGGGCCCGGCG240ProValCysArgAspLeuValArgHisProArgLeuLeuGlyProAla65707580ATGCAGATCCTGTCCGGCGACGTGTACGTCCACCAGTTCAAGATCAAC288MetGlnIleLeuSerGlyAspValTyrValHisGlnPheLysIleAsn859095GCGAAGGCCCCGATGACCGGCGATGTCTGGCCGTGGCACCAGGACTAC336AlaLysAlaProMetThrGlyAspValTrpProTrpHisGlnAspTyr100105110ATCTTCTGGGCCCGAGAGGACGGCATGGACCGTCCGCACGTGGTCAAC384IlePheTrpAlaArgGluAspGlyMetAspArgProHisValValAsn115120125GTCGCGGTCCTGCTCGACGAGGCCACCCACCTCAACGGGCCGCTGTTG432ValAlaValLeuLeuAspGluAlaThrHisLeuAsnGlyProLeuLeu130135140TTCGTGCCGGGCACCCACGAGCTGGGCCTCATCGACGTGGAGCGCCGC480PheValProGlyThrHisGluLeuGlyLeuIleAspValGluArgArg145150155160GCGCCGGCCGGCGACGGCGACGCGCAGTGGCTGCCGCAGCTCAGCGCC528AlaProAlaGlyAspGlyAspAlaGlnTrpLeuProGlnLeuSerAla165170175GACCTCGACTACGCCATCGACGCCGACCTGCTGGCCCGGCTGACGGCC576AspLeuAspTyrAlaIleAspAlaAspLeuLeuAlaArgLeuThrAla180185190GGGCGGGGCATCGAGTCGGCCACCGGCCCGGCGGGCTCGATCCTGCTG624GlyArgGlyIleGluSerAlaThrGlyProAlaGlySerIleLeuLeu195200205TTCGACTCCCGGATCGTGCACGGCTCGGGCACGAACATGTCGCCGCAC672PheAspSerArgIleValHisGlySerGlyThrAsnMetSerProHis210215220CCGCGCGGCGTCGTCCTGGTCACCTACAACCGCACCGACAACGCCCTG720ProArgGlyValValLeuValThrTyrAsnArgThrAspAsnAlaLeu225230235240CCGGCGCAGGCCGCTCCGCGCCCGGAGTTCCTGGCCGCCCGCGACGCC768ProAlaGlnAlaAlaProArgProGluPheLeuAlaAlaArgAspAla245250255ACCCCGCTGGTGCCGCTGCCCGCGGGCTTCGCGCTGGCCCAGCCCGTC816ThrProLeuValProLeuProAlaGlyPheAlaLeuAlaGlnProVal序列號2序列長度64序列類型核酸拓?fù)湫鸵粭l鏈序列種類其他的核酸、合成DNA序列TGAGGAAAGCTTATGCTGACCCCGACCGAACTGAAACAGTATCGTGAAGC50GGGCTATCTGCTGA64序列號3序列長度66序列類型核酸拓?fù)湫鸵粭l鏈序列種類其他的核酸、合成DNA序列CCGGAATTCGTCGACTTCACGCGGGCCCAGGCCATCTTCAATCAGCAGAT50AGCCCGCTTCACGATA66序列號4序列長度22序列類型核酸拓?fù)湫鸵粭l鏈序列種類其他的核酸、合成DNA序列GACCCGTGCTAATATGGAAGAC22序列號5序列長度22序列類型核酸拓?fù)湫鸵粭l鏈序列種類其他的核酸、合成DNA序列GTCTTCCATATTAGCACGGGTC22序列號6序列長度33序列類型核酸拓?fù)湫鸵粭l鏈序列種類其他的核酸、合成DNA序列GGCAAAGCTTCATGAGTGACAGCCAGACGCTGG33序列號7序列長度33序列類型核酸拓?fù)湫鸵粭l鏈序列種類其他的核酸、合成DNA序列TTTGCAGGATCCGGTTTTATTTACGCACGAATG33序列號8序列長度1125序列類型核酸鏈數(shù)二條鏈拓?fù)湫椭辨湢钚蛄蟹N類其他的核酸序列ATGACCATGATTACGCCAAGCTTCATGAGTGACAGCCAGACGCTGGTG48MetThrMetIleThrProSerPheMetSerAspSerGlnThrLeuVal151015GTAAAACTCGGCACCAGTGTGCTAACAGGCGGATCGCGCCGTCTGAAC96ValLysLeuGlyThrSerValLeuThrGlyGlySerArgArgLeuAsn202530CGTGCCCATATCGTTGAACTTGTTCGCCAGTGCGCGCAGTTACATGCC144ArgAlaHisIleValGluLeuValArgGlnCysAlaGlnLeuHisAla354045GCCGGGCATCGGATTGTTATTGTGACGTCGGGCGCGATCGCCGCCGGA192AlaGlyHisArgIleValIleValThrSerGlyAlaIleAlaAlaGly505560CGTGAGCACCTGGGTTACCCGGAACTGCCAGCGACCATCGCCTCGAAA240ArgGluHisLeuGlyTyrProGluLeuProAlaThrIleAlaSerLys65707580CAACTGCTGGCGGCGGTAGGGCAGAGTCGACTGATTCAACTGTGGGAA288GlnLeuLeuAlaAlaValGlyGlnSerArgLeuIleGlnLeuTrpGlu859095CAGCTGTTTTCGATTTATGGCATTCACGTCGGGCAAATGCTGCTGACC336GlnLeuPheSerIleTyrGlyIleHisValGlyGlnMetLeuLeuThr100105110CGTGCTAATATGGAAGACCGTGAACGCTTCCTGAACGCCCGCGACACC384ArgAlaAsnMetGluAspArgGluArgPheLeuAsnAlaArgAspThr115120125CTGCGAGCGTTGCTCGATAACAATATCGTTCCGGTAATCAATGAGAAC432LeuArgAlaLeuLeuAspAsnAsnIleValProValIleAsnGluAsn130135140GATGCTGTCGCTACGGCAGCGATTAAGGTCGGCGATAACGATAACCTT480AspAlaValAlaThrAlaAlaIleLysValGlyAspAsnAspAsnLeu145150155160TCTGCGCTGGCGGCGATTCTTGCGGGTGCCGATAAACTGTTGCTGCTG528SerAlaLeuAlaAlaIleLeuAlaGlyAlaAspLysLeuLeuLeuLeu165170175ACCGATCAAAAAGGTTTGTATACCGCTGACCCGCGCAGCAATCCGCAG576ThrAspGlnLysGlyLeuTyrThrAlaAspProArgSerAsnProGln180185190GCAGAACTGATTAAAGATGTTTACGGCATTGATGACGCACTGCGCGCG624AlaGluLeuIleLysAspValTyrGlyIleAspAspAlaLeuArgAla195200205ATTGCCGGTGACAGCGTTTCAGGCCTCGGAACTGGCGGCATGAGTACC672IleAlaGlyAspSerValSerGlyLeuGlyThrGlyGlyMetSerThr210215220AAATTGCAGGCCGCTGACGTGGCTTGCCGTGCGGGTATCGACACCATT720LysLeuGlnAlaAlaAspValAlaCysArgAlaGlyIleAspThrIle225230235240ATTGCCGCGGGCAGCAAGCCGGGCGTTATTGGTGATGTGATGGAAGGC768IleAlaAlaGlySerLysProGlyValIleGlyAspValMetGluGly245250255ATTTCCGTCGGTACGCTGTTCCATGCCCAGGCGACTCCGCTTGAAAAC816IleSerValGlyThrLeuPheHisAlaGlnAlaThrProLeuGluAsn260265270CGTAAACGCTGGATTTTCGGTGCGCCGCCGGCGGGTGAAATCACGGTA864ArgLysArgTrpIlePheGlyAlaProProAlaGlyGluIleThrVal275280285GATGAAGGGGCAACTGCCGCCATTCTGGAACGCGGCAGCTCCCTGTTG912AspGluGlyAlaThrAlaAlaIleLeuGluArgGlySerSerLeuLeu290295300CCGAAAGGCATTAAAAGCGTGACTGGCAATTTCTCGCGTGGTGAAGTC960ProLysGlyIleLysSerValThrGlyAsnPheSerArgGlyGluVal305310315320ATCCGCATTTGCAACCTCGAAGGCCGCGATATCGCCCACGGCGTCAGT1008IleArgIleCysAsnLeuGluGlyArgAspIleAlaHisGlyValSer325330335CGTTACAACAGCGATGCATTACGCCGTATTGCCGGACACCACTCGCAA1056ArgTyrAsnSerAspAlaLeuArgArgIleAlaGlyHisHisSerGln340345350GAAATTGATGCAATACTGGGATATGAATACGGCCCGGTTGCCGTTCAC1104GluIleAspAlaIleLeuGlyTyrGluTyrGlyProValAlaValHis355360365CGTGATGACATGATTACCCGT1125ArgAspAspMetIleThrArg370375序列號9序列長度37序列類型核酸拓?fù)湫鸵粭l鏈序列種類其他的核酸、合成DNA序列TATCGATAAGCTTATGCTGACCCCGACCGAACTGAAA37序列號10序列長度33序列類型核酸拓?fù)湫鸵粭l鏈序列種類其他的核酸、合成DNA序列GGCAGAATTCTAGACGGGCTGGGCCAGCGCGAA33序列號11序列長度38序列類型核酸拓?fù)湫鸵粭l鏈序列種類其他的核酸、合成DNA序列AAAATTGAATTCCAGAGAATCATGAGTGACAGCCAGAC38序列號12序列長度36序列類型核酸拓?fù)湫鸵粭l鏈序列種類其他的核酸、合成DNA序列ACCCGGATCCATTTACGCACGAATGGTGTAATCACC36序列號13序列長度37序列類型核酸拓?fù)湫鸵粭l鏈序列種類其他的核酸、合成DNA序列GTGAGGAAAGCTTATGCTGACCCCGACGGAGCTCAAG37序列號14序列長度36序列類型核酸拓?fù)湫鸵粭l鏈序列種類其他的核酸、合成DNA序列GCCTGCGGGATCCTAGACGGGCTGGGCCAGCGCGAA36序列號15序列長度816序列類型核酸鏈數(shù)二條鏈拓?fù)湫椭辨湢钚蛄蟹N類GenomicDNA起源生物名指孢囊菌種(Dactylosporangiumsp.)株名RH1確定特征的方法E序列ATGCTGACCCCGACGGAGCTCAAGCAGTACCGCGAGGCGGGCTATCTGCTCATCGAGGAC60GGCCTCGGCCCGCGGGAGGTCGACTGCCTGCGCCGGGCGGCGGCGGCCCTCTACGCGCAG120GACTCGCCGGACCGCACGCTGGAGAAGGACGGCCGCACCGTGCGCGCGGTCCACGGCTGC180CACCGGCGCGACCCGGTCTGCCGCGACCTGGTCCGCCACCCGCGCCTGCTGGGCCCGGCG240ATGCAGATCCTGTCCGGCGACGTGTACGTCCACCAGTTCAAGATCAACGCGAAGGCCCCG300ATGACCGGCGATGTCTGGCCGTGGCACCAGGACTACATCTTCTGGGCCCGAGAGGACGGC360ATGGACCGTCCGCACGTGGTCAACGTCGCGGTCCTGCTCGACGAGGCCACCCACCTCAAC420GGGCCGCTGTTGTTCGTGCCGGGCACCCACGAGCTGGGCCTCATCGACGTGGAGCGCCGC480GCGCCGGCCGGCGACGGCGACGCGCAGTGGCTGCCGCAGCTCAGCGCCGACCTCGACTAC540GCCATCGACGCCGACCTGCTGGCCCGGCTGACGGCCGGGCGGGGCATCGAGTCGGCCACC600GGCCCGGCGGGCTCGATCCTGCTGTTCGACTCCCGGATCGTGCACGGCTCGGGCACGAAC660ATGTCGCCGCACCCGCGCGGCGTCGTCCTGGTCACCTACAACCGCACCGACAACGCCCTG720CCGGCGCAGGCCGCTCCGCGCCCGGAGTTCCTGGCCGCCCGCGACGCCACCCCGCTGGTG780CCGCTGCCCGCGGGCTTCGCGCTGGCCCAGCCCGTC816附圖的簡單說明圖1是表示質(zhì)粒pTr2-4OHΔ的構(gòu)建過程圖。圖中黑的粗線部分表示含有L-脯氨酸-4-羥化酶基因的部分。Ap表示來自pBR322的耐氨芐青霉素基因；Ptrp×2表示來自大腸桿菌的色氨酸操縱子的啟動子2個串聯(lián)的啟動子(串聯(lián)Trp啟動子)。箭頭表示基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的方向。而圖中只給出了與質(zhì)粒構(gòu)建有關(guān)的限制酶部位。圖2是表示質(zhì)粒pWFH1的構(gòu)建過程圖。圖中網(wǎng)格粗線表示的部分表示HindIII和SalI處理的PCR擴增片段的插入部位。黑的粗線表示的部分表示含有來自指孢囊菌RH1的L-脯氨酸-4-羥化酶基因的部分。Ap表示來自pBR322的耐氨芐青霉素基因，Ptrp×2表示來自大腸桿菌的色氨酸操縱子的啟動子2個串聯(lián)起來的啟動子(串聯(lián)Trp啟動子)。箭頭表示基因轉(zhuǎn)錄和翻譯方向。而圖中只給出了與質(zhì)粒構(gòu)建有關(guān)系的限制酶切部位。圖3是表示質(zhì)粒pBAB51的構(gòu)建過程圖。圖中黑的網(wǎng)格表示的部分是含有脯氨酸合成系統(tǒng)酶基因proB74和proA的部分。Ap表示來自pBR322的耐氨芐青霉素基因，lacZ表示β-半乳糖苷酶α片段的結(jié)構(gòu)基因。Tc表示來自pBR322的耐四環(huán)素基因。箭頭表示基因轉(zhuǎn)錄和翻譯方向。而圖中只給出了與質(zhì)粒構(gòu)建有關(guān)的限制酶切部位。圖4是表示質(zhì)粒pPRO74的構(gòu)建過程中黑的網(wǎng)格表示的部分是含有脯氨酸合成系統(tǒng)酶基因proB74和proA的部分。黑的部分表示在proB74和proB中含有唯一不同堿基對的proB74基因的一部分。Tc表示來自pBR322的耐四環(huán)素基因。箭頭表示基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的方向。而圖中只給出了與質(zhì)粒構(gòu)建有關(guān)系的限制酶切部位。圖5是表示質(zhì)粒pPF1的構(gòu)建過程圖。圖中黑的粗線部分表示含有脯氨酸合成系統(tǒng)酶基因proB74和proA的部分。Cmr表示來自Tn9的耐氯霉素基因的部分。pA-CYC.ori表示來自pACYC184的復(fù)制起點，Plac表示lacZ啟動子，lacZ表示β-半乳糖苷酶α片段結(jié)構(gòu)基因。lacZ.Nterm-proB74表示β-半乳糖苷酶α片段結(jié)構(gòu)基因的N末端部分與proB74基因融合了的基因。箭頭表示基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的方向。而圖中只給出了與質(zhì)粒構(gòu)建有關(guān)系的限制酶切部位。圖6是表示質(zhì)粒pBII-4OH的構(gòu)建過程圖。圖中黑粗線部分表示含有L-脯氨酸-4-羥化酶基因的部分。Ap表示來自pBR322的耐氨芐青霉素的基因，lacZ表示β-半乳糖苷酶α片段的結(jié)構(gòu)基因。箭頭表示基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的方向。而圖中只給出了與質(zhì)粒構(gòu)建有關(guān)的限制酶切部位。圖7是表示質(zhì)粒pBII-4OHBA的構(gòu)建過程圖。圖中黑的粗線部分表示含有L-脯氨酸-4-羥化酶基因的部分。黑網(wǎng)格部分表示含有脯氨酸的合成系統(tǒng)酶基因proB74和proA的部分。Ap表示來自pBR322的耐氨芐青霉素基因，lacZ表示β-半乳糖苷酶α片段結(jié)構(gòu)基因。箭頭表示基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的方向。而圖中只給出了與質(zhì)粒構(gòu)建有關(guān)的限制酶切部位。圖8是質(zhì)粒pWFp1的構(gòu)建過程圖。圖中黑粗線部分表示含有L-脯氨酸-4-羥化酶基因的部分。黑網(wǎng)格部分表示含有脯氨酸合成系統(tǒng)酶基因proB74和proA的部分。Ap表示來自pBR322的耐氨芐青霉素的基因，lacZ表示β-半乳糖苷酶α片段結(jié)構(gòu)基因。Ptrp×2表示來自大腸桿菌的色氨酸操縱子的啟動子2個串聯(lián)的啟動子(串聯(lián)Trp啟動子)。箭頭表示基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的方向。而圖中只給出了與質(zhì)粒構(gòu)建有關(guān)的限制酶切部位。圖9是表示質(zhì)粒pTr2-4OH的構(gòu)建過程圖。圖中黑粗線部分表示含有L-脯氨酸-4-羥化酶基因的部分。Ap是來自pBR322的耐氨芐青霉素的基因，Ptrp×2表示來自大腸桿菌的色氨酸操縱子的啟動子2個串聯(lián)的啟動子(串聯(lián)Trp啟動子)。箭頭表示基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的方向。而圖中只給出了與質(zhì)粒構(gòu)建有關(guān)的限制酶切部位。權(quán)利要求1.一種帶有重組DNA而且能使L-脯氨酸生物合成系統(tǒng)的活性增強的轉(zhuǎn)化體，其中的重組DNA是通過將含有編碼具有L-脯氨酸-4-羥化酶活性的蛋白質(zhì)的基因的DNA片段重組到載體中得到的，所說的L-脯氨酸-4-羥化酶活性是指在2-酮戊二酸和2價鐵離子存在下作用于游離的L-脯氨酸生成反式-4-羥基-L-脯氨酸。2.權(quán)利要求1記載的轉(zhuǎn)化體，其特征是L-脯氨酸生物合成系統(tǒng)的活性增強是通過使宿主中的脯氨酸合成系統(tǒng)基因的拷貝數(shù)增加、讓受到來自脯氨酸反饋抑制的脯氨酸合成系統(tǒng)酶基因產(chǎn)生變異、向宿主中導(dǎo)入編碼受到脯氨酸反饋抑制顯著減少的酶的基因、使脯氨酸分解活性喪失、或通過以上這些手段的組合來實現(xiàn)的。3.權(quán)利要求1記載的轉(zhuǎn)化體，其特征是L-脯氨酸生物合成系統(tǒng)活性的增強是通過導(dǎo)入編碼與L-脯氨酸的生物合成有關(guān)的酶的基因來實現(xiàn)的。4.權(quán)利要求3記載的轉(zhuǎn)化體，其中的基因是來自大腸桿菌的proB或proA基因。5.權(quán)利要求3記載的轉(zhuǎn)化體，其中的基因是編碼與來自L-脯氨酸反饋抑制減少的脯氨酸生物合成有關(guān)的酶的基因。6.權(quán)利要求5記載的轉(zhuǎn)化體，其中的基因是來自大腸桿菌的proB74基因。7.反式-4-羥基-L-脯氨酸的制造方法，其特征是將權(quán)利要求1、2、3、4、5或6記載的轉(zhuǎn)化體在培養(yǎng)基上培養(yǎng)，將得到的培養(yǎng)物、菌體或它們的處理物作為酶源，在2-酮戊二酸和2價鐵離子存在下，于水性介質(zhì)中使L-脯氨酸變換成反式-4-羥基-L-脯氨酸，再從該水性介質(zhì)中獲取生成的反式-4-羥基-L-脯氨酸。8.權(quán)利要求7記載的制造方法，其特征是水性介質(zhì)是培養(yǎng)液。全文摘要本發(fā)明提供帶有重組DNA而且可以使L－脯氨酸生物合成系統(tǒng)的活性增強的轉(zhuǎn)化體,其中重組DNA是通過將含有編碼在2－酮戊二酸和2價鐵離子存在下,作用于游離的L－脯氨酸,生成反式－4－羥基－L－脯氨酸的具有L－脯氨酸－4－羥化酶活性的蛋白質(zhì)的基因的DNA片段重組到載體后得到的,同時本發(fā)明還提供反式－4－羥基－L－脯氨酸的制造方法。文檔編號C12N15/53GK1178245SQ97117929公開日1998年4月8日申請日期1997年9月2日優(yōu)先權(quán)日1996年9月3日發(fā)明者尾崎明夫,柴崎剛,森英郎,丸山明彥,本山裕章申請人:協(xié)和發(fā)酵工業(yè)株式會社