專利名稱：人甲狀旁腺激素與人血清白蛋白的融合蛋白的制備方法及產(chǎn)品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
人甲狀旁腺激素與人血清白蛋白的融合蛋白的制備方法及產(chǎn)品，屬于長效重組融合蛋白藥物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
人血清白蛋白(Human serum albumin，HSA)是血漿中的主要蛋白成分，在血漿中的濃度為40mg/ml(Phillip P.Minghettis et al.，THE JOURNAL OFBIOLOGICAL CHEMISTRY，1986 2616747-6757)，它除了具有維持血漿滲透壓功能外，還能結(jié)合內(nèi)源性和/或外源性配體，包括激素、有毒代謝產(chǎn)物、藥物等。通過結(jié)合這些配體，HSA可以調(diào)節(jié)激素活性、內(nèi)源性和/或外源性物質(zhì)的毒性和藥物的利用度(Ji-Sook Ha et al.，Biochimica et BiophysicaActa，20031640119-128)。David S.Park等構(gòu)建的HalfHSA(截取HSA的前297個氨基酸殘基)具有野生型HSA相應(yīng)區(qū)類似的二級結(jié)構(gòu)，同時保留了野生型HSA結(jié)合甲狀腺素和甲狀腺素類似物的能力(David S.Park et al.，IUBMB Life，199948169-174)，細(xì)胞中剛翻譯出來的人血清白蛋白具有典型的pre-pro-protein結(jié)構(gòu)，包括18個氨基酸殘基的信號肽和6個氨基酸殘基前肽的原肽。信號肽和前肽在轉(zhuǎn)運和分泌的過程中被切除，成熟的HSA由585個氨基酸殘基組成，含有17對二硫鍵，分子量約為66.5KDa。通常情況下，HSA為非糖基化蛋白，然而有的突變體中也存在N-連接糖基化(見Uniprot中的protein ALBU HUMAN)。Peters的觀點認(rèn)為進(jìn)化出大分子蛋白的優(yōu)點是減小其在內(nèi)循環(huán)時經(jīng)腎排泄(Peters T.Jr.，Adv.Protein Chem.，1985 37161-245)。HSA的分子量相對較大，在正常情況下，不易被腎小球濾過，其血漿半衰期在20天左右。
人甲狀旁腺激素(human parathyroid hormone，PTH)通過與受體結(jié)合后激活腺苷酸環(huán)化酶和蛋白激酶C的活性，改變骨吸收和骨合成的速率，影響骨代謝。如果PTH的活性片段在較低或中等劑量的濃度下長時間作用于骨，則會刺激骨的形成，并且通過誘導(dǎo)骨中的合成作用而有效地治療骨質(zhì)疏松癥。由于PTH分子量較小，易被腎小球濾過，因而在體內(nèi)的半衰期較短，皮下給藥或肌肉注射的半衰期一般在12h左右。為了達(dá)到治療效果，一般需要頻繁大劑量用藥，為了克服上述缺點，人們通過對甲狀旁腺激素加以修飾，以延長其半衰期。本發(fā)明將把PTH和HSA進(jìn)行融合表達(dá)，通過研發(fā)人PTH的長效化技術(shù)，改善PTH體內(nèi)藥代動力學(xué)性狀，研發(fā)出一種具有自主知識產(chǎn)權(quán)的長效新藥。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種人甲狀旁腺激素與人血清白蛋白的融合蛋白的制備方法及產(chǎn)品。本發(fā)明的融合蛋白在保持了人甲狀旁腺激素的生理特性的基礎(chǔ)上延長其在體內(nèi)的半衰期，改善其溶解度，在藥學(xué)領(lǐng)域有良好的應(yīng)用前景。
本發(fā)明的技術(shù)方案從新鮮人甲狀旁腺組織中分離單核細(xì)胞，刺激培養(yǎng)，提取RNA，通過RT-PCR反轉(zhuǎn)錄得到PTH cDNA；通過PCR從人胎肝cDNA文庫中擴增獲得HSA cDNA；利用重疊PCR技術(shù)，連接HSA cDNA和PTH cDNA，中間不加入任何連接肽，得到的PTH-HAS cDNA融合基因插入到克隆載體中保存；PTH-HAS cDNA融合基因在宿主系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)，PTH-HSAcDNA融合基因被整合到宿主的染色體中。
PTH cDNA的克隆，HSA cDNA的克隆，HSA cDNA和PTH cDNA融合基因的克隆，融合蛋白PTH-HSA的重組酵母構(gòu)建和融合蛋白PTH-HSA的表達(dá)的步驟詳見實施例。
用上述方法制備的人甲狀旁腺激素與人血清白蛋白的融合蛋白，包括與人血清白蛋白至少85％序列同源的第一區(qū)和與人甲狀旁腺激素至少85％序列同源的第二區(qū)；所述與人血清白蛋白同源的第一區(qū)位于融合蛋白的C末端，所述與人甲狀旁腺激素同源的第二區(qū)位于融合蛋白的N末端，中間不加任何連接肽；或所述與人甲狀旁腺激素同源的第二區(qū)位于融合蛋白的C末端，所述與人血清白蛋白同源的第一區(qū)位于融合蛋白的N末端，中間不加任何連接肽。
優(yōu)選的是所述融合蛋白包括與人血清白蛋白至少95％序列同源的第一區(qū)和與人甲狀旁腺激素至少95％序列同源的第二區(qū)。
所述融合蛋白的第一區(qū)可以由人血清白蛋白部分結(jié)構(gòu)域組成、或經(jīng)結(jié)構(gòu)域重排后的人血清白蛋白組成，包括所有HSA天然存在的多態(tài)型外，還包括HSA的部分片段，如EP322094中所述名為HSA(1-n)，n為369-419。
所述融合蛋白包括與人血清白蛋白氨基酸殘基序列相同的第一區(qū)和與人甲狀旁腺激素氨基酸殘基序列相同的第二區(qū)，或上述二區(qū)的功能等同物。
所述功能等同物是在不改變所述融合蛋白特性的前提下，對融合蛋白個別氨基酸殘基的取代、缺失或加入得到的多肽。
本發(fā)明的另一內(nèi)容是提供表達(dá)融合蛋白編碼區(qū)的宿主。宿主系統(tǒng)是細(xì)菌、酵母、昆蟲細(xì)胞、動物細(xì)胞或植物細(xì)胞等。優(yōu)選的宿主系統(tǒng)是酵母。優(yōu)選的酵母是畢赤酵母。優(yōu)選的畢赤酵母是畢赤酵母KM71。
由于PTH基因含有內(nèi)含子，從新鮮人甲狀旁腺組織中分離單核細(xì)胞，刺激培養(yǎng)，提取RNA，通過RT-PCR反轉(zhuǎn)錄得到PTH cDNA。HAS cDNA可以通過PCR從人胎肝cDNA文庫中擴增獲得。獲得的PTH cDNA和HSA cDNA分別插入到克隆載體中，測序。利用重疊PCR技術(shù)，連接PTH cDNA和HSA cDNA，中間不加入任何連接肽，以避免因連接肽加入而帶來的融合蛋白穩(wěn)定性和免疫原性方面的問題，得到的PTH cDNA和HSA cDNA融合基因插入到克隆載體中保存。
PTH cDNA和HSA cDNA融合基因可以在多個宿主系統(tǒng)中表達(dá)，如細(xì)菌、酵母、昆蟲細(xì)胞、動物細(xì)胞、植物細(xì)胞，及生物體(如脊椎動物、昆蟲)等。在這些表達(dá)系統(tǒng)中目的基因被整合到宿主的染色體中或插入到質(zhì)粒中。本發(fā)明優(yōu)選的是酵母表達(dá)系統(tǒng)，更優(yōu)選的是畢氏酵母表達(dá)系統(tǒng)。
畢氏酵母表達(dá)系統(tǒng)分泌型表達(dá)載體主要有pPIC9K，pHIL-S1，pPICZα，pYAM75P6；胞內(nèi)型表達(dá)載體主要有pPIC3K，pPICZ，pHWO10，pGAPZ，pGAPZα(invitrogen)等，優(yōu)選的是畢赤酵母分泌型表達(dá)載體pPIC9K，它是酵母整合載體，帶有His缺陷型的選擇性標(biāo)記基因HIS4、AOX1啟動子、MFα分泌信號肽和G418抗性基因(可作為篩選重組子的標(biāo)記)等元件。AOX1啟動子是一個強啟動子，可以高效的啟動目的基因的表達(dá)。在畢氏酵母里共編碼兩種乙醇氧化酶AOX1和AOX2，細(xì)胞中絕大多數(shù)乙醇氧化酶的活力是由AOX1提供。在甲醇為唯一碳源培養(yǎng)的細(xì)胞中，該酶可占細(xì)胞總蛋白的30％以上。AOX2與AOX1的同源性雖然高達(dá)97％，但酶活很低。當(dāng)AOX1基因缺失，只存在AOX2時，大部分的乙醇氧化酶活力喪失，細(xì)胞利用甲醇能力降低，細(xì)胞在甲醇為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長很慢。
帶有融合cDNA的表達(dá)載體可以通過轉(zhuǎn)化鋰鹽法、PEG法、原生質(zhì)體法或電穿孔法轉(zhuǎn)化宿主系統(tǒng)。成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，即帶有本發(fā)明構(gòu)建的DNA的細(xì)胞，可以通過本領(lǐng)域熟知的方法加以鑒定，如收集細(xì)胞，裂解后提取DNA，然后進(jìn)行Southern雜交和PCR鑒定，也可在誘導(dǎo)表達(dá)后用HSA抗體和/或G-CSF抗體檢測培養(yǎng)液上清。
本發(fā)明的有益效果利用重疊PCR技術(shù)，連接HSA cDNA和PTH cDNA，中間不加入任何連接肽，以避免因連接肽加入而帶來的融合蛋白穩(wěn)定性(避免針對連接肽的蛋白酶降解)和免疫原性方面的問題。
優(yōu)選的酵母表達(dá)系統(tǒng)除了具備原核表達(dá)系統(tǒng)的易操作、生長迅速、營養(yǎng)要求簡單、易工業(yè)放大的特點外，還具有真核細(xì)胞的蛋白后修飾系統(tǒng)，有利于大量生產(chǎn)高質(zhì)量的重組蛋白。更優(yōu)選的是畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，和釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)相比，畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)在蛋白分泌和糖基化方面具有明顯的優(yōu)勢。畢赤酵母自身分泌的蛋白少，十分有利于純化；糖基化程度低，避免了釀酒酵母超糖基化帶來的免疫源性問題。
可以通過培養(yǎng)帶有本發(fā)明構(gòu)建的DNA的宿主系統(tǒng)，來生產(chǎn)本發(fā)明的融合蛋白。宿主系統(tǒng)培養(yǎng)優(yōu)選在生物反應(yīng)器上進(jìn)行，培養(yǎng)分兩個階段，第一階段主要用于宿主系統(tǒng)生長，第二階段主要用于產(chǎn)物合成?？梢杂酶鞣N蛋白分離的方法自含有本發(fā)明DNA構(gòu)建體的細(xì)胞培養(yǎng)物中分離、純化融合蛋白。如鹽析、沉淀、超濾、層析、制備電泳等技術(shù)及這些技術(shù)的組合。


圖1.質(zhì)粒pPIC9K-PTH-HSA圖2.質(zhì)粒pPIC9K-PTH-HSA的酶切驗證 Lane1DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；Lane2pPIC9K-PTH-HSA NcoI酶切；Lane3pPIC9K-PTH-HSA Sal I酶切。
圖3.融合蛋白的SDS-PAGE分析 Lane1KM71/pPIC9K；Lane2蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；Lane3～6KM71/PTH-HSA圖4.融合蛋白的HSA抗體檢測 Lane1蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；Lane2PTH-HAS。
具體實施方法實施例1PTH cDNA的克隆以RT-PCR反轉(zhuǎn)錄得到的PTH cDNA第一鏈為模板，通過PCR擴增出PTHcDNA，所用的引物如下p15’CGGAATTCATGACCCCCCTGGGCCCTGC-3’p25’-CGGCGGCCGCTCAGGGCTGGGCAAGGTGGC-3’PCR方法如下50μl的反應(yīng)體系中加入10μmol/L的p1和p2的引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 5μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，PTHcDNA第一鏈1μg，加雙蒸水補齊50μl，PCR條件為95℃變性10分鐘，94℃變性1分鐘，66℃退火1分鐘，72℃延伸90秒，循環(huán)35次；通過瓊脂糖凝膠電泳分析反應(yīng)產(chǎn)物，在加樣泳道出現(xiàn)目標(biāo)條帶，用PCR片段膠回收試劑盒純化出0.27kb的目標(biāo)片段，純化好的目標(biāo)片段和載體pBluescriptII KS(+)分別經(jīng)EcoR I和HindIII雙酶切；瓊脂糖凝膠電泳純化，用PCR片段膠回收試劑盒回收，用T4連接酶連接兩雙酶切后純化好的片段；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化物涂布于含有100μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板，37℃培養(yǎng)過夜；隨機挑取5個菌落，接種于20ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒；通過PCR，及EcoR I和HindIII雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性克隆，并對重組質(zhì)粒EcoR I和HindIII雙酶切位點間區(qū)域進(jìn)行DNA測序；陽性重組子保存在含有15％甘油的LB中，凍存于-80℃；重組質(zhì)粒命名為pBlue-PTH，陽性重組子命名為DH5α/pBlue-PTH。
實施例2HSA cDNA的克隆利用PCR從人胎肝cDNA文庫中擴增出HSA cDNA，所用的引物為PH15’AGGTCGACGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTC-3’PH25’-GCCAAGCTTTTATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTT-3’PCR方法如下50μl的反應(yīng)體系中加入10μmol/L的PH1和PH2的引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 1μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，人胎肝cDNA文庫1μg，加雙蒸水補齊50μl；PCR條件為95℃變性5分鐘，94℃變性1分鐘，60℃退火1分鐘，72℃延伸90秒，循環(huán)30次；通過瓊脂糖凝膠電泳分析反應(yīng)產(chǎn)物，在加樣泳道出現(xiàn)目標(biāo)條帶，用PCR片段膠回收試劑盒純化出1.8kb的目標(biāo)片段，純化好的目標(biāo)片段和載體pBluescriptII KS(+)分別經(jīng)SalI和HindIII雙酶切；瓊脂糖凝膠電泳純化，用PCR片段膠回收試劑盒回收，用T4連接酶連接兩雙酶切后純化好的片段；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化物涂布于含有X-gal、IPTG和100μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板，37℃培養(yǎng)過夜；挑取白色菌落，接種于20ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒；通過PCR，及SalI和HindIII雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性克隆，并對重組質(zhì)粒SalI和HindIII雙酶切位點間區(qū)域進(jìn)行DNA測序；陽性重組子保存在含有20％甘油的LB中，凍存于-80℃；重組質(zhì)粒命名為pBlue-HSA，陽性重組子命名為DH5α/pBlue-HAS。
實施例3HSA cDNA和PTH cDNA融合基因的克隆HSA cDNA的PCR擴增，所用引物如下P15’-CGGAATTCAAAAGAGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTCATCG-3’P25’-CAGGGGGGTGCCTAAGGCAGCTTGACTTGCAGCAACAA-3’PCR方法如下50μl的反應(yīng)體系中加入10μmol/L的引物P1和P2各1.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 5μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，pBlue-HSA 1μg，加雙蒸水補齊50μl；PCR條件為95℃變性5分鐘，65℃退火1分鐘，72℃延伸4分鐘，94℃變性1分鐘，循環(huán)30次。
PTHcDNA的PCR擴增，所用引物如下P35’CTGCCTTAGGCACCCCCCTGGGCCCTG-3’P45’CGGCGGCCGCTCAGGGCTGGGCAAGGTGGCGTAGAAC-3’PCR方法如下50μl的反應(yīng)體系中加入10μmol/L的P3和P4的引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 5μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，pBlue-PTH 1μg，加雙蒸水補齊50μl；PCR條件為95℃變性5分鐘，66.5℃退火1分鐘，72℃延伸90秒，94℃變性1分鐘，循環(huán)30次。
利用重疊PCR融合PTH cDNA和HSA cDNA將PTH的PCR擴增產(chǎn)物和HSA的PCR擴增產(chǎn)物分別稀釋10倍，再以4∶6體積比例混合后作為模板，于50μl的反應(yīng)體系中加入2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 5μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，混合好的模板1μl，加雙蒸水補齊50μl；PCR條件為95℃變性5分鐘，60℃退火1分鐘，72℃延伸4分鐘，94℃變性1分鐘，循環(huán)30次。
通過瓊脂糖凝膠電泳分析反應(yīng)產(chǎn)物，在加樣泳道出現(xiàn)目標(biāo)條帶，用PCR片段膠回收試劑盒純化出2kb的目標(biāo)條帶，純化好的目標(biāo)片段和載體pUC19分別經(jīng)EcoRI和HindIII雙酶切；瓊脂糖凝膠電泳純化，用PCR片段膠回收試劑盒回收，取雙酶切后純化好的PTH-HSA片段5μl，pBluescript II KS(+)5μl，加入2μl 10×ligation buffer，0.4μl T4連接酶，加雙蒸水補齊20μl，15℃反應(yīng)過夜；用T4連接酶連接兩雙酶切后純化好的片段；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL-1Blue感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化物涂布于含有100μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板，37℃培養(yǎng)過夜；隨機挑取5個單菌落，接種于20ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒；通過PCR和EcoRI和HindIII雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性克隆，并對重組質(zhì)粒EcoRI和HindIII酶切位點間區(qū)域進(jìn)行DNA測序；陽性重組子保存在含有20％甘油的LB中，凍存于-80℃；重組質(zhì)粒命名為pBlue-PTH-HAS，陽性重組子命名為XL-1/pBlue-HSA-PTH。
實施例4PTH-HSA重組酵母表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建及融合蛋白的表達(dá)融合蛋白PTH-HSA的重組酵母構(gòu)建取一支凍存的XL-1/pBlue-HSA-PTH，接種到20ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，提取的質(zhì)粒pBlue-PTH-HAS和酵母表達(dá)載體pPIC9K，經(jīng)EcoRI單酶切，瓊脂糖凝膠電泳純化，用PCR片段膠回收試劑盒回收。取酶切后純化好的pBlue-PTH-HSA片段5μl，pPIC9K 5μl，加入2μl10×ligation buffer，0.4μl T4連接酶，加雙蒸水補齊20μl，15℃反應(yīng)過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化物涂布于含100μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板，37℃培養(yǎng)過夜；挑取若干個長出的菌落，接種于20ml氨芐青霉素(100μg/ml)的LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過夜，用常規(guī)方法提取質(zhì)粒；通過PCR，及Nco I酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性克隆，陽性重組子保存在含有15％甘油的LB中，凍存于-80℃；重組質(zhì)粒命名為pPIC9K-PTH-HSA，陽性重組子命名為DH5α/pPIC9K-PTH-HAS；提取DH5α/pPIC9K-PTH-HSA中的質(zhì)粒，經(jīng)SalI酶切后，電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母KM71，轉(zhuǎn)化物涂布于含有1mol/L山梨醇的MD平板上，于30℃，培養(yǎng)6天。每塊平板上用2ml水洗滌，收集洗滌液。取部分收集到的洗滌液，分別涂布含有1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/mlG418的YPD平板，于30℃，培養(yǎng)3～6天。挑取在最高濃度G418的YPD平板上的長出菌落，接種于20ml MD培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)24小時，用常規(guī)方法提取重組畢赤酵母基因組DNA，通過PCR，瓊脂糖凝膠電泳鑒定，陽性重組子命名為KM71/pPIC9K-PTH-HAS。
PTH-HSA融合蛋白的表達(dá)將KM71/pPIC9K-PTH-HSA接種至裝有100mlBMGY(100mM磷酸鉀，pH6.0、1.34％無氨基酸的酵母氮基、4×10-5％生物素、1％甘油)的500ml三角瓶中，300rpm，29℃培養(yǎng)至A600nm值為2～6，離心收集菌體。將收集到的菌體接種至裝有20ml BMMY(100mM磷酸鉀，pH 6.0、1.34％無氨基酸的酵母氮基、4×10-5％生物素、0.5％甲醇)的100ml三角瓶中，每24小時補加一次甲醇至終濃度0.5％(V/V)，誘導(dǎo)3天。離心收集上清，過濾除菌，進(jìn)行SDS-PAGE驗證，Western雜交鑒定融合蛋白PTH-HSA分子的PTH的免疫源性。
用酶標(biāo)法測定上清中的融合蛋白PTH-HSA活性。UMR2106細(xì)胞于含10％小牛血清的DMEM2F12(美國GIBCO2BRL公司產(chǎn)品)培養(yǎng)液(pH7.2)，在37℃、5％CO2的條件下培養(yǎng)?；钚詼y定時，取對數(shù)生長期的細(xì)胞，經(jīng)0.02％胰蛋白酶消化后用培養(yǎng)液稀釋至1.5×105個細(xì)胞/ml。于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入100μl細(xì)胞稀釋液，培養(yǎng)5h，然后換成每孔100μl的DMEM2F12溶液(不含牛血清)，繼續(xù)培養(yǎng)過夜。取甲狀旁腺激素國際標(biāo)準(zhǔn)品及供試品各1支，分別溶解于DMEM2F12培養(yǎng)液中，預(yù)稀釋后，再按1∶2的體積比例進(jìn)行系列倍比稀釋。稀釋用溶液為DMEM2F12溶液(不含牛血清)。將細(xì)胞棄培養(yǎng)液后，每孔加入170μl DMEM2F12培養(yǎng)液，及10μl/孔IBMX(異丁基黃嘌呤，Sigma公司產(chǎn)品)，然后分別依次加入上述系列稀釋好的甲狀旁腺激素國際標(biāo)準(zhǔn)品及供試品，每孔20μl，每個稀釋度作3個復(fù)孔。每塊板上都帶有PTH國際標(biāo)準(zhǔn)品，及cAMP標(biāo)準(zhǔn)，同時設(shè)總活性對照(TA)、非特異性結(jié)合對照(NSB)、最大結(jié)合(B0)、底物空白對照(SB)孔，置于37℃培養(yǎng)。45min后進(jìn)行cAMP抽提。抽提方法去培養(yǎng)基，每孔加200μl 0.1mol/L HCl，37℃溫育30min后，裂解細(xì)胞，取上清用于測定cAMP。cAMP測定用cAMP(low p H)試劑盒測定。用微量滴定板酶標(biāo)儀檢測各孔在405nm處的光吸收值?；钚苑治鼋Y(jié)果證明產(chǎn)物具有PTH的免疫學(xué)活性。Western雜交表明產(chǎn)物具有PTH和HSA的免疫源性。
權(quán)利要求
1.人甲狀旁腺激素與人血清白蛋白的融合蛋白的制備方法，其特征是從新鮮人甲狀旁腺組織中分離單核甲狀旁腺細(xì)胞，刺激培養(yǎng)，提取RNA；通過RT-PCR反轉(zhuǎn)錄得到PTH cDNA；通過PCR從人胎肝cDNA文庫中擴增獲得HSA cDNA；利用重疊PCR技術(shù)，連接HSA cDNA和PTH cDNA，中間不加入任何連接肽，得到的PTH-HAS cDNA融合基因插入到克隆載體，PTH-HAS cDNA融合基因在宿主系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)，PTH-HAS cDNA融合基因被整合到宿主的染色體中；(1)PTH cDNA的克隆以RT-PCR反轉(zhuǎn)錄得到的PTH cDNA第一鏈為模板，通過PCR擴增出PTHcDNA，所用的引物如下p15’CGGAATTCATGACCCCCCTGGGCCCTGC-3’p25’CGGCGGCCGCTCAGGGCTGGGCAAGGTGGC-3’PCR方法如下50μl的反應(yīng)體系中加入10μmol/L的p1和p2的引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 5μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，PTHcDNA第一鏈1μg，加雙蒸水補齊50μl，PCR條件為95℃變性10分鐘，94℃變性1分鐘，65℃退火1分鐘，72℃延伸90秒，循環(huán)35次；通過瓊脂糖凝膠電泳分析反應(yīng)產(chǎn)物，在加樣泳道出現(xiàn)目標(biāo)條帶，用PCR片段膠回收試劑盒純化出0.27kb的目標(biāo)片段，純化好的目標(biāo)片段和載體pBluescriptII KS(+)分別經(jīng)EcoRI和HindIII雙酶切；瓊脂糖凝膠電泳純化，用PCR片段膠回收試劑盒回收，用T4連接酶連接兩酶切后純化好的片段；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化物涂布于含有100μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板，37℃培養(yǎng)過夜；隨機挑取5個單菌落，接種于20ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒；通過PCR，及EcoRI和HindIII雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性克隆，并對重組質(zhì)粒EcoRI和HindIII雙酶切位點間區(qū)域進(jìn)行DNA測序；陽性重組子保存在含有15％甘油的LB中，凍存于-80℃；重組質(zhì)粒命名為pBlue-PTH，陽性重組子命名為DH5α/pBlue-PTH；(2)HSA cDNA的克隆利用PCR從人胎肝cDNA文庫中擴增出HSA cDNA，所用的引物為PH15’AGGTCGACGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTC-3’PH25’-GCCAAGCTTTTATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTT-3’PCR方法如下50μl的反應(yīng)體系中加入10μmol/L的PH1和PH2的引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 1μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，人胎肝cDNA文庫1μg，加雙蒸水補齊50μl；PCR條件為95℃變性5分鐘，94℃變性1分鐘，60℃退火1分鐘，72℃延伸90秒，循環(huán)30次；通過瓊脂糖凝膠電泳分析反應(yīng)產(chǎn)物，在加樣泳道出現(xiàn)目標(biāo)條帶，用PCR片段膠回收試劑盒純化出1.8kb的目標(biāo)片段，純化好的目標(biāo)片段和載體pBluescriptII KS(+)分別經(jīng)SalI和HindIII雙酶切；瓊脂糖凝膠電泳純化，用PCR片段膠回收試劑盒回收，用T4連接酶連接兩雙酶切后純化好的片段；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化物涂布于含有X-gal、IPTG和100μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板，37℃培養(yǎng)過夜；挑取白色菌落，接種于20ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒；通過PCR，及SalI和HindIII雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性克隆，并對重組質(zhì)粒SalI和HindIII雙酶切位點間區(qū)域進(jìn)行DNA測序；陽性重組子保存在含有20％甘油的LB中，凍存于-80℃；重組質(zhì)粒命名為pBlue-HSA，陽性重組子命名為DH5α/pBlue-HAS；(3)PTH cDNA和HSA cDNA融合基因的克隆HSA cDNA的PCR擴增，所用引物如下P15’-CGGAATTCAAAAGAGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTCATCG-3’P25’-CAGGGGGGTGCCTAAGGCAGCTTGACTTGCAGCAACAA-3’PCR方法如下50μl的反應(yīng)體系中加入10μmol/L的引物P1和P2各1.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 5μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，pBlue-HSA 1μg，加雙蒸水補齊50μl；PCR條件為95℃變性5分鐘，65℃退火1分鐘，72℃延伸4分鐘，94℃變性1分鐘，循環(huán)30次；PTHcDNA的PCR擴增，所用引物如下P35’-CTGCCTTAGGCACCCCCCTGGGCCCTG-3’P45’-CGGCGGCCGCTCAGGGCTGGGCAAGGTGGCGTAGAAC-3’PCR方法如下50μl的反應(yīng)體系中加入10μmol/L的P3和P4的引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 5μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，pBlue-PTH 1μg，加雙蒸水補齊50μl；PCR條件為95℃變性5分鐘，66.5℃退火1分鐘，72℃延伸90秒，94℃變性1分鐘，循環(huán)30次；利用重疊PCR融合PTH cDNA和HSA cDNA將PTH的PCR擴增產(chǎn)物和HSA的PCR擴增產(chǎn)物分別稀釋10倍，再以4∶6體積比混合后作為模板，于50μl的反應(yīng)體系中加入2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfuBuffer 5μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，混合好的模板1μl，加雙蒸水補齊50μl；PCR條件為95℃變性5分鐘，60℃退火1分鐘，72℃延伸4分鐘，94℃變性1分鐘，循環(huán)30次；通過瓊脂糖凝膠電泳分析反應(yīng)產(chǎn)物，在加樣泳道出現(xiàn)目標(biāo)條帶，用PCR片段膠回收試劑盒純化出2kb的目標(biāo)條帶，純化好的目標(biāo)片段和載體pBluescript IIKS(+)經(jīng)EcoRI和HindIII雙酶切；瓊脂糖凝膠電泳純化，用PCR片段膠回收試劑盒回收，取雙酶切后純化好的PTH-HSA片段5μl，pBluescript IIKS(+)5μl，加入2μl 10×ligation buffer，0.4μl T4連接酶，加雙蒸水補齊20μl，15℃反應(yīng)過夜；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL-1Blue感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化物涂布于含有100μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板，37℃培養(yǎng)過夜；隨機挑取5個單菌落，接種于20ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒；通過PCR，及EcoRI和HindIII雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性克隆，并對重組質(zhì)粒EcoRI和HindIII雙酶切位點間區(qū)域進(jìn)行DNA測序；陽性重組子保存在含有15％甘油的LB中，凍存于-80℃；融合基因命名為PTH-HSA，重組質(zhì)粒命名為pBlue-PTH-HAS，含重組質(zhì)粒的重組大腸桿菌命名為XL-1/pBlue-HSA-PTH；(4)融合蛋白HSA-PTH的重組酵母構(gòu)建取一支凍存的XL-1/pBlue-HSA-PTH，接種到20ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，提取的質(zhì)粒pBlue-PTH-HSA和酵母表達(dá)載體pPIC9K，分別經(jīng)EcoRI和HindIII雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳純化，用PCR片段膠回收試劑盒回收，用T4連接酶連接兩雙酶切后純化好的片段；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化物涂布于含100μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板，37℃培養(yǎng)過夜；挑取長出菌落，接種于20ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒；通過PCR，及EcoRI和HindIII雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性克隆，陽性重組子保存在含有15％甘油的LB中，凍存于-80℃；重組質(zhì)粒命名為pPIC9K-PTH-HSA，陽性重組子命名為DH5α/pPIC9K-PTH-HAS；提取DH5α/pPIC9K-PTH-HSA中的質(zhì)粒，經(jīng)SalI酶切后，電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母KM71，提取重組畢赤酵母基因組DNA，通過PCR，瓊脂糖凝膠電泳鑒定，陽性重組子命名為KM71/pPIC9K-PTH-HSA；(5)融合蛋白PTH-HSA的表達(dá)將KM71/pPIC9K-PTH-HSA接種至裝有100ml BMGY的500ml三角瓶中，300rpm，29℃培養(yǎng)至A600nm為2～6，離心收集菌體，將收集到的菌體接種至裝有20ml BMMY的100ml三角瓶中，每24小時補加一次甲醇至終濃度0.5％，誘導(dǎo)3天，離心收集上清，用酶標(biāo)法測定上清液中的融合蛋白PTH-HAS的含量，進(jìn)行SDS-PAGE驗證，Western雜交鑒定融合蛋白PTH-HSA分子的PTH免疫源性。
2.用權(quán)利要求1所述方法制備的人甲狀旁腺激素與人血清白蛋白的融合蛋白，其特征是包括與人血清白蛋白至少85％序列同源的第一區(qū)和與人甲狀旁腺激素至少85％序列同源的第二區(qū)；所述與人血清白蛋白同源的第一區(qū)位于融合蛋白的C末端，所述與人甲狀旁腺激素同源的第二區(qū)位于融合蛋白的N末端，中間不加任何連接肽；或所述與人甲狀旁腺激素同源的第二區(qū)位于融合蛋白的C末端，所述與人血清白蛋白同源的第一區(qū)位于融合蛋白的N末端，中間不加任何連接肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人甲狀旁腺激素與人血清白蛋白的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白包括與人血清白蛋白至少95％序列同源的第一區(qū)和與人甲狀旁腺激素至少95％序列同源的第二區(qū)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人甲狀旁腺激素與人血清白蛋白的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白的第一區(qū)由人血清白蛋白部分結(jié)構(gòu)域組成或經(jīng)結(jié)構(gòu)域重排后的人血清白蛋白組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人甲狀旁腺激素與人血清白蛋白的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白包括與人血清白蛋白氨基酸殘基序列相同的第一區(qū)和與人甲狀旁腺激素氨基酸殘基序列相同的第二區(qū)，或上述二區(qū)的功能等同物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的人甲狀旁腺激素與人血清白蛋白的融合蛋白，其特征在于所述功能等同物是在不改變所述融合蛋白特性的前提下，對融合蛋白個別氨基酸殘基的取代、缺失或加入得到的多肽。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是宿主系統(tǒng)是細(xì)菌、酵母、昆蟲細(xì)胞、動物細(xì)胞或植物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征是優(yōu)選的宿主系統(tǒng)是酵母。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征是優(yōu)選的酵母是畢赤酵母。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征是優(yōu)選的畢赤酵母是畢赤酵母KM71。
全文摘要
人甲狀旁腺激素(PTH)與人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白的制備方法及產(chǎn)品，屬于長效重組融合蛋白藥物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明利用重疊PCR技術(shù)，將HAS cDNA和PTH cDNA進(jìn)行拼接，中間不加入任何連接肽，得到的PTH－HSA cDNA融合基因被整合到宿主的染色體中，在宿主系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)。本發(fā)明的融合蛋白包括與人血清白蛋白至少85％序列同源的第一區(qū)和與人甲狀旁腺激素至少85％序列同源的第二區(qū)。該融合蛋白可以在不改變?nèi)诤系鞍滋匦缘那疤嵯?，進(jìn)行個別氨基酸殘基的取代、缺失或加入。本發(fā)明的融合蛋白在保持了人甲狀旁腺激素生理特性的基礎(chǔ)上，延長其在體內(nèi)的半衰期，改善其溶解度，在藥學(xué)領(lǐng)域有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N15/62GK101063125SQ20071002089
公開日2007年10月31日 申請日期2007年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月17日
發(fā)明者沈微, 金堅, 諸葛健, 王俊, 張蓮芬 申請人:江南大學(xué)