專利名稱：可溶性cd40l刺激人外周血b細(xì)胞長(zhǎng)期培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細(xì)胞培養(yǎng)方法，特別涉及一種利用可溶性CD40配體(sCD40L)刺激人外周血B細(xì)胞的長(zhǎng)期培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
在抗乙型肝炎病毒特異性主動(dòng)免疫治療領(lǐng)域，樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)作為一種功能強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞(APC)，在抗病毒免疫中起核心作用?？茖W(xué)研究證明，DC功能缺陷或數(shù)量減少與乙肝慢性化或慢性攜帶狀態(tài)有直接相關(guān)性。因而利用激活DC能誘導(dǎo)出HBsAg特異的殺傷效應(yīng)，是抗肝炎病毒主動(dòng)免疫治療極有前景的方法。但是，這種方法卻存在著如下缺陷(1)樹(shù)突狀細(xì)胞在自然狀態(tài)下數(shù)量很少，僅占外周血單個(gè)核細(xì)胞的0.1％-0.5％，體外培養(yǎng)難，成活時(shí)間短，僅有10-15天時(shí)間，要達(dá)到治療劑量的細(xì)胞數(shù)采血量多，故在多次進(jìn)行的免疫治療中，病人損傷大，臨床應(yīng)用不便。(2)慢性乙型肝炎患者或病毒感染者體內(nèi)，樹(shù)突狀細(xì)胞的功能顯著缺陷或數(shù)量減少，體外培養(yǎng)的效率不高或培養(yǎng)后功能不足。(3)樹(shù)突狀細(xì)胞的體外培養(yǎng)成本較高。(4)樹(shù)突狀細(xì)胞確切的分化機(jī)制，各功能亞群發(fā)揮作用的分子機(jī)理，DC與其它免疫細(xì)胞之間相互的關(guān)系，還并不清楚。
在本發(fā)明之前，B細(xì)胞作為一種抗原遞呈細(xì)胞(APC)，早已為人們熟知。但以往刺激人外周血B細(xì)胞培養(yǎng)的方法是用可穩(wěn)定表達(dá)CD40配體的NIH3T3細(xì)胞與B細(xì)胞共刺激培養(yǎng)。這種方法不但引入了外源性的細(xì)胞，增加實(shí)驗(yàn)的干擾因素，而且不能直接作用于人體，無(wú)法供應(yīng)臨床。因此，其雖然可以在體外培養(yǎng)人外周血B細(xì)胞，但不能解決臨床疾病的困擾。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就在于克服上述缺陷，研究、開(kāi)發(fā)一種利用可溶性CD40配體刺激人外周血B細(xì)胞的長(zhǎng)期培養(yǎng)方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案是可溶性CD40L刺激人外周血B細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其主要技術(shù)步驟為(1)無(wú)菌收集人外周血；(2)淋巴細(xì)胞分離液分離人外周血，得人外周血單個(gè)核細(xì)胞；(3)將人外周血單個(gè)核細(xì)胞置于由含10％人AB血清、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素組成的培養(yǎng)液中重懸細(xì)胞；(4)放入5％CO2、37℃、飽和濕度的孵育箱內(nèi)培養(yǎng)；(5)加入2ug/ml的sCD40L、CsA 625ug/ml、2ng/ml的IL-4繼續(xù)刺激培養(yǎng)。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和效果在于采用CD40配體體外刺激人外周血B細(xì)胞可以產(chǎn)生B細(xì)胞的大量持續(xù)培養(yǎng)，能夠從20ml外周血單個(gè)核細(xì)胞中持續(xù)大量培養(yǎng)B細(xì)胞。同時(shí)，培養(yǎng)活化后的B細(xì)胞可以高表達(dá)MHC I、MHC II、CD80、CD86等抗原遞呈的必需分子，并可以有效提呈腫瘤細(xì)胞裂解物、抗原肽、抗原cDNA，甚至RNA，誘發(fā)特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)，其效果與樹(shù)突狀細(xì)胞相似，卻避免了樹(shù)突狀細(xì)胞培養(yǎng)的缺陷。同時(shí)，也解決了CD40配體的NIH3T3細(xì)胞與B細(xì)胞共刺激培養(yǎng)的缺陷。
本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)和效果將在下面繼續(xù)描述。


圖1——外周血中B細(xì)胞團(tuán)簇狀生長(zhǎng)圖(A-培養(yǎng)第10天，B-培養(yǎng)第20天，C-培養(yǎng)第30天，D-培養(yǎng)第40天，E-培養(yǎng)第50天)。
圖2——細(xì)胞周期分析結(jié)果示意圖(G0-189.39％、G2-M2.67％、S7.94％)。
圖3——培養(yǎng)后CD40-B細(xì)胞高表達(dá)CD80、CD86及MHCI和II類分子示意圖。
具體實(shí)施例方式
i.無(wú)菌收集人外周血(PBMC)20ml(抗凝)，用IMDM培養(yǎng)液重懸，并計(jì)數(shù)；ii.在室溫下1500轉(zhuǎn)/min離心5分鐘，去上清；iii.用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，并計(jì)數(shù)；iv.該培養(yǎng)液含10％人AB血清、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素；v.用淋巴細(xì)胞分離液(ficoll)分離得人外周血單個(gè)核細(xì)胞，培養(yǎng)；vi.將人外周血單個(gè)核細(xì)胞濃度調(diào)整為2×106/ml，培養(yǎng)體系4ml；vii.加入IL-4 2ng/ml、CsA 625ug/ml、sCD40L 2ug/ml至培養(yǎng)液中；viii.將PBMC懸液移至6孔培養(yǎng)板中，每孔加4ml(2×106/ml)；ix.再放入5％CO2、37℃、飽和濕度的孵育箱內(nèi)培養(yǎng)；x.人外周血單個(gè)核細(xì)胞靜置12小時(shí)以上，待細(xì)胞沉降于培養(yǎng)板底部，小心吸去培養(yǎng)板上層培養(yǎng)液2ml；xi.補(bǔ)充含10％人AB血清、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素的培養(yǎng)液2ml；xii.再加入IL-4 2ng/ml、CsA 625ug/ml、sCD40L 2ug/ml至培養(yǎng)液，小心將細(xì)胞吹散；xiii.繼續(xù)放入5％CO2、37℃、飽和濕度的孵育箱內(nèi)培養(yǎng)。每4天半量換液。
在sCD40L和IL-4作用下，外周血B淋巴細(xì)胞成團(tuán)簇樣生長(zhǎng)，如圖1所示，A為培養(yǎng)第10天，B為培養(yǎng)第20天，C為培養(yǎng)第30天，D為培養(yǎng)第40天，E為培養(yǎng)第50天；B細(xì)胞成功培養(yǎng)達(dá)50天，細(xì)胞周期分析表明G0-189.39％、G2-M2.67％、S7.94％，如圖2所示；并高表達(dá)CD80、CD86及MHCI和II類分子，如圖3所示。
權(quán)利要求
1.可溶性CD40L刺激人外周血B細(xì)胞長(zhǎng)期培養(yǎng)方法，其步驟為(1)無(wú)菌收集人外周血；(2)淋巴細(xì)胞分離液分離人外周血，得人外周血單個(gè)核細(xì)胞；(3)將人外周血單個(gè)核細(xì)胞置于由含10％人AB血清、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素組成的培養(yǎng)液中重懸細(xì)胞；(4)放入5％CO2、37℃、飽和濕度的孵育箱內(nèi)培養(yǎng)；(5)加入2ug/ml的sCD40L、CsA 625ug/ml、2ng/ml的IL-4繼續(xù)刺激培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可溶性CD40L刺激人外周血B細(xì)胞長(zhǎng)期培養(yǎng)方法，其特征在于步驟(2)中將人外周血在室溫下離心分離。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可溶性CD40L刺激人外周血B細(xì)胞長(zhǎng)期培養(yǎng)方法，其特征在于步驟(3)將人外周血單個(gè)核細(xì)胞濃度調(diào)整為2×106/ml，培養(yǎng)體系4ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可溶性CD40L刺激人外周血B細(xì)胞長(zhǎng)期培養(yǎng)方法，其特征在于培養(yǎng)過(guò)程中重復(fù)步驟(3)、(5)，每4天半量換液，繼續(xù)培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用可溶性CD40配體(sCD40L)刺激人外周血B細(xì)胞的長(zhǎng)期培養(yǎng)方法。本發(fā)明無(wú)菌收集人外周血，淋巴細(xì)胞分離液分離人外周血，將人外周血單個(gè)核細(xì)胞置于由含10％人AB血清、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素組成的培養(yǎng)液中重懸細(xì)胞，放入孵育箱內(nèi)培養(yǎng)，加入2ug/ml的sCD40L、CsA 625ug/ml、2ng/ml的IL－4繼續(xù)刺激培養(yǎng)。解決了現(xiàn)有方法存在的引入外源性的細(xì)胞，增加實(shí)驗(yàn)的干擾因素，無(wú)法供應(yīng)臨床的缺陷。本發(fā)明采用CD40配體體外刺激人外周血B細(xì)胞可產(chǎn)生B細(xì)胞大量持續(xù)培養(yǎng)，能從20ml外周血單個(gè)核細(xì)胞中持續(xù)大量培養(yǎng)B細(xì)胞。培養(yǎng)活化后的B細(xì)胞可以高表達(dá)MHC I、MHC II、CD80、CD86等抗原遞呈的必需分子，有效提呈腫瘤細(xì)胞裂解物、抗原肽、抗原cDNA，甚至RNA，誘發(fā)特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)。
文檔編號(hào)C12N5/08GK101041815SQ20071002052
公開(kāi)日2007年9月26日 申請(qǐng)日期2007年3月6日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月6日
發(fā)明者吳超, 黃祖瑚, 劉勇, 陳廣梅, 陳軍浩 申請(qǐng)人:南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院