本發(fā)明屬于銀杏茶飲料技術領域，尤其涉及一種提高適口性和保健功效的銀杏茶飲料及其制備方法和應用。

背景技術：

茶飲料在國際上被稱為“新時代飲料”。其特點是天然、保健且能解渴，符合現代人崇尚天然、追求健康保健的消費心理需求。

銀杏茶飲料是以銀杏葉為原料制成的保健茶飲料，自上世紀90年代初逐漸興起，在多個國家和地區(qū)均有銷售。銀杏茶含有豐富的蛋白質、氨基酸、礦物質和維生素等多種營養(yǎng)成分，有助于增強人體體力，提高免疫功能，而且銀杏葉中富含黃酮和內酯類活性物質，因此，銀杏茶還具備一定的抗氧化、抗炎、抗腫瘤、防治心腦血管疾病等功效。目前市場上的銀杏茶類產品均存在一些共同的問題：茶葉沖泡后茶水香氣淡，味苦澀，適口性不好，而且銀杏葉中固有的有效成分不能得到充分釋放，生物利用度也不高。

為了有效提高銀杏葉中有效活性成分的溶出率，銀杏茶飲品在制備過程中，通常采用較高溫度浸提。但目前大多數生物酶都存在不耐熱和穩(wěn)定性差的問題，在特別是高溫下很容易失活，因此，銀杏茶飲品的制備過程中使用的酶要具有耐高溫的優(yōu)良性能。

技術實現要素：

解決的技術問題：本發(fā)明提供了一種操作簡單，能夠提高銀杏茶適口性、有效成分浸出率、抗氧化、抗炎和抗腫瘤活性的銀杏茶飲料及其制備方法和應用。

技術方案：一種提高適口性和保健功效的銀杏茶飲料的制備方法，在銀杏茶飲料制備過程中的浸提步驟，添加β-葡萄糖苷酶和α-l-鼠李糖苷酶。

上述β-葡萄糖苷酶是經微生物發(fā)酵或重組菌表達并純化制得；α-l-鼠李糖苷酶是經微生物發(fā)酵或重組菌表達并純化制得。

優(yōu)選的，上述β-葡萄糖苷酶優(yōu)選來源于嗜熱菌thermotogapetrophiladsm13995。

優(yōu)選的，上述α-l-鼠李糖苷酶優(yōu)選來源于土曲霉aspergillusterreusccf3059。

具體制備方法為：將商品化的銀杏茶或銀杏葉按1wt.％-5wt.％比例在80～95℃水中保溫浸提10-15min，依次加入β-葡萄糖苷酶和α-l-鼠李糖苷酶，用酶量分別為7.5u/ml和2u/ml，保溫10-40min；過濾除渣，收集濾液，調配，超濾，灌裝，封口，殺菌，獲得茶飲料。

所述方法制備得到的銀杏茶飲料。

所述銀杏茶飲料在制備清除體內自由基、防治炎癥或阻止惡性細胞增殖產品中的應用

作為本發(fā)明的銀杏茶飲品能夠有效抑制abts的氧化，抑制lps誘導的巨噬細胞炎癥，抑制肝癌和結腸癌細胞增殖。

有益效果：銀杏茶可浸出總黃酮含量約0.4～0.8％，總內酯含量約0.03～0.15％，特征香氣物質約占8～12％。作為本發(fā)明制備的銀杏茶飲品，具有銀杏黃酮浸出率高，香氣物質釋放量多，抗氧化、抗炎和抗腫瘤活性強的特點。本發(fā)明中運用生物酶制備銀杏茶飲品，總黃酮浸出率提高約38％，黃酮苷元的比例大幅提高，特征香氣物質的釋放量提高約264％。在同等飲用量下，本發(fā)明制備的銀杏茶飲品與不運用生物酶制備的銀杏茶飲品相比，抗氧化活、抗炎和抗腫瘤活性的分別可提高約59％、175％和160％。通過本發(fā)明技術可提升銀杏茶飲品的食用品質和保健功效，能顯著提高銀杏茶適口性、有效成分浸出率、抗氧化、抗炎和抗腫瘤活性。

附圖說明

圖1：銀杏茶飲品中總黃酮含量圖。

圖2：銀杏茶飲品中總內酯含量圖。

圖3：添加不同酶量后銀杏茶飲品浸出總黃酮的含量圖。

圖4：兩種糖苷酶的最適酶用量條件優(yōu)化結果圖。

圖5：兩種糖苷酶單獨添加、復合使用及添加順序對銀杏茶飲品浸出黃酮量的影響圖。

圖6：銀杏茶飲品添加糖苷酶沖泡前后抗氧化、抗炎和抗腫瘤活性的差異圖。

具體實施方式

下面結合附圖及具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。

本發(fā)明的目的在于提供一種通過添加復合糖苷酶制備銀杏茶飲品的方法，旨在改善銀杏茶適口性，增強銀杏茶的保健效果。

在本發(fā)明的實施例中，添加復合糖苷酶制備的銀杏茶飲品可浸出總黃酮約0.8％，釋放出的特征香氣物質約占35％。與不加復合糖苷酶制備的銀杏茶飲品相比，總黃酮浸出率提高約35％，黃酮苷元的比例大幅提高，特征香氣物質的釋放量提高約264％。

在本發(fā)明的實施例中，將銀杏茶按1％-5％比例在80～95℃中保溫浸提10-15min，依次加入β-葡萄糖苷酶和α-l-鼠李糖苷酶，用酶量分別為7.5u/ml和2u/ml，保溫10-40min。過濾除渣，收集茶水，調配，超濾，灌裝，封口，殺菌，獲得茶飲料。

在本發(fā)明實施例中，經添加糖苷酶后，銀杏茶水能夠更好地抑制abts的氧化，抑制lps誘導的巨噬細胞炎癥，抑制肝癌和結腸癌細胞增殖。

下面結合附圖及具體實施例對本發(fā)明的應用原理作進一步描述。

實施例1：

1.實驗目的

比較在銀杏茶飲品制備過程中，添加不同的糖苷酶后浸出茶水中活性成分含量。

2.實驗材料

2.1受試樣品

銀杏茶：產于湖北安陸。

2.2重組糖苷酶

β-葡萄糖苷酶：pet20b-tpebgl3(來源于gh3thermotogapetrophiladsm13995)；pet20b-tthbgl3(來源于gh3thermotogathermarumdsm5069)；ppiczαa-anibgl3(來源于gh3aspergillusnigernl-1)。

α-鼠李糖苷酶：ppiczαa-aterha78(來源于gh78aspergillusterreusccf3059)；pet20b-anirha78(來源于gh78aspergillusnigernl-1)；pet28a-bthrha(來源于bacteroidesthetaiotaomicronvpi5482)。

3.實驗方案

3.1β-葡萄糖苷酶的制備

3.1.1thermotogapetrophiladsm13995的培養(yǎng)

thermotogapetrophiladsm13995購于dsmz菌種保藏中心(www.dsmz.de)編號為13995。其培養(yǎng)基配方為：10g/l淀粉starch，5g/l蛋白胨tryptone，3g/l酵母提取物yeastextract，5g/l肉膏meatextract,10g/l2-馬啉乙磺酸(2-morpholinoethanesulfonic),10mg/lfeso4·7h2o,1mg/l刃天青resazurin，調整ph為7.2。用注射器按照0.5％接種量接種，85℃靜止培養(yǎng)24h，收集細胞。

3.1.2基因組dna的提取

(1)靜置培養(yǎng)thermotogapetrophiladsm13995約24小時，取30ml菌液4,000g離心10min收集細胞。

(2)用9.5mlte緩沖液重懸菌體，加入0.5ml10％十二烷基硫酸鈉(sds)和50μl蛋白酶k(20mg/ml)，混合均勻，37℃保溫1h。

(3)加入1.8ml5mol/lnacl，1.5ml十六烷基三乙基溴化銨(ctab)/nacl，混勻，65℃溫育20min。

(4)加入等體積氯仿/異戊醇，混勻，6,000g離心10min。

(5)為防止剪切力造成基因組dna斷裂，用粗口吸管將上清轉入另一離心管中，加入等體積酚/氯仿/異戊醇混勻，6,000g離心10min。

(6)另一離心管中，加入0.6倍體積異丙醇，輕輕晃動至白色絲狀dna沉淀清晰可見。

(7)用吸管將dna纏繞其上，在70％酒精中清洗。

(8)用無菌牙簽將dna從吸管上刮下，轉入1.5ml離心管中。

(9)室溫下風干，加500μlte緩沖液溶解。

(10)取50μl用核酸蛋白檢測儀檢測dna濃度。

3.1.3重組質粒pet-tpebgl3的構建

按照已知的thermotogapetrophiladsm13995耐高糖β-葡萄糖苷酶基因設計引物，引物由上海生物工程有限公司合成。p1：cgccatatgatgggaaagatcgatgaaa，含ndei位點。p2：ccgctcgagtggtttgaatctcttctct，含xhoi位點，并去除終止密碼子。以提取的thermotogapetrophiladsm13995的基因組dna為模板，用合成的引物進行pcr擴增，擴增的條件是95℃，5min；暫停計時，加pyrobest聚合酶，加40μl石蠟油密封；35次循環(huán)(94℃，50s；51℃，90s；72℃，1min)；72℃，10min；反應停止，4℃保溫。通過凝膠回收試劑盒對pcr擴增產物進行純化。得到thermotogapetrophiladsm13995耐高溫β-葡萄糖苷酶基因。

將得到的thermotogapetrophiladsm13995耐高溫β-葡萄糖苷酶基因和pet-20b分別用ndei和xhoi進行雙酶切，并分別割膠回收，濃縮后16℃連接過夜，將連接產物轉化大腸桿菌jm109感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆，進行序列分析；挑選序列正確的克隆提取質粒，獲得含有耐高糖β-葡萄糖苷酶基因的重組質粒pet-tpebgl3。

3.1.4重組耐高溫β-葡萄糖苷酶tpebgl3的制備

將重組質粒pet-tpebgl3-cbd轉化大腸桿菌jm109(de3)宿主菌(novagen)，在含有氨芐青霉素(50μg/ml)的lb平板(lb培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl5g/l，瓊脂15g/l)上經過37℃培養(yǎng)過夜，挑轉化子到200ml的lb培養(yǎng)基中(50μg/ml氨芐青霉素)37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)至od600為0.6時，加入終濃度為0.5mm異丙基β-d-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)誘導劑，30℃培養(yǎng)6h，用高速冷凍離心機將培養(yǎng)液在4℃下，以13,000rpm離心15min，收集菌體。

由于重組質粒pet-tpebgl3中含有his-tag標簽，通過hisbindpurificationkit(novagen)進行純化，得到純化的重組酶。具體操作過程：

a.樣品的處理

(1)將洗滌過的菌體，用1×bindingbuffer8ml重懸，超聲波破壁。

(2)破壁后，13,000g離心30min，取上清即為樣品。

b.處理柱子

(1)取1ml填料裝柱。

(2)用3ml的無菌水洗柱子。

(3)用5ml的1×chargebuffer洗柱子。

(4)用3ml的1×bindingbuffer洗柱子。

c.上樣

(1)將樣品加入柱子，控制流速約每分鐘6滴。

(2)用3ml1×bindingbuffer洗柱子，除去未結合的蛋白質。

(3)用4ml含有20mm咪唑的洗脫液洗柱子，除去雜蛋白。

(4)用80mmol/l咪唑的洗脫液洗柱子，將目的蛋白洗脫下來。

(5)用4ml1×stripbuffer洗柱子。

通過此過程可得到純化的重組β-葡萄糖苷酶tpebgl3。

3.1.5重組質粒ppiczαa-aterha78的構建

全基因合成并通過酵母密碼子偏好性優(yōu)化aspergillusterreusccf3059α-l-鼠李糖苷酶基因，將其連接到ppiczαa質粒上，獲得的重組質粒命名為ppiczαa-aterha78。

3.1.6重組α-l-鼠李糖苷酶的制備

提取重組質粒ppiczαa-aterha78，經sacⅰ線性化后，采用電轉化法將其導入pichiapastoriskm71h(novagen)中，篩選陽性克隆。接種在ypd培養(yǎng)基中進行活化后，轉入bmgy培養(yǎng)基中繼續(xù)活化，收集od600為2.0-3.0的菌體，轉入到bmmy培養(yǎng)基中，置于30℃，180rpm搖床進行α-l-鼠李糖苷酶的誘導表達。每隔24h按照體積比0.6％向誘導的菌液中補加無菌的甲醇，培養(yǎng)15天后離心取上清得粗酶液。

重組蛋白的純化：

(1)向粗酶液中加終濃度為80％的硫酸銨沉淀蛋白，離心棄上清，用ph7.550mmtris-hcl緩沖液溶解沉淀的蛋白；

(2)用ph7.550mmtris-hcl緩沖液于4℃下透析四次，每次8h，以去除鹽溶液；

(3)將透析后的酶液加到裝好的deaesff柱子中，用濃度20-300mm的nacl梯度洗脫；

(4)取合適濃度的nacl洗脫下的酶液，用ph6.510mmpb緩沖液于4℃下透析四次，每次8h，以去除鹽溶液得純酶。

3.2銀杏茶飲品的制備

取產地為湖北安陸的銀杏茶4g，精密稱定，裝入保溫杯，加入95℃開水200ml保溫15min，隨后依次添加β-葡萄糖苷酶7.5u/ml和α-鼠李糖苷酶2u/ml，繼續(xù)保溫30min。過濾除渣，收集茶水，超濾，殺菌，獲得茶飲料。同時設置不添加糖苷酶的對照。銀杏茶飲品的常規(guī)制備過程同上，但沒有添加糖苷酶過程，泡茶保溫時間為45min。

3.3銀杏茶香氣物質的提取和測定

銀杏茶保溫結束，過濾除渣，收集茶水，并快速將茶水轉移至分液漏斗中，蓋好塞子，保持密閉環(huán)境。待茶水冷卻，用乙醚萃取，于40℃沙浴上使乙醚揮發(fā)，直至溶劑不再減少，收集，備用。

氣相條件：色譜柱為tr-5ms毛細管柱，柱溫箱升溫程序：50℃保持2min，20℃/min升高至260℃，維持5min；進樣口分流，溫度為250℃，載氣：99.999％高純度氦氣，載氣流速為1ml/min。

質譜條件：ei離子源，離子源溫度為250℃，電離電壓為70ev，接口溫度為250℃，四級桿溫度為150℃。

3.4銀杏茶飲品中黃酮和內酯的含量測定

銀杏茶保溫結束，過濾除渣，收集茶水，用旋轉蒸發(fā)儀將水溶液蒸干，用適量甲醇溶解后均分兩份，一份直接用于hplc檢測，另一份經甲醇-25％鹽酸溶液(體積比4:1)混合液加熱酸水解后用于hplc檢測。使用agilent1260series高效液相色譜儀，分別檢測黃酮(紫外檢測器，uv)和內酯(蒸發(fā)光散射檢測器，elsd)。

4.實驗結果

4.1常規(guī)銀杏茶飲品中黃酮和內酯的含量測定

市場隨機購買4種品牌的銀杏茶或銀杏葉，按照3.2中的方法，將同一份茶葉沖泡3次后合并制備成銀杏茶飲品，并收集茶葉渣。參照2015版《中國藥典》中銀杏葉總黃酮和內酯的測定方法，分別檢測銀杏茶葉、茶水和茶葉渣中的總黃酮和內酯含量。結果如圖1和圖2所示，銀杏茶可浸出總黃酮含量約0.4～0.8％，總內酯含量約0.03～0.15％。按照3.3中的方法，測定茶飲品中香氣物質的組成及含量，結果如表1所示，銀杏茶飲品中的特征香氣成分約占8～12％。

表1銀杏茶飲品的特征香氣成分

4.2糖苷酶的篩選

生物酶具有較強的專一性，復合酶在水解過程中又具有協同作用，為比較不同來源的糖苷酶選擇性切斷糖苷鍵能力的大小，實驗選擇了含量較多的典型的黃酮類化合物蘆丁為底物。另一方面，銀杏茶飲品在制備過程中，通常采用較高溫度浸提。但目前大多數生物酶都存在不耐熱和穩(wěn)定性差的問題，特別是高溫下很容易失活，所以應優(yōu)選耐高溫的生物酶。為此，實驗比較在70℃、同等酶量的水相體系中，2.2中所述的6種糖苷酶將其轉化為槲皮素的轉化率。結果(表2)表明，選擇tpebgl3和aterha78用于銀杏茶飲品的制備可以實現最優(yōu)轉化效果。

表2兩種糖苷酶的組合將銀杏茶飲品中蘆丁轉化為槲皮素的轉化率

4.3添加tpebgl3和aterha78對銀杏茶浸出總黃酮含量的影響

在茶飲品的制備過程中，分別添加18u/mltpebgl3和5u/mlaterha78、90u/mltpebgl3和25u/mlaterha78，以不加tpebgl3和aterha78為空白對照，參照2015版《中國藥典》，對銀杏飲品的濃縮物進行酸水解，通過hplc檢測并計算各銀杏茶飲品中總黃酮的含量。結果(圖3)顯示，添加tpebgl3和aterha78制備的銀杏茶浸出總黃酮含量顯著提高。

4.4銀杏茶飲品制備過程中糖苷酶添加量的優(yōu)化

選定tpebgl3和aterha78用于銀杏茶飲品制備后，以苷元生成量為標準，優(yōu)化確定兩種糖苷酶的最適酶用量。參照2015版《中國藥典》中銀杏黃酮的測定方法，分別檢測銀杏茶飲品中銀杏黃酮的組成及含量。結果(圖4)表明，銀杏茶用量為2％時，β-葡萄糖苷酶tpebgl3的最適酶用量為7.5u/ml，α-鼠李糖苷酶aterha78的最適酶用量為2u/ml。

4.5單獨添加和同時添加tpebgl3和aterha78及其添加順序對銀杏茶飲品中銀杏黃酮含量的影響在茶飲品的制備過程中，分別單獨添加tpebgl3和aterha78，先添加tpebgl3后添加aterha78。以不加tpebgl3和aterha78為空白對照，參照2015版《中國藥典》，對銀杏飲品的濃縮物進行酸水解，通過hplc檢測并以黃酮苷元的生成量為標準，實驗結果表明(圖5)，添加兩種糖苷酶的效果顯著優(yōu)于僅添加一種糖苷酶，兩種酶的添加順序也對銀杏黃酮轉化有一定的影響，其中先添加tpebgl3后添加aterha78效果較好。

4.6添加糖苷酶后銀杏茶釋放的香氣物質的變化

針對銀杏茶香氣物質成分及含量的研究結果表明，添加tpebgl3(β-g)和aterha78(α-r)后，銀杏茶釋放出的特征香氣物質含量有所增加。如表3所示，添加兩種糖苷酶沖泡后，茶水中醛類香氣物質(如香草醛、對羥基苯甲醛等)以及醇類香氣物質(苯甲醇、對羥基苯甲醇、苯乙醇、對羥基苯乙醇等)的含量均有提高，銀杏茶釋放的特征香氣物質總量增加了2.64倍。

表3添加糖苷酶制備銀杏茶飲品對其中香氣成分的影響

實施例2

1.實驗目的

考察在銀杏茶制備過程中添加糖苷酶對茶飲品抗氧化、抗炎、抗腫瘤活性的改善情況。

2.實驗材料

2.1受試樣品

實施例1中提到的銀杏茶及添加tpebgl3和aterha78后制備的茶飲品。

2.2細胞

人肝癌細胞hepg2，小鼠結腸癌細胞ct26，鼠腹腔巨噬細胞raw264.7購于中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。hepg2和ct26選用dmem(含10％胎牛血清)培養(yǎng)基，raw264.7選用1640(含10％胎牛血清)培養(yǎng)基，于37℃、5％co2條件下培養(yǎng)。

3.實驗方案

3.1抗氧化活性檢測

參照碧云天公司總抗氧化能力檢測試劑盒(abts法)的說明，進行如下操作。配制abts工作液，向96孔板的每個檢測孔中加入200μlabts工作液?？瞻讓φ湛字屑尤?0μl蒸餾水；標準曲線檢測孔內加入10μl各種濃度的trolox標準溶液；樣品檢測孔內加入10μl不同稀釋倍數的銀杏茶水，輕輕混勻。室溫孵育2-6min后測定a734。以對照的a734為100％，計算各孔吸光值占對照的百分比數值。

3.2抗炎活性檢測

參照碧云天公司一氧化氮檢測試劑盒的說明，進行如下操作。取對數生長期raw264.7細胞，計數，以2×10⁵/ml的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100μl。培養(yǎng)24h后，以不同濃度的銀杏茶飲品及500ng/mllps處理細胞。實驗組每個濃度設3個復孔，以含dmso的培養(yǎng)液作對照。銀杏茶水濃縮液作用48h后，吸取細胞上清100μl至酶標板中，加入混勻后的griess試劑100μl，顯色10min后540nm處測吸光度。計算銀杏茶對raw264.7釋放no的抑制作用。

3.3抗腫瘤活性檢測

在96孔板中每孔接種3000個細胞，放入37℃培養(yǎng)，待細胞貼壁6h后，每孔加入不同濃度的銀杏茶飲品濃縮液培養(yǎng)72h，于實驗終點前4h向每孔加入20μlmtt(4mg/ml)，實驗終點時取出96孔板，于1000rcf離心，然后吸去上清，加入200μldmso，570nm處測吸光值。根據以下公式計算待測樣品對腫瘤細胞體外增殖的抑制率：

抑制率＝[100－(od570(實驗孔)－od570(空白對照))/(od(不加藥對照空)－od570(空白對照)×100]％

4.實驗結果

添加tpebgl3和aterha78制備后的銀杏茶抗氧化活性、抗炎活性和抗腫瘤活性均有所提高

分別收集不添加和添加糖苷酶制備的銀杏茶水，過濾除去雜質。將銀杏茶飲品及其適當稀釋后的樣品用于總抗氧化活性(abts法)的測定，將銀杏茶飲品濃縮到特定濃度后用于抗炎和抗腫瘤活性的測定。結果(圖4)顯示，銀杏茶水本身具有一定的抗氧化、抗炎和抗腫瘤活性，添加糖苷酶后制備的銀杏茶飲品，抗氧化、抗炎和抗腫瘤活性均得到不同程度的提高，且具有統計學意義。在同等飲用量下，本發(fā)明制備的銀杏茶飲品與不運用生物酶制備的銀杏茶飲品相比，抗氧化(1/4稀釋)、抗炎(1.3mg/ml)和抗腫瘤(6.4mg/ml)活性的分別可提高約59％、175％和160％。

結論

本發(fā)明實施例公開了一種提高銀杏茶飲品適口性和保健功效的制備方法。選用的兩種糖苷酶均為耐熱酶，在4g/200ml的泡茶體系中，β-葡萄糖苷酶tpebgl3的最適溫度為85℃，最佳酶用量為7.5u/ml；α-鼠李糖苷酶aterha78的最適溫度為65℃，最適酶用量為2u/ml。兩種酶共同添加可以大幅度提高茶浸出銀杏總黃酮、黃酮苷元和釋放出香氣物質的含量?；钚匝芯拷Y果表明，在銀杏茶制備過程中加入tpebgl3和aterha78可以提高其抗氧化、抗炎和抗腫瘤的保健功效。綜上結果表明，本發(fā)明采用的兩種耐熱糖苷酶制備銀杏茶飲品，操作簡單，功效顯著，為銀杏茶飲料的質量和功效提升提供了方法。

以上僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。

sequencelisting

<110>南京林業(yè)大學

<120>一種提高適口性和保健功效的銀杏茶飲料及其制備方法和應用

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