本發(fā)明屬于天然產物提取技術領域，具體涉及一種具有抑菌活性的菱角殼黃酮提取物及其制備方法和應用。
背景技術：
菱角既是傳統(tǒng)食品也是傳統(tǒng)的藥材，具有抗腫瘤、增強免疫力等保健功效。菱角廣泛種植于我國南方各省，菱角殼一般都作為廢棄物丟掉，其中大量的功效物質未得到利用，造成資源浪費和環(huán)境污染。菱角殼富含多酚、多糖、黃酮和生物堿等有效物質，功能物質制備開發(fā)極具市場前景。其中的菱角殼黃酮提取物具有較好的抗氧化、抑菌等效果。從菱角殼中獲取高效、經濟安全的天然抑菌成分，較傳統(tǒng)化學抑菌劑相比，來源廣泛，廉價，具有較好的開發(fā)前景。
有關菱角及其應用的報道和專利已有不少，但關于菱角殼黃酮提取物的研究報道和專利較少。通過文獻查閱，公開號為CN103689603A的中國專利公開了“一種富含膳食纖維和黃酮的泮塘五秀營養(yǎng)粉絲及其制備方法”，該專利涉及一種將源自茭白的優(yōu)良膳食纖維和源自菱角殼的黃酮類化合物同時加入營養(yǎng)粉絲中，獲得一種富含膳食纖維和黃酮的營養(yǎng)粉絲。公開號為CN105343141A的中國專利公開了“一種菱角殼提取物的咀嚼片的制備方法”，該專利涉及一種將菱角殼經水煮提取、濃縮后醇沉處理后，濃縮制得菱角殼提取物浸膏。將菱角殼提取物浸膏及輔料，制粒，干燥整粒后加入硬脂酸鎂制得咀嚼片。公開號為CN105147747A的中國專利公開了“一種菱角殼提取物的顆粒劑的制備方法”，該專利涉及將一種將水提、濃縮后的提取液，醇沉，取上清液濃縮制得菱角殼提取物浸膏。將菱角殼提取物浸膏和輔料經擠壓制粒，干燥后制得顆粒劑成品。該顆粒劑對小白鼠具有明顯的抗氧化、抗腫瘤、降糖及保肝護肝等藥理作用。
技術實現要素：
為解決現有技術的不足，本發(fā)明提供了一種具有抑菌活性的菱角殼黃酮提取物及其制備方法和應用。通過本發(fā)明的技術方案所得到的菱角殼黃酮提取物具有很好的抑菌效果，可作為天然抑菌劑應用于肉質食品加工。
本發(fā)明提供的技術方案如下：
一種具有抑菌活性的菱角殼黃酮提取物的制備方法，包括以下步驟：
1)提取
將菱角殼粉末進行乙醇溶液的浸提，分離得到提取液和菱角殼粉末，再對菱角殼粉末重復進行乙醇溶液的浸提1～2次，合并各次的提取液，過濾，減壓濃縮至無乙醇，得到菱角殼黃酮粗提液，其中：乙醇溶液的浸提為將菱角殼粉末與質量分數為50～80％的乙醇溶液按照重量比1:20～1:30混合，超聲處理，然后55～65℃恒溫浸提2～3小時；
2)吸附
調節(jié)所述菱角殼黃酮粗提液的濃度至3.0～10.0mg/mL，進行大孔吸附樹脂柱層析；
3)洗脫
吸附平衡后，以質量分數為60～80％的乙醇溶液為洗脫劑對大孔吸附樹脂柱進行洗脫，收集洗脫液；
4)濃縮
濃縮所述洗脫液，即得浸膏狀菱角殼黃酮提取物。
優(yōu)選的，具有抑菌活性的菱角殼黃酮提取物的制備方法包括以下步驟：
1)提取
將菱角殼粉末進行乙醇溶液的浸提，分離得到提取液和菱角殼粉末，再對菱角殼粉末重復進行乙醇溶液的浸提1～2次，合并各次的提取液，過濾，減壓濃縮至無乙醇，得到菱角殼黃酮粗提液，其中：乙醇溶液的浸提為將菱角殼粉末與質量分數為50～80％的乙醇溶液按照重量比1:20～1:30混合，超聲處理，然后55～60℃恒溫浸提2～3小時；
2)吸附
調節(jié)所述菱角殼黃酮粗提液的濃度至5.0～10.0mg/mL，進行大孔吸附樹脂柱層析；
3)洗脫
吸附平衡后，以質量分數為60～80％的乙醇溶液為洗脫劑對大孔吸附樹脂柱進行洗脫，收集洗脫液；
4)濃縮
濃縮所述洗脫液，即得浸膏狀菱角殼黃酮提取物。
具體的，步驟1)中：
菱角殼粉末為過40目篩的干燥粉末；
超聲處理處理2～4min；
減壓濃縮的處理溫度為45～55℃。
具體的，步驟2)中：菱角殼黃酮粗提液的上樣體積為3.5～6倍柱體積，吸附流速為0.4～0.6倍柱體積/h(0.65～0.95mL/min)。
具體的，步驟3)中：洗脫劑的洗脫流速為0.4～0.6倍柱體積/h(0.65～0.95mL/min)，洗脫劑的洗脫體積為3～4倍柱體積。
具體的，步驟4)中：以減壓濃縮進行洗脫液的濃縮，減壓濃縮的溫度為45～55℃。
本發(fā)明所提供的具有抑菌活性的菱角殼黃酮提取物的制備方法工藝簡單，實現了較低溫度提取菱角殼黃酮，配合大孔吸附樹脂柱層析純化，最大程度保留提取物的抑菌活性。
本發(fā)明還提供了根據上述具有抑菌活性的菱角殼黃酮提取物的制備方法制備得到的菱角殼黃酮提取物。
具體的，總黃酮的含量為33.1～38.7wt％。
本發(fā)明還提供了上述菱角殼黃酮提取物的應用，作為抑菌劑。
具體的，作為冷鮮鴨肉的抑菌劑。
優(yōu)選的，作為假單胞菌、金黃色葡萄球菌和/或腐敗西瓦氏菌的抑菌劑
通過本發(fā)明所得的菱角殼黃酮提取物對假單胞菌和金黃色葡萄球菌的抑制效果較好，其抑菌的MIC可低至3.125mg/mL；經過菱角殼黃酮提取物處理后的鴨肉與10℃度條件下儲存可明顯抑制假單胞菌的生長。
發(fā)明與現有技術相比具有以下有益效果：
1)本發(fā)明制備工藝簡單，采用較低溫度提取菱角殼黃酮，再采用大孔吸附樹脂柱層析純化，盡可能的保留了提取物的抑菌活性，通過大孔吸附樹脂的富集，菱角殼黃酮純度高達38.7％，具有明顯抑菌效果，而常規(guī)熱提法所得菱角殼黃酮純度只有15％。此方法也避免了大量有機試劑的使用，安全無毒?？捎糜谔烊灰志鷦┑拈_發(fā)。
2)本發(fā)明先以超聲預處理破壞菱角殼組織細胞壁，更有利于黃酮成分的提取，使低溫浸提的時間大大縮短。
3)本發(fā)明菱角殼黃酮的提取和濃縮溫度均控制在55℃以下，比高溫浸提更利于有效成分的活性。
附圖說明
圖1是不同溫度下本發(fā)明所提供的菱角殼黃酮純化物處理鴨肉后鴨肉中假單胞菌菌落數的變化圖。
具體實施方式
以下對本發(fā)明的原理和特征進行描述，所舉實施例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。
實施例1：
菱角殼黃酮提取物浸膏的制備：
1)提?。喝ジ稍锓鬯檫^40目篩的菱角殼和50％的乙醇溶液按1:20混合，超聲處理2min，然后55℃恒溫浸提3小時后分離提取液，重復以上操作提取2次，合并提取液，過濾，45℃減壓濃縮至無乙醇，得菱角殼黃酮粗提液；
2)吸附：調節(jié)菱角殼黃酮提取液濃度為5.0mg/mL，進行AB-8大孔吸附樹脂柱層析；吸附流速為0.5倍柱體積/h，吸附體積為3倍柱體積；
3)洗脫：以洗脫流速0.8mL/min，70％乙醇溶液為洗脫液進行洗脫，洗脫液體積為3柱體積，收集洗脫液；
4)濃縮：濃縮洗脫液，在50℃條件下減壓濃縮，即得菱角殼黃酮浸膏，其純度為33.1％。
實施例2
菱角殼黃酮提取物浸膏的制備：
1)提?。喝ジ稍锓鬯檫^40目篩的菱角殼和80％的乙醇溶液按1:30混合，超聲處理1min，然后50℃恒溫浸提2小時后分離提取液，重復以上操作提取3次，合并提取液，過濾，50℃減壓濃縮至無乙醇，得菱角殼黃酮粗提液；
2)吸附：調節(jié)菱角殼黃酮提取液濃度為3.0mg/mL，進行AB-8大孔吸附樹脂柱層析；吸附流速為1倍柱體積/h，吸附體積為4倍柱體積，
3)洗脫：以洗脫流速1.8mL/min，60％乙醇溶液為洗脫液進行洗脫，洗脫液體積為4柱體積，收集洗脫液；
4)濃縮：濃縮洗脫液，在50℃條件下減壓濃縮，即得菱角殼黃酮浸膏，其純度為35.6％。
將所得菱角殼提取采用抑菌圈實驗及二倍稀釋法檢測其對于假單胞菌，金黃色葡萄球菌均具有很好的抑菌效果。菱角殼黃酮提取物處理后的鴨肉與10℃條件下儲存可明顯抑制假單胞菌的生長。
實施例3
菱角殼黃酮提取物浸膏的制備：
1)提?。喝ジ稍锓鬯檫^40目篩的菱角殼和65％的乙醇溶液按1:25混合，超聲處理2min，然后60℃恒溫浸提2小時后分離提取液，重復以上操作提取3次，合并提取液，過濾，50℃減壓濃縮至無乙醇，得菱角殼黃酮粗提液；
2)吸附：調節(jié)菱角殼黃酮提取液濃度為3.0mg/mL，進行AB-8大孔吸附樹脂柱層析；吸附流速為0.8倍柱體積/h，吸附體積為1.5倍柱體積，
3)洗脫：以洗脫流速0.8mL/min，70％乙醇溶液為洗脫液進行洗脫，洗脫液體積為3.5柱體積，收集洗脫液；
4)濃縮：濃縮洗脫液，在50℃條件下減壓濃縮，即得菱角殼黃酮浸膏，其純度為38.7％。
實驗例：
抑菌試驗
針對菱角殼提取所得黃酮提取物具有明顯的抑菌作用
實驗材料：
樣品：本抑菌試驗的菱角殼黃酮提取物由實施例2制備
供試菌種：
假單胞菌，金黃色葡萄球菌，腐敗西瓦氏菌，熱殺索絲菌
試劑：NA培養(yǎng)基、MH培養(yǎng)基
器材：超凈工作臺：蘇州華宏凈化技術有限公司。高壓滅菌鍋：西安常儀生化科技有限公司。電熱恒溫培養(yǎng)箱型：上海精宏。芬蘭Bioscreen全自動分析儀：上海謂載商貿發(fā)展有限公司。漩渦儀：上海書俊儀器設備有限公司。
試驗方法：
1.平板抑菌試驗：
將已滅菌的瓊脂培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿內，每皿15mL(下層)待其凝固；將已滅菌的5mL培養(yǎng)基冷卻到50℃左右混入100μL菌懸液，將混有菌的培養(yǎng)基加到已凝固的培養(yǎng)基上層待其凝固；在已凝固的培養(yǎng)基表面上垂直放入牛津杯，輕輕加壓，使其與培養(yǎng)基接觸無空隙；在牛津杯內加入200μL濃度為50mg/mL經0.22μm無菌濾頭處理的樣液，勿使其外溢，無菌水做空白；加完樣液后于30℃培養(yǎng)24h，觀察結果，量取直徑，以出現的抑菌圈大小為判定標準，直徑小于8mm為無抑菌作用。
2.最低抑菌濃度(MIC)測定
分別稱取菱角殼黃酮粗提物、純化物粉末各0.25g，無菌水為溶劑，采用2倍稀釋法稀釋為25、12.5、6.25、3.125、1.563mg/mL 5個濃度梯度的樣品溶液，分別加入各培養(yǎng)基中。將受試菌菌懸液接種于各試管中，搖床培養(yǎng)，酵母菌、乳酸菌于37℃培養(yǎng)48h，其它菌于30℃培養(yǎng)24h，以完全無菌生長的最高稀釋度為最低抑菌濃度，考察菱角殼黃酮提取物的抑菌性能。
3.鴨肉上菱角殼黃酮對假單胞菌菌落數的影響
新鮮宰殺的凈膛鴨肉浸泡在配置好的濃度為2.5mg/mL菱角殼黃酮純化物中10min后，瀝干，進行氣調包裝后，放置于0、5、10、15、20℃的恒溫培養(yǎng)箱中貯藏。隔天測定菱角殼黃酮純化物處理的鴨肉中假單胞菌的生長狀況。
試驗結果：
1.樣品濃度為50mg/mL時對受試菌抑菌結果見表1：
表1菱角殼黃酮提取物的抑菌活性
菱殼黃酮粗提取物、純化物對假單胞菌、金黃色葡萄球菌、腐敗西瓦氏菌和熱殺索絲菌抑制作用均較好，純化物對假單胞和金黃色葡萄球菌的效果尤為突出，抑菌圈直徑高達47.01±0.43mm和45.06±0.35mm。
2.菱角殼黃酮提取物最低抑菌濃度結果見下表表2：
表2菱角殼黃酮粗提物、純化物最低抑菌濃度(MIC)
菱角殼黃酮粗提取物、純化物對假單胞菌、金黃色葡萄球菌和腐敗西瓦氏菌有較強的抑制作用。表2實驗結果表明：菱角殼黃酮粗和純化物對假單胞菌的最低抑菌濃度為3.125mg/mL，菱角殼黃酮純化物對金黃色葡萄球菌、腐敗西瓦氏菌和熱殺索絲菌的抑菌效果顯著優(yōu)于粗提物。
3.菱角殼黃酮純化物處理過的鴨肉基質對假單胞菌的生長有影響
如圖1所示，菱角殼黃酮純化物對假單胞菌初始菌落數具有很好的抑制作用。在整個儲藏過程中，0℃條件下，鴨肉中假單胞菌增殖較平緩；5℃時，假單胞菌增殖速度加快的不顯著；10℃時假單胞菌繁殖增長較0、5℃迅速；15、20℃條件下，假單胞菌繁殖速度，但在后期貯藏過程中，20℃時生長趨勢趨于平緩，沒有明顯增加?？傮w而言，菱角殼黃酮純化物對鴨肉中假單胞菌增殖在常溫區(qū)具有理想的抑制作用，可作為天然抑菌劑應用于工業(yè)化生產。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。