專利名稱：乳腺癌干細胞分離方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種干細胞分離方法，尤其是一種乳腺癌干細胞分離方法，屬于腫瘤研究技術領域。
背景技術：
2003年Al-Hajj等利用乳腺癌細胞表面抗原的差異，使用特異性熒光標記的抗體和流式細胞技術，將乳腺癌細胞分選為單獨的群體，再將分選出不同表型的細胞分別注射到免疫缺陷小鼠體內，結果發(fā)現(xiàn)只有表面抗原標志為ESA+Lin-CD44+CD24-/low的一小群細胞具有連續(xù)性成瘤特性，并唯一能夠自我復制，啟動腫瘤的發(fā)生，且其比例很小，僅占腫瘤細胞的2％，這就是乳腺癌干細胞。此外，也可用干細胞功能性指標SP表型來分選腫瘤干細胞。2004年，Kondo等在C6、MCF-7、B104和Hela四個細胞系中檢測到了SP細胞，其中MCF-7中SP細胞占2％。但是，同正常組織中的干細胞相似，由于乳腺癌干細胞在乳腺癌組織中所占的比例低，僅占2％左右，直接用流式細胞儀來分選難度大，效果差，分選后乳腺癌干細胞純度不夠高，總的來說分選的效率不高。
另外，1987年，Ponti等發(fā)現(xiàn)通過體外干無血清培養(yǎng)方式能夠將使腫瘤干細胞存活下來，而非腫瘤干細胞則逐漸死亡，從而可以使腫瘤干細胞的含量提高。上述方法雖然較簡單，能夠使腫瘤干細胞的含量提高，但是此方法較為粗略，使腫瘤干細胞富聚的能力有限，不可能達到很高的分選效率和純度(如95％以上)。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的技術問題是針對以上現(xiàn)有技術存在的缺點，提出一種可以保證高分選效率和分離純度的乳腺癌干細胞分離方法，為進一步研究乳腺癌干細胞的各種生物學特性提供條件。
為了解決以上技術問題，本發(fā)明的乳腺癌干細胞分離方法之一包括以下步驟1)將乳腺癌細胞系或原代乳腺癌組織消化成單細胞懸液；2)按預定密度和層數(shù)配置不同密度Percoll分離液，按密度高低依次疊加，制成Percoll不連續(xù)密度梯度分離液；3)將消化后的單細胞懸液疊加到Percoll不連續(xù)密度梯度分離液頂端，離心分離；4)吸出離心后Percoll分離液中分層的各亞群細胞，PBS洗；5)將分離出的各亞群細胞中每個亞群各設實驗管和對照管，實驗管和對照管分別加入Hoechst 33342以及Hoechst 33342、Verapamil至預定終濃度，水浴并PBS洗后，用流式細胞儀檢測出腫瘤干細胞比例最高的亞群；6)如該腫瘤干細胞比例最高的亞群達到預定的富聚度，則用流式細胞儀分選備用；7)如該腫瘤干細胞比例最高的亞群未達到預定的富聚度，則調整Percoll分離液的密度，重復以上相關步驟，直至篩選出腫瘤干細胞達到預定富聚度的Percoll分離液密度，再用流式細胞儀分選已富聚亞群中的腫瘤干細胞備用。
本發(fā)明的乳腺癌干細胞分離方法之二包括以下步驟1)將乳腺癌細胞系或原代乳腺癌組織消化成單細胞懸液；2)在無血清培養(yǎng)液中添加生長因子，制備成無血清培養(yǎng)液；3)將消化后的單細胞懸液置于無血清培養(yǎng)液中，培養(yǎng)預定時間；4)將經(jīng)培養(yǎng)富聚的腫瘤干細胞消化成單細胞懸液；5)將步驟4)的單細胞懸液分為實驗管和對照管，實驗管中加入CD44-FITC、CD24-PE，對照管中不加，PBS洗后用含多聚甲醛的PBS液重懸固定細胞，用流式細胞儀檢測經(jīng)無血清培養(yǎng)富聚后腫瘤干細胞的比例；6)如以上無血清培養(yǎng)后腫瘤干細胞含量達到預定富聚度，則用流式細胞儀分選備用；7)如以上無血清培養(yǎng)后腫瘤干細胞含量仍未達到預定富聚度，則調整無血清培養(yǎng)的時間，重復以上相關步驟，直至達到預定富聚度，再用流式細胞儀分選已富聚的腫瘤干細胞備用。
總之，本發(fā)明克服了現(xiàn)有分離方法的存在的問題，首先通過Percoll分選或無血清培養(yǎng)，使乳腺癌中的腫瘤干細胞富聚，再通過流式細胞儀精分選，從而保證了分選的效率，經(jīng)過初步富聚后腫瘤干細胞相關亞群(SP細胞或CD44+CD24-/low細胞)比例可達25％以上，再經(jīng)過流式細胞儀精分選，腫瘤干細胞的純度可達到99％以上，從而為進一步研究乳腺癌干細胞的各種生物學特性提供條件。


下面結合附圖對本發(fā)明作進一步的說明。
圖1為本發(fā)明實施例一的檢測圖，反映通過Percoll分選，人乳腺癌細胞系MCF-7中腫瘤干細胞相關亞群(SP細胞)富集，比例已達25.23％。
圖2為本發(fā)明實施例二的檢測圖，反映通過無血清培養(yǎng)，人乳腺癌細胞系MDA-MB-231中的腫瘤干細胞相關亞群(CD44+CD24-/low細胞)富聚，比例已達到了29.35％。
具體實施例方式
實施例一本實施例按照以下步驟分離乳腺癌細胞系MCF-7中的腫瘤干細胞相關亞群1)將乳腺癌細胞系MCF-7用胰酶-EDTA消化成單細胞懸液。
2)配置六個不同密度Percoll分離液，密度分別為1.035g/ml、1.040g/ml、1.050g/ml、1.060g/ml、1.070g/ml、1.080g/ml，每個密度層2ml，按密度高低依次疊加，制成Percoll不連續(xù)密度梯度分離液。
3)將制備好的單細胞懸液仔細疊加到Percoll不連續(xù)密度梯度分離液頂端，2000轉/min離心30分鐘。
4)仔細吸出離心后Percoll分離液中分層的各亞群細胞，PBS洗兩遍備用。
5)上述分離出的各亞群細胞每個亞群各設實驗管和對照管，每管細胞數(shù)105個/ml，實驗管加入Hoechst 33342至終濃度為5μg/ml，對照管同時再加入Verapamil至終濃度為50μg/ml，37℃水浴90min，PBS洗2遍后用流式細胞儀檢測各亞群中SP細胞比例，發(fā)現(xiàn)第四層(D亞群)中SP細胞比例高達25％(參見圖1)。
6)流式細胞儀進一步分選D亞群中的腫瘤干細胞相關亞群(即SP細胞)備用。
實施例二本實施例按以下步驟分離乳腺癌細胞系MDA-MB-231中的腫瘤干細胞相關亞群1)將乳腺癌細胞系或原代乳腺癌組織消化成胰酶-EDTA單細胞懸液。
2)在DMEM/F12無血清培養(yǎng)液中添加EGF、bFGF、胰島素等生長因子，制備成無血清培養(yǎng)液。
3)將消化后的單細胞懸液置于無血清培養(yǎng)液中，培養(yǎng)3周時間。
4)將無血清培養(yǎng)3周后腫瘤干細胞已富聚的MDA-MB-231，用胰酶-EDTA消化成單細胞懸液。
5)將上述細胞懸液分為實驗管和對照管，每管細胞數(shù)106個/ml，實驗管中加入CD44-FITC、CD24-PE，對照管中不加，室溫下避光保存20min，PBS洗2遍后用含1％多聚甲醛的PBS液400ul重懸固定細胞，流式細胞儀檢測腫瘤干細胞相關亞群(即CD44+CD24-/low細胞)含量已達近30％(參見圖2)。
6)流式細胞儀進一步分選上述已富聚的腫瘤干細胞相關亞群(CD44+CD24-/low)。
以上實施例的方法綜合了現(xiàn)有分離方法的優(yōu)點，切實可行，可以保證分選后腫瘤干細胞(SP細胞或CD44+CD24-/low細胞)純度達到99％以上。
權利要求
1.一種乳腺癌干細胞分離方法，包括以下步驟1)將乳腺癌細胞系或原代乳腺癌組織消化成單細胞懸液；2)按預定密度和層數(shù)配置不同密度Percoll分離液，按密度高低依次疊加，制成Percoll不連續(xù)密度梯度分離液；3)將消化后的單細胞懸液疊加到Percoll不連續(xù)密度梯度分離液頂端，離心分離；4)吸出離心后Percoll分離液中分層的各亞群細胞，PBS洗；5)將分離出的各亞群細胞中每個亞群各設實驗管和對照管，實驗管和對照管分別加入Hoechst 33342以及Hoechst 33342、Verapamil至預定終濃度，水浴并PBS洗后，用流式細胞儀檢測出腫瘤干細胞比例最高的亞群；6)如該腫瘤干細胞比例最高的亞群達到預定的富聚度，則用流式細胞儀分選備用；7)如該腫瘤干細胞比例最高的亞群未達到預定的富聚度，則調整Percoll分離液的密度，重復以上相關步驟，直至篩選出腫瘤干細胞達到預定富聚度的Percoll分離液密度，再用流式細胞儀分選已富聚亞群中的腫瘤干細胞備用。
2.根據(jù)權利要求1所述乳腺癌干細胞分離方法，其特征在于所述消化采用胰酶-EDTA實現(xiàn)。
3.根據(jù)權利要求1或2所述乳腺癌干細胞分離方法，其特征在于所述步驟2)配置四至八個不同密度Percoll分離液，各鄰近分離液密度差控制在分別為0.002g/ml-0.015g/ml。
4.根據(jù)權利要求1或2所述乳腺癌干細胞分離方法，其特征在于所述步驟2)配置六個不同密度Percoll分離液，密度分別為1.035g/ml、1.040g/ml、1.050g/ml、1.060g/ml、1.070g/ml、1.080g/ml，每個密度層2ml，按密度高低依次疊加，制成Percoll不連續(xù)密度梯度分離液。
5.根據(jù)權利要求4所述乳腺癌干細胞分離方法，其特征在于所述步驟5)中每管細胞數(shù)105個/ml，實驗管加入Hoechst 33342至終濃度為5μg/ml，對照管同時再加入Verapamil至終濃度為50μg/ml，37℃水浴90min，PBS洗2遍后用流式細胞儀檢測各亞群中SP細胞比例。
6.一種乳腺癌干細胞分離方法，包括以下步驟1)將乳腺癌細胞系或原代乳腺癌組織消化成單細胞懸液；2)在無血清培養(yǎng)液中添加生長因子，制備成無血清培養(yǎng)液；3)將消化后的單細胞懸液置于無血清培養(yǎng)液中，培養(yǎng)預定時間；4)將經(jīng)培養(yǎng)富聚的腫瘤干細胞消化成單細胞懸液；5)將步驟4)的單細胞懸液分為實驗管和對照管，實驗管中加入CD44-FITC、CD24-PE，對照管中不加，PBS洗后用含多聚甲醛的PBS液重懸固定細胞，用流式細胞儀檢測經(jīng)無血清培養(yǎng)富聚后腫瘤干細胞的比例；6)如以上無血清培養(yǎng)后腫瘤干細胞含量達到預定富聚度，則用流式細胞儀分選備用；7)如以上無血清培養(yǎng)后腫瘤干細胞含量仍未達到預定富聚度，則調整無血清培養(yǎng)的時間，重復以上相關步驟，直至達到預定富聚度，用流式細胞儀分選處已富聚的腫瘤干細胞備用。
7.根據(jù)權利要求6所述乳腺癌干細胞分離方法，其特征在于所述消化采用胰酶-EDTA實現(xiàn)。
8.根據(jù)權利要求6或7所述乳腺癌干細胞分離方法，其特征在于所述步驟2)在DMEM/F12無血清培養(yǎng)液中添加EGF、bFGF、胰島素生長因子，制備成無血清培養(yǎng)液。
9.根據(jù)權利要求8所述乳腺癌干細胞分離方法，其特征在于所述步驟5)中每管細胞數(shù)106個/ml，實驗管中加入CD44-FITC、CD24-PE后，室溫下避光保存20min，PBS洗2遍后用含1％多聚甲醛的PBS液400ul重懸固定細胞，再用流式細胞儀檢測分選腫瘤干細胞相關亞群。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種乳腺癌干細胞分離方法，屬于腫瘤研究技術領域。該方法包括將癌細胞消化成單細胞懸液；配成Percoll不連續(xù)密度梯度分離液；疊加單細胞懸液；離心分離各亞群細胞；用實驗管和對照管對比檢測；調整Percoll分離液的密度，直至篩選出腫瘤干細胞相關亞群含量達到預定富聚度，再用流式細胞儀進一步精分選。本發(fā)明結合了現(xiàn)有分離方法的優(yōu)點，通過Percoll分選或無血清培養(yǎng)，使乳腺癌中的腫瘤干細胞富聚，再通過流式細胞儀精分選，從而保證了分選的效率。初步富聚后腫瘤干細胞比例可達25％以上，再進一步用流式細胞儀分選后純度可達到99％以上，從而為進一步研究乳腺癌干細胞的各種生物學特性提供條件。
文檔編號C12N5/095GK101050452SQ200710021078
公開日2007年10月10日 申請日期2007年3月27日 優(yōu)先權日2007年3月27日
發(fā)明者王水, 劉曉安, 許健, 凌立君 申請人:江蘇省人民醫(yī)院