本發(fā)明涉及一種飼用微量元素添加劑的制備方法，尤其涉及一種大豆小肽納米硒螯合物的制備方法。

背景技術(shù)：

硒作為谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的組成成分，在生物體內(nèi)能清除脂質(zhì)過氧化自由基中間產(chǎn)物，防止生物膜的脂質(zhì)過氧化，維持生物膜的正常結(jié)構(gòu)和功能；硒還參與輔酶A和輔酶Q的的合成，在體內(nèi)三羧酸循環(huán)及電子傳遞過程中起重要作用。硒以硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸兩種形式存在于硒蛋白中，通過硒蛋白影響動(dòng)物機(jī)體的自由基代謝、抗氧化功能、免疫功能、生殖功能、細(xì)胞凋亡和內(nèi)分泌系統(tǒng)等而發(fā)揮其生物學(xué)功能。動(dòng)物硒缺乏時(shí)可發(fā)生營養(yǎng)型肌肉萎縮，初期可能表現(xiàn)為呼吸困難，骨骼肌僵硬，幼畜發(fā)生白肌病，豬還會(huì)出現(xiàn)營養(yǎng)性肝壞死，成年動(dòng)物硒缺乏時(shí)則對(duì)疾病的易感性增高，母畜易出現(xiàn)繁殖機(jī)能障礙等。無機(jī)硒毒性大，吸收利用率低，而有機(jī)硒和納米硒具有毒性小、易于吸收、高效、高活性等優(yōu)勢(shì)，是較好的補(bǔ)硒來源。

小肽是指相對(duì)分子量介于180～1000Da之間的二肽、三肽和四肽。大量研究表明，在動(dòng)物體內(nèi)存在小肽吸收機(jī)制，小肽能完整地通過腸黏膜細(xì)胞進(jìn)入體內(nèi)循環(huán)。動(dòng)物67％的氨基酸是以小肽的形式吸收的，剩余的33％才以游離氨基酸(FAA)的形式吸收。小肽不僅為蛋白質(zhì)合成提高氮架，提高蛋白質(zhì)合成速度，而且具有抗氧化、增強(qiáng)動(dòng)物免疫力、提高礦物質(zhì)吸收利用率、促進(jìn)消化道發(fā)育、減少腹瀉發(fā)生等生理調(diào)節(jié)功能。

小肽微量元素螯合物是新興的第三代微量元素添加劑，易被動(dòng)物吸收，生物學(xué)效價(jià)高，安全高效，在補(bǔ)充生物活性肽、滿足蛋白營養(yǎng)需要的同時(shí)補(bǔ)充微量元素，對(duì)動(dòng)物的生長特別是幼小動(dòng)物的健康生長起著非常重要的作用，是后抗生素時(shí)代飼料添加劑發(fā)展的方向。但是，目前國內(nèi)外對(duì)小肽微量元素螯合物的研究和開發(fā)很少，沒有成熟技術(shù)，特別是有關(guān)大豆小肽納米硒螯合物的制備方法尚未見到研究報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的正是基于上述狀況而提出的一種大豆小肽納米硒螯合物的制備方法，該方法以大豆粕為主要原料，工藝簡單，成本低，易于實(shí)施，所制備的大豆小肽納米硒螯合物作為微量元素添加劑，可顯著提高飼料利用率，增強(qiáng)動(dòng)物免疫力和抗病力，促進(jìn)動(dòng)物生長。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：一種大豆小肽納米硒螯合物的制備方法，其工藝步驟如下：

（1）豆粕粉碎：將脫脂豆粕粉碎過100目篩，得豆粕粉；

（2）酶解：將步驟（1）得到的豆粕粉加去離子水?dāng)嚢杌靹?，配制成蛋白濃度?-10%（w/w）的豆粕液，調(diào)節(jié)豆粕液PH值至8.0-9.0，加入蛋白酶，在50-55℃溫度下酶解4-6h后，將酶解液升溫至85℃滅酶10分鐘，即得到豆粕酶解液；

（3）壓濾：將步驟（2）得到的豆粕酶解液經(jīng)板框壓濾機(jī)壓濾，濾布目數(shù)為200目，得到壓濾液和濾餅，濾餅經(jīng)干燥粉碎后可制成豆渣飼料；

（4）超濾：將步驟（3）得到的壓濾液經(jīng)截留分子量為1000Da的超濾膜裝置進(jìn)行超濾，收集透過液，得到大豆小肽溶液；

（5）螯合反應(yīng)：向步驟（4）得到的大豆小肽溶液中加入納米硒，納米硒的添加量為大豆小肽溶液中蛋白肽量（以蛋白質(zhì)含量計(jì)）的1.5-3%，將溶液的pH值調(diào)整到8.0～8.5，在45-50℃下攪拌螯合反應(yīng)1-1.5小時(shí)，得到大豆小肽納米硒螯合反應(yīng)液；

（6）噴霧干燥：將步驟（5）得到的大豆小肽納米硒螯合反應(yīng)液進(jìn)行噴霧干燥，即得到大豆小肽納米硒螯合物。

步驟（1）所述的脫脂豆粕為蛋白質(zhì)含量≥43%的脫脂豆粕。

步驟（2）所述的蛋白酶為枯草桿菌蛋白酶，酶活力為200000-220000U/ ml，蛋白酶的添加量為豆粕液中蛋白質(zhì)量的1.0-1.5%。

步驟（4）所述的大豆小肽溶液為小分子肽占溶液中總蛋白的比例在80%以上的大豆蛋白肽溶液，所述小分子肽為相對(duì)分子量介于180～1000Da之間的肽。

步驟（5）所述的納米硒為將亞硒酸鈉和檸檬酸按質(zhì)量比為1:2混合研磨制備所得。

步驟（6）所述噴霧干燥時(shí)進(jìn)風(fēng)口溫度為180-220℃，出風(fēng)口溫度為70-90℃。

通過實(shí)施上述技術(shù)方案，本發(fā)明具有如下的有益效果：

(1)本發(fā)明的方法綜合應(yīng)用酶解、超濾、分子螯合和噴霧干燥等現(xiàn)代生物工程技術(shù)和現(xiàn)代加工技術(shù)，具有工藝流程簡單，生產(chǎn)效率高，成本低，適合工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)的特點(diǎn)。

（2）本發(fā)明的方法以價(jià)格低廉、來源廣泛的豆粕為蛋白肽源，以低毒、高效的納米硒為硒源，將納米硒與小肽螯合，使小肽與納米硒的生理功能相互促進(jìn)，協(xié)同增效，所得產(chǎn)品具有直接吸收、生物活性強(qiáng)、安全穩(wěn)定、持久補(bǔ)硒等特點(diǎn)，能顯著提高動(dòng)物生長性能，增強(qiáng)動(dòng)物的免疫力和抗病力。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明，但是本發(fā)明的實(shí)施方式并不局限于此實(shí)施例表示的范圍。

實(shí)施例1

（1）豆粕粉碎：稱取100Kg脫脂豆粕粉（粗蛋白含量45%）碎過100目篩，得豆粕粉100Kg；

（2）酶解：將步驟（1）得到的豆粕粉加水去離子水460L，攪拌均勻，配制成蛋白濃度為8%（w/w）的豆粕液，調(diào)節(jié)豆粕液PH值至8.0，加入豆粕液中蛋白質(zhì)量1.0%的蛋白酶，在52℃溫度下酶解6h后，將酶解液升溫至85℃滅酶10分鐘，即得到豆粕酶解液；

（3）壓濾：將步驟（2）得到的豆粕酶解液經(jīng)板框壓濾機(jī)壓濾，濾布目數(shù)為200目，得到壓濾液和濾餅，濾餅經(jīng)干燥粉碎后可制成豆渣飼料；

（4）超濾：將步驟（3）得到的壓濾液經(jīng)截留分子量為1000Da的超濾膜裝置進(jìn)行超濾，收集透過液，得到大豆小肽溶液292L；

（5）螯合反應(yīng)：向步驟（4）得到的大豆小肽溶液中加入其蛋白肽量（以蛋白質(zhì)含量計(jì)）1.5%的納米硒，所述納米硒為將亞硒酸鈉和檸檬酸按質(zhì)量比為1:2混合后研磨制備所得，將溶液的pH值調(diào)整到8.0，在45℃下攪拌反應(yīng)1.5小時(shí)，得到大豆小肽納米硒螯合反應(yīng)液285L；

（6）噴霧干燥：將步驟（5）得到的大豆小肽納米硒螯合反應(yīng)液進(jìn)行噴霧干燥，進(jìn)風(fēng)口溫度為200℃，出風(fēng)口溫度為80℃，得到大豆小肽納米硒螯合物37.2KG，檢測(cè)硒含量為0.177%。

實(shí)施例2

（1）豆粕粉碎：稱取100Kg脫脂豆粕粉（粗蛋白含量45%）碎過100目篩，得豆粕粉100Kg；

（2）酶解：將步驟（1）得到的豆粕粉加水去離子水400L，攪拌均勻，配制成蛋白濃度為9%（w/w）的豆粕液，調(diào)節(jié)豆粕液PH值至8.5，加入豆粕液中蛋白質(zhì)量1.2%的蛋白酶，在50℃溫度下酶解4h后，將酶解液升溫至85℃滅酶10分鐘，即得到豆粕酶解液；

（3）壓濾：將步驟（2）得到的豆粕酶解液經(jīng)板框壓濾機(jī)壓濾，濾布目數(shù)為200目，得到壓濾液和濾餅，濾餅經(jīng)干燥粉碎后可制成豆渣飼料；

（4）超濾：將步驟（3）得到的壓濾液經(jīng)截留分子量為1000Da的超濾膜裝置進(jìn)行超濾，收集透過液，得到大豆小肽溶液233L；

（5）螯合反應(yīng)：向步驟（4）得到的大豆小肽溶液中加入其蛋白肽量（以蛋白質(zhì)含量計(jì)）2.0%的納米硒，所述納米硒為將亞硒酸鈉和檸檬酸按質(zhì)量比為1:2混合后研磨制備所得，將溶液的pH值調(diào)整到8.5，在50℃下攪拌反應(yīng)1.0小時(shí)，得到大豆小肽納米硒螯合反應(yīng)液226L；

（6）噴霧干燥：將步驟（5）得到的大豆小肽納米硒螯合反應(yīng)液進(jìn)行噴霧干燥，進(jìn)風(fēng)口溫度為210℃，出風(fēng)口溫度為90℃，得到大豆小肽納米硒螯合物35.6KG，檢測(cè)硒含量為0.244%。

實(shí)施例3

（1）豆粕粉碎：稱取100Kg脫脂豆粕粉（粗蛋白含量45%）碎過100目篩，得豆粕粉100Kg；

（2）酶解：將步驟（1）得到的豆粕粉加水去離子水350L，攪拌均勻，配制成蛋白濃度為10%（w/w）的豆粕液，調(diào)節(jié)豆粕液PH值至8.5，加入豆粕液中蛋白質(zhì)量1.5%的蛋白酶，在53℃溫度下酶解5h后，將酶解液升溫至85℃滅酶10分鐘，即得到豆粕酶解液；

（3）壓濾：將步驟（2）得到的豆粕酶解液經(jīng)板框壓濾機(jī)壓濾，濾布目數(shù)為200目，得到壓濾液和濾餅，濾餅經(jīng)干燥粉碎后可制成豆渣飼料；

（4）超濾：將步驟（3）得到的壓濾液經(jīng)截留分子量為1000Da的超濾膜裝置進(jìn)行超濾，收集透過液，得到大豆小肽溶液210L；

（5）螯合反應(yīng)：向步驟（4）得到的大豆小肽溶液中加入其蛋白肽量（以蛋白質(zhì)含量計(jì)）2.5%的納米硒，所述納米硒為將亞硒酸鈉和檸檬酸按質(zhì)量比為1:2混合后研磨制備所得，將溶液的pH值調(diào)整到8.3，在45℃下攪拌反應(yīng)1.0小時(shí)，得到大豆小肽納米硒螯合反應(yīng)液198L；

（6）噴霧干燥：將步驟（5）得到的大豆小肽納米硒螯合反應(yīng)液進(jìn)行噴霧干燥，進(jìn)風(fēng)口溫度為190℃，出風(fēng)口溫度為80℃，得到大豆小肽納米硒螯合物36.1KG，檢測(cè)硒含量為0.302%。

實(shí)施例4

（1）豆粕粉碎：稱取100Kg脫脂豆粕粉（粗蛋白含量45%）碎過100目篩，得豆粕粉100Kg；

（2）酶解：將步驟（1）得到的豆粕粉加水去離子水400L，攪拌均勻，配制成蛋白濃度為9%（w/w）的豆粕液，調(diào)節(jié)豆粕液PH值至8.5，加入豆粕液中蛋白質(zhì)量1.2%的蛋白酶，在50℃溫度下酶解6h后，將酶解液升溫至85℃滅酶10分鐘，即得到豆粕酶解液；

（3）壓濾：將步驟（2）得到的豆粕酶解液經(jīng)板框壓濾機(jī)壓濾，濾布目數(shù)為200目，得到壓濾液和濾餅，濾餅經(jīng)干燥粉碎后可制成豆渣飼料；

（4）超濾：將步驟（3）得到的壓濾液經(jīng)截留分子量為1000Da的超濾膜裝置進(jìn)行超濾，收集透過液，得到大豆小肽溶液240L；

（5）螯合反應(yīng)：向步驟（4）得到的大豆小肽溶液中加入其蛋白肽量（以蛋白質(zhì)含量計(jì)）3.0%的納米硒，所述納米硒為將亞硒酸鈉和檸檬酸按質(zhì)量比為1:2混合后研磨制備所得，將溶液的pH值調(diào)整到8.3，在48℃下攪拌反應(yīng)1.5小時(shí)，得到大豆小肽納米硒螯合反應(yīng)液232L；

（6）噴霧干燥：將步驟（5）得到的大豆小肽納米硒螯合反應(yīng)液進(jìn)行噴霧干燥，進(jìn)風(fēng)口溫度為180℃，出風(fēng)口溫度為70℃，得到大豆小肽納米硒螯合物36.8KG，檢測(cè)硒含量為0.358%。

實(shí)施例5

（1）豆粕粉碎：稱取100Kg脫脂豆粕粉（粗蛋白含量48%）碎過100目篩，得豆粕粉100Kg；

（2）酶解：將步驟（1）得到的豆粕粉加水去離子水433L，攪拌均勻，配制成蛋白濃度為9%（w/w）的豆粕液，調(diào)節(jié)豆粕液PH值至8.5，加入豆粕液中蛋白質(zhì)量1.5%的蛋白酶，在55℃溫度下酶解4h后，將酶解液升溫至85℃滅酶10分鐘，即得到豆粕酶解液；

（3）壓濾：將步驟（2）得到的豆粕酶解液經(jīng)板框壓濾機(jī)壓濾，濾布目數(shù)為200目，得到壓濾液和濾餅，濾餅經(jīng)干燥粉碎后可制成豆渣飼料；

（4）超濾：將步驟（3）得到的壓濾液經(jīng)截留分子量為1000Da的超濾膜裝置進(jìn)行超濾，收集透過液，得到大豆小肽溶液272L；

（5）螯合反應(yīng)：向步驟（4）得到的大豆小肽溶液中加入其蛋白肽量（以蛋白質(zhì)含量計(jì)）2.0%的納米硒，所述納米硒為將亞硒酸鈉和檸檬酸按質(zhì)量比為1:2混合后研磨制備所得，將溶液的pH值調(diào)整到8.2，在45℃下攪拌反應(yīng)1.5小時(shí)，得到大豆小肽納米硒螯合反應(yīng)液258L；

（6）噴霧干燥：將步驟（5）得到的大豆小肽納米硒螯合反應(yīng)液進(jìn)行噴霧干燥，進(jìn)風(fēng)口溫度為220℃，出風(fēng)口溫度為90℃，得到大豆小肽納米硒螯合物38.5KG，檢測(cè)硒含量為0.231%。

實(shí)施例6

（1）豆粕粉碎：稱取100Kg脫脂豆粕粉（粗蛋白含量43%）碎過100目篩，得豆粕粉100Kg；

（2）酶解：將步驟（1）得到的豆粕粉加水去離子水330L，攪拌均勻，配制成蛋白濃度為10%（w/w）的豆粕液，調(diào)節(jié)豆粕液PH值至8.5，加入豆粕液中蛋白質(zhì)量1.2%的蛋白酶，在55℃溫度下酶解5h后，將酶解液升溫至85℃滅酶10分鐘，即得到豆粕酶解液；

（3）壓濾：將步驟（2）得到的豆粕酶解液經(jīng)板框壓濾機(jī)壓濾，濾布目數(shù)為200目，得到壓濾液和濾餅，濾餅經(jīng)干燥粉碎后可制成豆渣飼料；

（4）超濾：將步驟（3）得到的壓濾液經(jīng)截留分子量為1000Da的超濾膜裝置進(jìn)行超濾，收集透過液，得到大豆小肽溶液208L；

（5）螯合反應(yīng)：向步驟（4）得到的大豆小肽溶液中加入其蛋白肽量（以蛋白質(zhì)含量計(jì)）2.5%的納米硒，所述納米硒為將亞硒酸鈉和檸檬酸按質(zhì)量比為1:2混合后研磨制備所得，將溶液的pH值調(diào)整到8.2，在45℃下攪拌反應(yīng)1.5小時(shí)，得到大豆小肽納米硒螯合反應(yīng)液202L；

（6）噴霧干燥：將步驟（5）得到的大豆小肽納米硒螯合反應(yīng)液進(jìn)行噴霧干燥，進(jìn)風(fēng)口溫度為200℃，出風(fēng)口溫度為80℃，得到大豆小肽納米硒螯合物34.5KG，檢測(cè)硒含量為0.294%。

對(duì)上述實(shí)施例得到的成品進(jìn)行硒含量、粗蛋白含量、肽分子量大小以及功效檢測(cè)。

硒含量、粗蛋白含量及肽分子量大小檢測(cè)：硒含量采用原子吸收分光光度法測(cè)定，粗蛋白含量采用GB/T6432-94方法測(cè)定，肽分子量大小采用高效凝膠過濾色譜（HPLC）法測(cè)定，以已知分子量蛋白質(zhì)做參照。

結(jié)果如表1：

從表1中可以看出，實(shí)施例所得的成品中硒含量均在0.1%以上，粗蛋白含量均在75%以上，其中相對(duì)分子量在180-1000Da之間的小分子肽占總蛋白的比例達(dá)到80%以上。

功效檢測(cè)：選擇35日齡的杜×長×大三元雜交仔豬150頭，按體重相近、遺傳基礎(chǔ)相似的原則，隨機(jī)分為5個(gè)處理組，每個(gè)處理組設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10頭豬。將亞硒酸鈉、大豆小肽納米硒螯合物（需要根據(jù)硒含量和試驗(yàn)確定的日糧硒水平計(jì)算出相應(yīng)的添加量）分別以日糧硒0.30mg/kg、0.50mg/kg兩個(gè)硒水平添加到基礎(chǔ)日糧中，配成4種試驗(yàn)日糧。基礎(chǔ)日糧作對(duì)照。大豆小肽納米硒螯合物為實(shí)施例2制備的成品，硒含量為0.244%。試驗(yàn)于2016年3月在天津恒泰牧業(yè)股份下屬靈璧養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行，試驗(yàn)期30d。

結(jié)果見表2，表3:

從表2中可以看出，與不加硒對(duì)照組相比，添加大豆小肽納米硒螯合物補(bǔ)硒，日糧硒濃度為0.3mg/kg、0.5mg/kg時(shí)，大豆小肽納米硒螯合物組分別使日增重提高了14.50%、19.79%，使料肉比降低了8.86%和15.82%。與亞硒酸鈉組相比，添加大豆小肽納米硒螯合物補(bǔ)硒，日糧硒濃度在0.3mg/kg時(shí)，大豆小肽納米硒螯合物組使日增重提高了7.41%，使料肉比降低了3.36%，日糧硒濃度在0.5mg/kg時(shí)，大豆小肽納米硒螯合物組使日增重提高了13.30%，使料肉比降低了10.14%。這說明本發(fā)明制備的大豆小肽納米硒螯合物能明顯提高仔豬的日增重和降低料重比，促進(jìn)仔豬的生長發(fā)育。

從表3中可以看出，與不加硒對(duì)照組相比，添加大豆小肽納米硒螯合物補(bǔ)硒，日糧硒濃度為0.5mg/kg時(shí)，大豆小肽納米硒螯合物組使發(fā)病率下降12.02%，使死亡率下降37.03%。與亞硒酸鈉組相比，添加大豆小肽納米硒螯合物補(bǔ)硒，日糧硒濃度在0.3mg/kg時(shí)，大豆小肽納米硒螯合物組使死亡率下降10.30%，當(dāng)日糧硒濃度在0.5mg/kg時(shí)，大豆小肽納米硒螯合物組使死亡率大幅下降30.59%。這說明本發(fā)明制備的大豆小肽納米硒螯合物能改善仔豬的免疫機(jī)能，顯著增強(qiáng)斷奶仔豬的抗病力及抗應(yīng)激能力。