專利名稱：第Ⅻ凝血因子活化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及采用相對(duì)于補(bǔ)體C1q球狀部位的受體的第XII凝血因子的新型活化方法。
血漿激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)，是生成各種有生理活性的激肽類的一系列生物體內(nèi)反應(yīng)系統(tǒng)的總稱。該血漿激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)與生物體內(nèi)其他各種酶反應(yīng)系統(tǒng)如，腎素-血管緊張素系統(tǒng)，凝血系統(tǒng)，纖溶系統(tǒng)，補(bǔ)體系統(tǒng)以及以前列腺素、白三烯、凝血噁烷為中心的花生四烯酸級(jí)聯(lián)以及兒茶酚胺等有密切相關(guān)，與生物體的機(jī)能調(diào)節(jié)有密切關(guān)系。
激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)生成的產(chǎn)物如舒緩激肽等激肽類，除表現(xiàn)出伴隨末梢血管擴(kuò)張的降壓、血管通透性亢進(jìn)、平滑肌的收縮或舒張、疼痛、白細(xì)胞游走、源于腎上腺皮質(zhì)的兒茶酚胺類的釋放等各種生理活性外，已知還是變態(tài)反應(yīng)等炎癥反應(yīng)的媒介物，在生物體內(nèi)的存在意義很大。因此，抑制激肽類作用或阻礙其生成的物質(zhì)，可以用于抗炎藥物、鎮(zhèn)痛劑、抗變態(tài)反應(yīng)藥物等。
血漿激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)一系列反應(yīng)系統(tǒng)的起始階段為第XII凝血因子(FXII)的活化。在生物體內(nèi)，由于對(duì)組織的傷害或侵害刺激致使FXII活化，由此使血漿激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)的一系列酶反應(yīng)得以進(jìn)行。即，被活化的FXII(活化型第XII凝血因子FXIIa)作用于同存在于血漿中的血漿前激肽釋放酶，將其變?yōu)榛罨偷拿福簿褪茄獫{激肽釋放酶，然后該血漿激肽釋放酶作用于血漿中的高分子激肽原，游離產(chǎn)生具有前述的種種生理活性的舒緩激肽。
FXII的活化反應(yīng)不僅是血漿激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)的起始反應(yīng)，在生物體內(nèi)其他各種機(jī)能調(diào)節(jié)系統(tǒng)，例如作為凝血系統(tǒng)、纖溶系統(tǒng)、腎素-血管緊張素系統(tǒng)、補(bǔ)體系統(tǒng)以及花生四烯酸級(jí)聯(lián)等的起始階段的調(diào)控反應(yīng)而起著非常重要的作用。已知FXII可以在帶有負(fù)電荷的異種表面上被活化，這些異種表面有陰離子、玻璃、硅藻土、葡聚糖硫酸酯、膠原、酸性粘多糖等，不過在實(shí)際的生物體內(nèi)的FXII的活化物質(zhì)尚未被鑒定。
本發(fā)明的目的在于提供與以往的采用帶負(fù)電荷的異種表面的方法不同的新型FXII活化方法，通過鑒定生物體內(nèi)的FXII活化物質(zhì)，可以較忠實(shí)地再現(xiàn)生物體內(nèi)實(shí)際的FXII活化反應(yīng)，，本發(fā)明人等，通過對(duì)生物體內(nèi)存在的FXII活化物質(zhì)進(jìn)行深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜上存在的相對(duì)于補(bǔ)體C1q球狀部位的受體蛋白質(zhì)是FXII的活化物質(zhì)，從而完成了本發(fā)明。
本發(fā)明為采用相對(duì)于補(bǔ)體C1q球狀部位的受體(以下簡(jiǎn)寫為gC1qR)的FXII活化方法以及由該物質(zhì)制成的FXII活化劑。補(bǔ)體是約20種血清蛋白質(zhì)的總稱，在生物體內(nèi)作為各種免疫反應(yīng)、變態(tài)反應(yīng)的媒介物質(zhì)起著重要作用。補(bǔ)體在血液中一般以非活性形式存在，但可被抗原抗體復(fù)合物、細(xì)菌、動(dòng)物細(xì)胞的膜成分等激活，表現(xiàn)出溶血、溶菌反應(yīng)、促進(jìn)吞噬作用、加速炎癥反應(yīng)等各種生物活性。補(bǔ)體系統(tǒng)的激活是從補(bǔ)體C1接觸前述活化物質(zhì)而被激活開始的。C1q是C1的3種亞型之一，由于它具有同淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血小板、上皮細(xì)胞、滑膜細(xì)胞等各種細(xì)胞結(jié)合的活性，暗示在這些細(xì)胞膜上存在其受體，可以被分離、鑒定。
本發(fā)明為采用相對(duì)于補(bǔ)體C1q球狀部位的受體蛋白質(zhì)(gC1qR)的FXII活化方法，本發(fā)明方法可用以較忠實(shí)地再現(xiàn)、反映生物體內(nèi)實(shí)際的FXII活化反應(yīng)。本發(fā)明所用的gC1qR可以從包括人在內(nèi)的各種動(dòng)物的上皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血小板、滑膜細(xì)胞等細(xì)胞中分離、精制得到。上述細(xì)胞可以是由生物體成分得到的正常細(xì)胞，當(dāng)然也可以利用培養(yǎng)、增殖的細(xì)胞或癌變培養(yǎng)細(xì)胞。gC1qR的分離、精制可以利用通常精制膜蛋白的方法進(jìn)行，例如一般以表面活性劑溶解細(xì)胞膜之后采用各種色譜方法精制。特別是親和色譜，采用gC1q或高分子激肽原的固定化擔(dān)體，利用其與gC1qR的生化親和力，所以分離能力高，是可以實(shí)現(xiàn)與其他膜蛋白特異分離的有效方法。
此外，本發(fā)明FXII活化方法中也可以采用基因工程制造的重組gC1qR。利用這種基因工程方法可以容易地得到均一的、雜蛋白較少的產(chǎn)品，例如，可根據(jù)B.Ghebrehiwet等的方法〔J.Exp.Med.179卷，1809～1821頁(1994年)〕制造重組gC1qR。
本發(fā)明的FXII活化方法中的活化反應(yīng)系統(tǒng)可根據(jù)目的而適當(dāng)設(shè)定，除實(shí)際上僅含有FXII的反應(yīng)系統(tǒng)之外，還可舉出采用含有FXII的普通動(dòng)物血漿的反應(yīng)系統(tǒng)或以血漿激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)的組成成分FXII、血漿前激肽釋放酶、激肽原等組成的重組系統(tǒng)為基礎(chǔ)的反應(yīng)系統(tǒng)。已確認(rèn)本發(fā)明的采用gC1qR的FXII活化方法具有鋅依賴性，故前述各反應(yīng)系統(tǒng)優(yōu)選在與鋅離子共存條件下進(jìn)行反應(yīng)。為設(shè)定最適合的反應(yīng)條件，除氯化鈉等鹽類及緩沖劑外還可在反應(yīng)系統(tǒng)內(nèi)適當(dāng)加入該領(lǐng)域內(nèi)習(xí)用的白蛋白或糖類等添加劑。本發(fā)明的FXII活化方法的反應(yīng)條件諸如gC1qR、FXII、其他精制蛋白質(zhì)、添加劑等的濃度以及pH、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間等均可為達(dá)到實(shí)施者的目的而分別討論、設(shè)定。
為測(cè)定經(jīng)過本發(fā)明的FXII活化方法后的FXII的活化程度，當(dāng)然可以通過對(duì)生成的FXIIa的定量而確定，這種測(cè)試可根據(jù)該領(lǐng)域內(nèi)慣用的方法進(jìn)行。上述FXIIa定量方法在文獻(xiàn)中已有許多報(bào)道，實(shí)施者可以采用最適當(dāng)?shù)姆椒?，常用的FXIIa定量方法例如有利用FXIIa的酶活性而測(cè)定的方法。該方法是采用FXIIa的對(duì)應(yīng)基質(zhì)的測(cè)定方法，除可采用血漿前激肽釋放酶、第XI凝血因子或血纖維蛋白溶酶等天然基質(zhì)外，采用N-Pro-Phe-Arg-pNA、D-Leu-Gly-Arg-pNA、N-苯甲酰-Ile-Glu-Gly-Arg-pNA鹽酸鹽或甲酯等合成發(fā)色基質(zhì)或Boc-Glu(oBz)-Gly-Arg-MCA、Boc-Gln-Gly-Arg-MCA等合成熒光基質(zhì)的方法因簡(jiǎn)便而常被使用。上述與本發(fā)明相關(guān)的反應(yīng)系統(tǒng)的組成成分、反應(yīng)條件、FXIIa生成量的測(cè)定方法等記載僅為實(shí)施本發(fā)明所采用方法的一例，本發(fā)明對(duì)此不加特別限制。
本發(fā)明的采用gC1qR的FXII活化方法可在多種試驗(yàn)系統(tǒng)進(jìn)行。由于上述FXII的活化反應(yīng)作為血漿激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)、凝血系統(tǒng)、纖溶系統(tǒng)等多種調(diào)節(jié)生物體機(jī)能的系統(tǒng)的起始階段的調(diào)控反應(yīng)，起著非常重要的作用，長(zhǎng)久以來為明確上述生物體內(nèi)的調(diào)節(jié)機(jī)制，已進(jìn)行過許多涉及FXII活化的研究。例如已進(jìn)行過涉及下述幾方面內(nèi)容的研究①FXII活化反應(yīng)的病理、生理學(xué)意義的判明、②控制FXII活化反應(yīng)的體內(nèi)存在的內(nèi)源性物質(zhì)的研究、③激肽游離、內(nèi)源性凝血、血纖維蛋白溶酶原活化、補(bǔ)體系統(tǒng)等各種生化反應(yīng)與FXII的關(guān)系。本發(fā)明方法可以較忠實(shí)地再現(xiàn)、反映實(shí)際生物體內(nèi)的FXII活化反應(yīng)，對(duì)這些試驗(yàn)、實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)非常有用。
此外，正在進(jìn)行與FXII活化有關(guān)的對(duì)血漿激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)、凝血系統(tǒng)、纖溶系統(tǒng)、腎素-血管緊張素系統(tǒng)、補(bǔ)體系統(tǒng)以及花生四烯酸級(jí)聯(lián)等有阻礙或促進(jìn)作用的藥物的開發(fā)研究。例如，阻礙血漿激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)的物質(zhì)，具有阻礙其終產(chǎn)物舒緩激肽產(chǎn)生的作用，可作為抑制舒緩激肽誘發(fā)的疼痛、炎癥、變態(tài)反應(yīng)等的藥物，即可作為鎮(zhèn)痛劑、抗炎藥、抗變態(tài)反應(yīng)藥物等使用。如果測(cè)定這些藥物活性的方法、篩選方法采用較接近生物體內(nèi)的實(shí)際的反應(yīng)系統(tǒng)，則發(fā)現(xiàn)具有適當(dāng)作用機(jī)理的較好藥物的可能性也較大，本發(fā)明方法具有上述特征，在上述藥物活性的測(cè)定方法中具有非常高的實(shí)用性。特別在測(cè)定作用于gC1qR而抑制FXII活化的藥物活性的場(chǎng)合，本發(fā)明方法為必須采用的方法。
例如，具體的前述藥物活性測(cè)定方法可舉出如，①采用動(dòng)物血漿的測(cè)定被檢物質(zhì)阻礙激肽釋放酶生成的活性的方法(特公平4-14000號(hào)公報(bào))、②采用動(dòng)物血漿的測(cè)定被檢物質(zhì)阻礙、促進(jìn)FXIIa生成的活性的方法(特開平7-51097號(hào)公報(bào))、③測(cè)定被檢物質(zhì)對(duì)重組的血漿激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)中的FXIIa、激肽釋放酶、舒緩激肽的生成的阻礙、促進(jìn)的活性的方法(特開平7-51098號(hào)公報(bào))等。
以下通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說明。另外，以下實(shí)施例是用來具體說明本發(fā)明，并不具有限制意義。實(shí)施例1 gC1qR的調(diào)制以下FXII活化實(shí)驗(yàn)中采用自源于人臍帶靜脈的上皮細(xì)胞(HUVEC)分離精制的gC1qR或重組gC1qR。所用重組gC1qR系按前述B.Ghebrehiwet等的方法〔J.Exp.Med.179卷，1809～1821頁，(1994年)〕得到的。自HUVEC所得gC1qR按以下方法精制，供FXII活化實(shí)驗(yàn)使用。
可溶化的HUVEC膜蛋白質(zhì)部分，以含159mM氯化鈉、2mM苯甲磺酰氟、1μM抑肽酶(aprotinin)、1μM胃蛋白酶抑制素(pepstatin)、0.1％ Triton X-100及50μM氯化鋅的10mM HEPES緩沖液透析，然后加入到高分子激肽原親和柱上。將柱充分清洗之后，以0.1M甘氨酸-鹽酸(pH2.5)洗脫，每流分取0.5mL。各洗脫液以1M tris-鹽酸緩沖液(pH9.0)調(diào)整至pH7.0后，用洗脫液的蛋白檢測(cè)器以及生物素化高分子激肽原進(jìn)行斑點(diǎn)印跡(dot blot)，得到精制gC1qR。實(shí)施例2 FXII的活化試驗(yàn)120μg/mL的FXII、32μg/mL的重組gC1qR以及0.6mM的S-2222(相對(duì)于FXIIa的合成基質(zhì)N-苯甲?；?L-異亮氨酰-L-谷氨酰-甘氨酰-L-精氨酰-對(duì)硝基酰替苯胺的鹽酸鹽與甲酯)在HEPES緩沖液(10mM HEPES、137mM氯化鈉、11mMD-葡萄糖、4mM氯化鉀、1mg/mL牛血清白蛋白、1mM氯化鈣、50μM氯化鋅、pH7.4)中25℃下進(jìn)行反應(yīng)。HEPES緩沖液使用前以(4-脒基苯基)甲磺酰氟(APMSF)處理，以使混入白蛋白中的蛋白酶類失活。通過FXII活化而產(chǎn)生的FXIIa的酶的作用，可將合成基質(zhì)S-2222中的對(duì)硝基苯胺游離，測(cè)定該對(duì)硝基苯胺的游離量，即可對(duì)FXIIa的生成量定量。對(duì)硝基苯胺發(fā)色為黃色，由于可以測(cè)定其在405nm處的吸光度，以分光光度計(jì)對(duì)此吸光度進(jìn)行經(jīng)時(shí)監(jiān)測(cè)，即可測(cè)定FXIIa的生成量。圖1所示為結(jié)果之一例。實(shí)施例3 FXII的活化試驗(yàn)2將各種濃度的重組gC1qR、1μg/mL的FXII、lμg/mL的高分子激肽原、1μg/mL的血漿前激肽釋放酶以及0.6mM的S-2302(相對(duì)于血漿激肽釋放酶的合成基質(zhì)H-D-脯氨酰-L-苯丙氨酰-L-精氨酰-對(duì)硝基苯胺二鹽酸鹽)在與上述同樣的APMSF處理HEPES緩沖液中于25℃下進(jìn)行反應(yīng)。在此試驗(yàn)系統(tǒng)中，測(cè)定激肽釋放酶的生成量作為FXII的活化指標(biāo)。即FXII被活化變?yōu)镕XIIa，F(xiàn)XIIa作用于血漿前激肽釋放酶，使之轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂忻富钚缘难る尼尫琶?。測(cè)定此激肽釋放酶的生成量即可確定FXII活化的程度。利用激肽釋放酶的水解作用，使合成基質(zhì)S-2302游離出對(duì)硝基苯胺而發(fā)色為黃色，以上述同法用分光光度計(jì)對(duì)此吸光度進(jìn)行經(jīng)時(shí)監(jiān)測(cè)，即可測(cè)定激肽釋放酶的生成量。圖2所示為結(jié)果之1例。
實(shí)施例2的試驗(yàn)系統(tǒng)為gC1qR僅與精制FXII混和反應(yīng)使FXII活化而進(jìn)行的測(cè)定，結(jié)果如圖1所示，可見作為FXIIa的生成量指標(biāo)的合成基質(zhì)游離出的對(duì)硝基苯胺的發(fā)色量隨時(shí)間而增加，由此可確認(rèn)gC1qR有FXII活化作用。此gC1qR所致FXII活化反應(yīng)如果沒有鋅離子的存在，則完全不發(fā)生活化，另外，血漿中存在的作為內(nèi)源性抑制劑的C1抑制劑也對(duì)此FXII活化過程呈濃度依賴性的抑制作用。
實(shí)施例3的試驗(yàn)系統(tǒng)是由FXII、血漿前激肽釋放酶以及高分子激肽原組成的血漿激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)的重組系統(tǒng)，以激肽釋放酶的生成量作為FXII活化的指標(biāo)而進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖2所示，gC1qR對(duì)FXII的活化具有濃度依賴性，與實(shí)施例2相同，沒有鋅離子的存在也未見活化。在此FXII活化反應(yīng)系統(tǒng)中，在gC1qR的使用量一定、使FXII濃度變化的情況下激肽釋放酶的生成量隨FXII用量的增加而增加。此外，將重組gC1qR變?yōu)椴捎米訦UVEC精制的gC1qR的場(chǎng)合同樣也能確認(rèn)FXII活化，由此說明gC1qR中的糖化部位對(duì)FXII活化無影響。
綜上，可見相對(duì)于補(bǔ)體C1q球狀部位的受體(gC1qR)具有FXII的活化作用，是生物體內(nèi)的FXII的實(shí)際活化物質(zhì)的一種。由此，本發(fā)明的采用gC1qR活化FXII的方法可以較忠實(shí)地再現(xiàn)生物體內(nèi)實(shí)際的FXII活化反應(yīng)，是與以往的采用帶負(fù)電荷的異種表面的方法不同的新型FXII活化方法。如前面已詳細(xì)敘述過的，由本發(fā)明FXII活化方法得到的接近生物體內(nèi)的反應(yīng)系統(tǒng)作為可實(shí)施的方法，在涉及FXII活化反應(yīng)的種種研究以及在與FXII活化或與以此為起始階段的血漿激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)等生物體內(nèi)反應(yīng)系統(tǒng)相關(guān)的藥物活性測(cè)定方法、篩選方法中，具有非常高的實(shí)用性。


圖1表示使FXII與gC1qR混和反應(yīng)，經(jīng)時(shí)檢測(cè)由gC1qR引起的FXII的活化的結(jié)果。
圖2表示在FXII與血漿前激肽釋放酶以及高分子激肽原組成的重組血漿激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)中，經(jīng)時(shí)檢測(cè)由gC1qR引起的FXII的活化的結(jié)果。
權(quán)利要求
1.一種第XII凝血因子活化方法，是采用相對(duì)于補(bǔ)體C1q球狀部位的受體進(jìn)行的。
2.權(quán)利要求1記載的第XII凝血因子活化方法，其特征是在鋅離子存在下進(jìn)行。
3.由相對(duì)于補(bǔ)體C1q球狀部位的受體組成的第XII凝血因子活化劑。
全文摘要
本發(fā)明提供的新型FXII活化方法可較忠實(shí)地再現(xiàn)生物體內(nèi)實(shí)際的FXII活化反應(yīng),通過鑒定生物體內(nèi)的FXII活化物質(zhì)而提供與以往的采用帶負(fù)電荷的異種表面的方法不同的新型FXII活化方法。本發(fā)明為采用相對(duì)于補(bǔ)體C
文檔編號(hào)C12N9/64GK1182137SQ9711842
公開日1998年5月20日 申請(qǐng)日期1997年9月11日 優(yōu)先權(quán)日1996年9月12日
發(fā)明者芝山洋二, A·P·卡普蘭 申請(qǐng)人:日本臟器制藥株式會(huì)社