兩株可穩(wěn)定傳代并保持原特性的乳腺癌干細胞系及其分離方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
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[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物領(lǐng)域，具體涉及兩株可穩(wěn)定傳代并保持原特性的乳腺癌干細胞系及其分離方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
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[0002]乳腺癌是女性第一大惡性腫瘤，發(fā)病率逐年增高。據(jù)美國癌癥協(xié)會(ACS) 2012年數(shù)據(jù)統(tǒng)計，美國新增診斷病例23萬，增長了 29%，死亡病例4萬，增長14%。我國隨著生活方式改變，城市化進程加快，以及乳腺鉬靶X線檢查的推廣，每年新檢測出的病例逐年上升，中國上海乳腺癌發(fā)病率由1972年的17/10萬升至2007年的69.22/10萬。同時，中國乳腺癌的發(fā)病情況相對于西方國家呈現(xiàn)出年輕化的特征。大多數(shù)西方國家乳腺癌的發(fā)病高峰年齡出現(xiàn)在60歲以后。在中國，乳腺癌的發(fā)病高峰年齡則出現(xiàn)在45-50歲左右，提前了10至15年。其病理類型更趨向侵襲能力強的類型，愈后更差。地區(qū)分布上，患病率城市高于農(nóng)城，經(jīng)濟發(fā)達地區(qū)高于經(jīng)濟落后地區(qū)。隨著社會老年化，乳腺癌患者人數(shù)將更多，預計2011年我國乳腺癌新發(fā)病例110萬，2021年達250萬。這意味著在我國，乳腺癌已經(jīng)嚴重危害了廣大處于事業(yè)和家庭巔峰時期的女性的生命和生活，成為威脅女性健康的“首要殺手”。其對人類健康的嚴重危害已引起了世界衛(wèi)生組織和醫(yī)療界人士的高度重視。腫瘤干細胞具有干細胞特性，能進行自我更新和多向分化，對腫瘤的形成、生長、耐藥、復發(fā)和轉(zhuǎn)移起著決定性的作用，是腫瘤治療的難點所在。具有自我更新和分化能力，在不斷分裂過程中更有可能獲得多次突變的機會而變成惡性繁殖的腫瘤細胞，從而產(chǎn)生腫瘤。而這些腫瘤干細胞又與腫瘤的耐藥、復發(fā)和轉(zhuǎn)移息息相關(guān)。因此，殺滅腫瘤干細胞已成為一種新的腫瘤治療策略。然而，據(jù)我們所知，目前尚無任何實驗室建立起可穩(wěn)定傳代的臨床來源的乳腺癌干細胞系，故爾，迫切需要建立起臨床來源的可穩(wěn)定傳代的乳腺癌干細胞系并應(yīng)用于臨床及科學研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

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[0003]本發(fā)明的第一個目的是提供兩株可穩(wěn)定傳代并保持原特性的乳腺癌干細胞系，其特征在于，是通過以下方法分離得到的:
[0004](1)、取用剛切除的乳腺癌腫瘤標本，先經(jīng)膠原酶消化處理，再過濾；
[0005](2)、流式細胞儀分選出⑶44+，⑶24和ALDH1 +的細胞，調(diào)節(jié)要求細胞純度在98%以上；
[0006](3)、配置乳腺癌干細胞培養(yǎng)劑，將步驟(2)中分選出的細胞經(jīng)單克隆篩選后接種于含有乳腺癌干細胞培養(yǎng)劑的超低粘附的培養(yǎng)皿中，在原代培養(yǎng)中加入青霉素及鏈霉素雙抗，于C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)即得到兩株可穩(wěn)定傳代并保持原特性的乳腺癌干細胞系，分別命名為XM322 和 XM607。
[0007]步驟(1)所述的經(jīng)膠原酶消化處理，優(yōu)選使用膠原酶III，每毫升組織液中加入250單位膠原酶III，再置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時。
[0008]步驟(1)所述的過濾，優(yōu)選使用40mm濾網(wǎng)進行過濾。
[0009]步驟⑵所述的乳腺癌干細胞培養(yǎng)劑，優(yōu)選，其配方為:在無血清DMEM-F12中加入10ng/mL堿性成纖維生長因子、20ng/mL表皮生長因子、2% B27及5ug/mL胰島素。
[0010]步驟(2)所述的單克隆篩選，優(yōu)選方法為:按重度1:2有限稀釋法稀釋至單一細胞，并將細胞分散滴加于96孔板中，顯微鏡下觀察確認為單一細胞者進一步培養(yǎng)。
[0011]步驟(3)中所述的青霉素，其添加量優(yōu)選為100U/mL，所述的鏈霉素，其添加量優(yōu)選為 0.lmg/mL。
[0012]步驟(3)所述的C02培養(yǎng)箱，優(yōu)選為5% C0 2培養(yǎng)箱。
[0013]所述的流式細胞儀分選出⑶44+，⑶24和ALDH1 +的細胞按現(xiàn)有技術(shù)常規(guī)操作。
[0014]本發(fā)明的第二個目的是提供兩株可穩(wěn)定傳代并保持原特性的乳腺癌干細胞系在制備治療乳腺癌藥物中的應(yīng)用。
[0015]通過基因芯片技術(shù)，測定其microRNAs的表達，并與乳腺上皮細胞系及乳腺癌細胞系的microRNAs的表達情況進行比較，測定良性(乳腺上皮細胞系)與惡性(乳腺癌細胞系和乳腺癌干細胞系)的表達差異，探索應(yīng)用乳腺癌干細胞應(yīng)用中可能的干擾microRNAs，測定其最低表達的microRNA為miR_34a。結(jié)合專利申請201210064390.X中的高效特異性擴增系統(tǒng)“VISA”(VP16-GAL4-WPRE integrated systemic amplifier)，并成功應(yīng)用于乳腺癌治療的質(zhì)粒T-VISA-miR-34a。使用T-VISA-miR-34a進行治療乳腺癌干細胞后，基因芯片發(fā)現(xiàn)其cDNA改變情況，并結(jié)合DAVI網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫測定其可能的治療通路。進一步通過體內(nèi)體外試驗，測定構(gòu)建的治療質(zhì)粒T-VISA-miR-34a對乳腺癌干細胞系的治療效果和治療機制。本發(fā)明的藥物T-VISA-miR34a脂質(zhì)體對乳腺癌干細胞系及乳腺癌細胞系具有高效長時間的殺滅能力，而對正常細胞無殺滅作用，對機體高度安全。
[0016]本發(fā)明建立的兩株乳腺癌干細胞系(XM322和XM607)，具有穩(wěn)定的可反復傳代的，及腫瘤癌干細胞的特性。兩株乳腺癌干細胞均連續(xù)培養(yǎng)4年多，并連續(xù)傳20代以上。在連續(xù)傳代過程中，兩株細胞均保持著干細胞成球、自我更新、⑶44+⑶24 /lowLin ALDH1+表型、多潛能分化、體外軟瓊脂成瘤能力、裸鼠體內(nèi)成瘤能力、裸鼠體內(nèi)成瘤多潛能分化能力。
[0017]本發(fā)明的兩株臨床來源可反復傳代的乳腺癌干細胞系已穩(wěn)定地建立，在探索其應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，microRNA-34a的低表達是最有意義的，通過構(gòu)建TV_miR-34a脂質(zhì)體能安全有效地殺滅乳腺癌干細胞，機制研究發(fā)現(xiàn)其通過microRNA-34a-CTNNBl-survivin通路起作用。因此，建立的穩(wěn)定傳代的乳腺癌干細胞系將在消滅乳腺癌的研究中起到巨大的作用，并具有廣闊的前景。
【附圖說明】
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[0018]圖1是兩株臨床來源的乳腺癌干細胞的成球及體外自我更新能力，標尺為250 μ m ；；
[0019]圖2是兩株臨床來源的乳腺癌干細胞的⑶44+⑶24 /lowLin ALDH1+表型；
[0020]圖3是乳腺癌干細胞在體外具有多潛能分化的能力；
[0021]圖4是乳腺癌干細胞的體內(nèi)成瘤能力；
[0022]圖5是乳腺癌干細胞的體內(nèi)保持可傳代的腫瘤干細胞能力，標尺為100 μπι ;
[0023]圖6是乳腺癌干細胞的體內(nèi)保持多潛能分化能力，標尺為50 μm ;
[0024]圖7是TV-miR_34a體外可有效地消滅綠色熒色蛋白標記的乳腺癌干細胞，標尺為50 μ m ；
[0025]圖8是樣本RNA提取質(zhì)量監(jiān)測散點圖(火山圖)；
[0026]圖9是基因芯片測定的良性乳腺上皮細胞系與惡性乳腺細胞系(乳腺癌干細胞系及乳腺癌細胞系)的microRNAs表達差異；
[0027]圖10是TV_miR-34a作用于乳腺癌干細胞系后的基因表達差異情況；
[0028]圖11是表達差異基因經(jīng)DAVI因絡(luò)數(shù)據(jù)庫分析其可能的作用通路；
[0029]圖12是構(gòu)建的T-VISA_miR34a質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖。
【具體實施方式】
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[0030]以下實施例是對本發(fā)明的進一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。以下實施例中的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。以下實施例中的實驗材料如無特殊說明，均是從常規(guī)的生化試劑公司購買所得到。
[0031]實施例1:
[0032]—、分離培養(yǎng)臨床來源的可穩(wěn)定傳代并保持原特性的乳腺癌干細胞系
[0033](1)、取用剛切除的乳腺癌腫瘤標本，每毫升組織液中加入250單位膠原酶III，再置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時消化處理，再使用40mm濾網(wǎng)進行過濾；
[0034](2)、流式細胞儀(Cytomics FC 500)分選出CD44+，CD24和ALDH1 +的細胞，調(diào)節(jié)要求細胞純度在98%以上(CD44和CD24抗體來自Cell Signaling公司；ALDH1抗體來自Technologies 公司)；
[0035](3)、配置乳腺癌干細胞培養(yǎng)劑:在無血清DMEM-F12 (購自Invitrogen公司)中加入10ng/mL堿性成纖維生長因子(購自Invitrogen公司)、20ng/mL表皮生長因子(購自 Invitrogen)、2% B27 (購自 Invitrogen 公司)及 5ug/mL 膜島素(購自 NovoNordisk 公司)，將步驟(2)中分選出的細胞經(jīng)單克隆篩選(按重度1:2有限稀釋法稀釋至單一細胞，并將細胞分散滴加于96孔板中