專利名稱：：一種定點(diǎn)引入非天然氨基酸的突變尿酸氧化酶及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種新的尿酸氧化酶，其定點(diǎn)引入的非天然氨基酸肘疊氮基苯丙氨酸使其具有可以特異性的與相應(yīng)修飾劑相連的性質(zhì)。技術(shù)背景尿酸是鳥、爬行動(dòng)物和靈長類動(dòng)物，包括人體內(nèi)嘌呤代謝的產(chǎn)物。在大部分哺乳動(dòng)物中，尿酸進(jìn)一歩被尿酸氧化酶氧化成尿囊素。由于人的尿酸氧化酶基因產(chǎn)生了突變，編碼序列中被引入了提甜終止密碼子，因此不能表達(dá)尿酸氧化酶。-尿酸在體內(nèi)溶解度低，過量積累易導(dǎo)致高尿酸血癥的發(fā)生，甚至形成尿酸晶體，該晶體可沉淀在關(guān)節(jié)、皮膚和腎中，常可導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎(痛風(fēng))、腎衰竭、代謝性酸中毒和高鉀血癥等。目前治療用尿酸氧化酶僅在少數(shù)國家可用。歐洲自20世紀(jì)80年代起就已從黃曲霉中提取了尿酸氧化酶，并以商品名Uricozyme銷售上市。在歐洲此藥物被廣泛研究，臨床結(jié)果顯示病人在使用幾分鐘內(nèi)，體內(nèi)的尿酸水平迅速降低，同時(shí)，該藥物長期以來被用來治療與白血病化療有關(guān)的嚴(yán)重高尿酸血癥(Overling，F(xiàn).和Lang,J.M等，1974;Robert,A.,Corberand，J.和Regneir，C.等，1976)。'雖然黃曲霉尿酸氧化酶對治療在短暫化療過程中出現(xiàn)的急性高尿酸血癥有效，但對于治療復(fù)發(fā)性痛風(fēng)或痛風(fēng)石性痛風(fēng)存在缺點(diǎn)。由于該尿酸酶為外源性蛋白，多次注射后易導(dǎo)致體內(nèi)尿酸氧化酶抗體的產(chǎn)生，尿酸氧化酶功效迅速降低，并已發(fā)生了包括過敏性反應(yīng)在內(nèi)的嚴(yán)重反應(yīng)(Brogard等，1972;Montagnac和Schillinger,1990)。尿酸氧化酶的強(qiáng)抗原性和尿酸氧化酶的短循環(huán)半衰期可通過聚乙二醇(PEG)修飾來克服(Chen，R.H.等，1981;Nishimara,H.,Matsushima,A.和Inada,Y.等，1981;Savoca，K.V"Davis,F.R和Palczuk，N.C.，1984;Tsuji，J.等，1985)。PEG結(jié)合到蛋白質(zhì)后大大降低了被修飾蛋白質(zhì)的抗原性。Davis等用PEG-尿酸氧化酶治療病人，血清中尿酸含量在注射后60分鐘內(nèi)下降到不能檢測的水平，且在32小時(shí)內(nèi)保持不可檢測水平。Davis等注意到PEG-5，000尿酸氧化酶在治療高尿酸血癥中提供了優(yōu)于天然尿酸氧化酶的潛力。Williams在專利聚乙二醇或聚環(huán)氧乙烷-尿酸氧化酶結(jié)合物及其應(yīng)用(US6,576,235)中提及了用PEG修飾尿酸氧化酶得到的結(jié)合物'該結(jié)合物相對于未結(jié)合的尿酸氧化酶仍保留至少約75%的裂解尿酸的活性，并且該結(jié)含物基本上沒有免疫原性。但現(xiàn)有的PEG修飾尿酸氧化酶方法均是針對某些氨基酸通過非定點(diǎn)修飾獲得，采用此技術(shù)進(jìn)行修飾，其修飾位點(diǎn)無法選擇，所得修飾產(chǎn)物為混合物(包括多修飾物和單修飾物多個(gè)異構(gòu)體)，各修飾產(chǎn)物結(jié)構(gòu)相似，分離純化十分困難。并且，有些活性中心的氨基酸被修飾，影響修飾產(chǎn)物的活性。因此近年來定點(diǎn)修飾成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和重要研究方向，有人曾嘗試通過選擇蛋白質(zhì)中含有巰基的半胱氨酸作為修飾位點(diǎn)來達(dá)到定點(diǎn)修飾的目的，但由于該類氨基酸在蛋白質(zhì)折疊過程中起重要作用，常位于活性中心，針對此類氨基酸的修飾常會(huì)降低被修飾蛋白生物活性。也曾有人嘗試?yán)冒被Ｗo(hù)劑將蛋白質(zhì)中能與PEG反應(yīng)的賴氨酸￡氨基等封閉，用具有與ot氨基優(yōu)勢反應(yīng)的PEG修飾劑進(jìn)行N端的氨基修飾，再將氨基保護(hù)劑去除，得到N端PEG修飾的蛋白質(zhì)衍生物。但反應(yīng)過程復(fù)雜，對實(shí)驗(yàn)條件要求高，不適于活性位點(diǎn)在N端的蛋白質(zhì)。大多數(shù)己知生物的基因編碼二十種常見氨基酸以合成生物所必霜的蛋白質(zhì)。普通氨基酸的側(cè)鏈僅含有少量的功能基團(tuán)，羧酸、氨基、羥基和巰基，其余就是更為簡單的烷基或疏水基團(tuán)。用基因工程手段擴(kuò)大編碼氨基酸的范圍，如光活性氨基酸一對疊氮基苯丙氨酸可以擴(kuò)大蛋白質(zhì)的應(yīng)用范圍。疊氮基團(tuán)在天然蛋白質(zhì)中不存在，它們可參與一系列的化學(xué)反應(yīng)，疊氮基團(tuán)可與炔基形成穩(wěn)定的偶聯(lián)結(jié)構(gòu)。從而提供了新的蛋白質(zhì)修飾方法。到目甜為止，還沒有定點(diǎn)引入疊氮基團(tuán)的尿酸氧化酶的報(bào)道，本發(fā)明提供了定點(diǎn)引入對疊氮基苯丙氨酸的尿酸氧化酶，并提供了得到這種突變尿酸氧化酶的方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明總的目的是提供了一種新型的定點(diǎn)引入非天然氨基酸的突變尿酸氧化酶及其制備方法，該尿酸氧化酶的特征為所述的突變尿酸氧化酶中某一個(gè)或幾個(gè)位點(diǎn)氨基酸定點(diǎn)突變?yōu)閷ΟB氮基苯丙氨酸，該疊氮基團(tuán)使其可以特異性的與相應(yīng)的修飾劑相連。本發(fā)明提供了一種可由大腸桿菌中重組表達(dá)的，定點(diǎn)引入非天然氨基酸的突變尿酸氧化酶，該尿酸氧化酶保留了天然尿酸氧化酶的催化活性。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，通過構(gòu)建pACYC-tRNA禾QpBR-T10兩種質(zhì)粒，分別表達(dá)MeAa"ococcws/a""oscM屬的tRNA(tRNATyf)和酪氨酰tRNA合成酶.(MjTyrils)，利用這一套蛋白質(zhì)翻譯系統(tǒng)使非天然氨基酸摻入到蛋白質(zhì)中，從而造成蛋白質(zhì)的定點(diǎn)突變。突變型MjTyrRs以及tRNATyr之間滿足下列關(guān)系(.1)tRNATyr不能利用宿主菌的酪氨酰tRNA酶，只能被突變型MjTyrRs酰化；(2)突變型MjTyrRs只能?；痶RNATyf，不能?；渌膖RNA。因此，突變型MjTyrRs與tRNATyf之間的關(guān)系是.IK交性的。這種正交性的酶并且是只有這種酶可以把非天然氨基酸酰化到這種IE交性的tRNA上，并且只能?；@種tRNA，而不能?；渌膖RNA。獲得的正交酪氨酰tRNA合成酶/tRNA系統(tǒng)(orthogonalaminoacyl~~tRNAsynthetase/tRNApair)，使非20種常見氨基酸的對疊氮基苯丙氨酸與琥珀密碼子TAG相對應(yīng)，從而將非天然氨基酸定點(diǎn)引入到尿酸氧化酶蛋白中。通過將帶有琥珀密碼子的尿酸氧化酶基因插入到|)ACYC-tRNA質(zhì)粒中，與pBR-T10—起轉(zhuǎn)染大腸桿菌工程菌，即可通過在發(fā)酵液中添加對疊氮基苯丙氨酸獲得突變尿酸氧化酶。在其后的SDS-PAGE和WesternBlotting檢測中，技術(shù)人員可以看到，當(dāng)上述正交系統(tǒng)條件齊備時(shí)，可以獲得突變尿酸氧化酶，而當(dāng)條件缺失時(shí)，工程菌無法表達(dá)尿酸氧化酶。本發(fā)明提供了5種選優(yōu)的突變尿酸酶，Uox'",Uox，Uox，Uox即，Uox即瓜加分別在標(biāo)注位點(diǎn)引入了對疊氮基苯丙氨酸，并對其活性進(jìn)行了比較，這5種選優(yōu)突變尿酸氧化酶保留了天然尿酸氧化酶90%以上的催化活性。圖1顯示的是突變尿酸酶工程菌發(fā)酵液純化后的SDS-PAGE楡測，用于鑒定表達(dá)的尿酸氧化酶。圖中1-9號(hào)電泳道分別對應(yīng)1:pACYC-tRNA-Uox+pBR-Tl02:pACYC-tRNA-Uox+NrPhe3:pBR-TIO+NrPhe4:天然尿酸氧化酶5:Uox1236:Uox'707:Uox2658:UOXU3l7D9:Uox123''265,9種不同的工程菌發(fā)酵情況。其中，第l道未添加NrPhe,第2道工程菌中不含有pBR-T10質(zhì)粒，第3道工程菌中不含有pACYC-tRNA-Uox質(zhì)粒，來源于野生型的尿酸氧化酶為第4道作為陽性對照。5-9道為5種不同的突變尿酸氧化酶。從圖中可以看到只有當(dāng)pACYC-tRNA-Uox,pBR-T10與N3-Phe三者同時(shí)具備時(shí)才能表達(dá)突變尿酸氧化酶，缺一不可。'圖2顯示的是突變尿酸氧化酶的WesternBlotting鑒定，野生型尿酸氧化酶為1道作為陽性對照。2-6到為5種不同的突變尿酸氧化酶。具體實(shí)施方式實(shí)施例1實(shí)施步驟1對疊氮基苯丙氨酸的合成對硝基苯丙氨酸一水合物適量溶于水與等體積二氧六環(huán)的混合溶液中，反應(yīng)體系溫度降至4t:。緩慢滴加三乙胺，再一次性加入(Boc)2()(二碳酸二叔丁酯)適量，先于o4r反應(yīng)30min，再于常溫下反應(yīng)過夜。反應(yīng)停止后，蒸發(fā)溶劑，加水稀釋，一倍體積乙醚洗一次。再加入檸檬酸溶液調(diào)節(jié)pH至酸性。用乙酸乙酯充分萃取，合并有機(jī)相，MgS04充分干燥，有機(jī)相濃縮得黃色粘稠液體，加石油醚冰浴重結(jié)晶，得到白色針晶。將6.2g該白色結(jié)晶溶于150ml甲醇溶液中，常溫下，鈀一活性C氫化3-6小時(shí)。蒸發(fā)溶劑得微黃色固體，用乙酸乙酯一石油醚重結(jié)晶。結(jié)晶溶于HCl-甲醇(摩爾比l:1)的水溶液中，用亞硝酸鈉與上述混合液反應(yīng)30-50分鐘得到重氮鹽。緩慢滴加NaN3的水溶液，保持0。C，繼續(xù)反應(yīng)30-50分鐘。乙酸乙酯提取分離。有機(jī)相濃縮后呈深紅色粘稠液體。上述粘稠液體溶于稍過量的含1.5NHC1的乙酸乙酯中，05t:反應(yīng)l-2小時(shí)后，過濾獲得鹽酸鹽結(jié)晶。分別用乙酸乙酯和二乙基醚洗漆，干燥，產(chǎn)物溶于水中，用稍過量的吡啶處理，于05i:，分離結(jié)晶，再用少量的水洗，干燥。實(shí)施步驟2尿酸氧化酶非天然氨基酸的定點(diǎn)引入構(gòu)建質(zhì)粒pACYC-t脂A和pBR-T10，二者分別表達(dá)M"/ia"ocaccwsj'fl""aycto'屬的tRNA和酪氨酰tRNA合成酶(在Tyr32、Glul07、Aspl58、Hel59、Leul62五個(gè)位點(diǎn)發(fā)生突變，分別突變?yōu)門hr32、Serl07、Pro158、Leul59、Glnl62)。該正交的酪氨酰tRNA合成酶/tRNA系統(tǒng)可使對疊氮基苯丙氨酸與琥珀密碼子TAG相對應(yīng)，利用PCR定點(diǎn)突變技術(shù)，將天然尿酸氧化酶基因第123位，第170位，第265位氨基酸密碼子突變?yōu)殓杲K止子TAG，構(gòu)建了UOXl23，Uoxl7G，UOX265，UOXl2;M7()，UOX123'17Q'265五種突變尿酸氧化酶基因，將它們分別插入至pACYC-tRNA中構(gòu)建尿酸氧化酶表達(dá)質(zhì)粒pACYC-tRNA-Uox。將pACYC-tRNA-Uox與pBR-T10兩個(gè)質(zhì)粒同時(shí)轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21亞型，在含有甘油、亮氨酸、組氨酸和對疊氮基苯丙氨酸的培養(yǎng)基中37。C培養(yǎng)12-16h，用lmMIPTG誘導(dǎo)8-10h收菌。實(shí)施步驟3含有非天然氨基酸尿酸氧化酶的分離純化含有突變尿酸氧化酶的發(fā)酵菌液離心后，加入超聲緩沖液進(jìn)行超聲破碎，離心得上清液通過Ni柱進(jìn)行純化，咪唑洗脫，收集尿酸氧化酶活性部分。表達(dá)產(chǎn)物純化后，利用SDS-PAGE進(jìn)行檢頂ij，圖1結(jié)果表明，當(dāng)缺少pACYC-tRNA-Uox,pBR-TIO，對疊氮基苯丙氨酸(N3-Phe)其中任意一種時(shí)，沒有突變蛋白質(zhì)表達(dá)，在三者齊備的情況下，有突變尿酸氧化酶表達(dá)。證明對疊氮基苯丙氨酸被特異性的引入尿酸氧化酶中。實(shí)施步驟4含有非天然氨基酸尿酸氧化酶的鑒定對UOX123,UOXm,UOX265,UOX123'17Q,UOX123''7()'265五種突變尿酸氧化酶進(jìn)行WesternBlotting檢測尿酸氧化酶進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，將凝膠和硝酸纖維素臃夾在濾紙中間，浸泡在轉(zhuǎn)移裝置的緩沖液中進(jìn)行電轉(zhuǎn)移，電轉(zhuǎn)移條件是30mA，4h。把硝酸纖維素濾膜放在培養(yǎng)皿中，加入封閉液(5WBSA的TBS緩沖液)，于搖床上室溫放置一小時(shí)。倒掉封閉液，用TBS漂洗液濾膜3次，每次10min。兔抗尿酸氧化酶血清與濾膜溫育，室溫一小時(shí)。再用TBS漂洗液洗膜3次，每次10min。加入用封閉液配制的二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體)，搖床上緩慢搖動(dòng)，室溫一小時(shí)。倒掉二抗溶液，用PBST漂洗液濾膜3次，每次10min。加入底物溶液DAB顯色。圖2的結(jié)果表明，WesternBlotting檢測證明了表達(dá)產(chǎn)物為突變后的尿酸氧化酶。實(shí)施步驟5尿酸氧化酶活性檢測采用改進(jìn)的尿酸氧化酶活性測定方法純化的尿酸氧化酶(約0.04嗎)于96孔板30'C孵育，緩沖液為Tris-HCl緩沖液，并與lml新鮮配制的pH8.9，濃度為200600,的尿酸溶液混合。分別在尿酸氧化酶加入后的1，4，7，10，13和16分鐘，從中取lOOpl，加入到含有l(wèi)OOpl過氧化物酶定量檢測溶液的96孔板中。過氧化物酶定量檢測溶液中包括pH6，0.2M磷酸鈉，lmM的3，5-二氯-2-羥基苯磺酸，0.25mM的4-磷酸鈉，0.25mM4-氨基安替比林，lmM8-乙酰嘩胺黃嘌呤，25U/ml辣根過氧化酶。檢測510nm處的吸收。每種條件測兩個(gè)平行值。反應(yīng)初速度由反應(yīng)的線性范圍得到。尿酸氧化酶氧化產(chǎn)生的H202由標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得。表1的結(jié)果表明，五種不同的突變尿酸氧化酶保留了天然尿酸氧^1酶大于等于90%的活性。表l、天然尿酸氧化酶與突變尿酸氧化酶活性比較<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>權(quán)利要求1.一種定點(diǎn)引入非天然氨基酸的突變尿酸氧化酶，其特征為所述的突變尿酸氧化酶中某一個(gè)或幾個(gè)位點(diǎn)氨基酸定點(diǎn)突變?yōu)榉翘烊话被幔渲兴龅亩c(diǎn)突變位點(diǎn)分別為第123位，第170位，第265位，所述的突變尿酸氧化酶保留了尿酸氧化酶的天然催化活性。2.根據(jù)權(quán)利要求l，其中所述的非天然氨基酸為對疊氮基苯丙氨酸。全文摘要概括的說，本發(fā)明涉及保留催化活性的、某些位點(diǎn)突變?yōu)榉翘烊话被岬哪蛩嵫趸傅鞍住＞唧w地說，本發(fā)明涉及被賦予了新的化學(xué)性質(zhì)的尿酸氧化酶，其含有的非天然氨基酸對疊氮基苯丙氨酸使其可以特異性的與相應(yīng)的修飾劑相連。文檔編號(hào)C12N9/04GK101265467SQ20071002058公開日2008年9月17日申請日期2007年3月13日優(yōu)先權(quán)日2007年3月13日發(fā)明者姚文兵,蕾才,方正之,陳明杰,高向東申請人:中國藥科大學(xué)