1.一種多菌種固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)杜仲葉生物飼料添加劑的方法,其特征在于:包括如下步驟:
(1)、原料采集:采摘杜仲鮮葉;
(2)、殺青:采用沸騰干燥,控制葉片含水量在12%以下,冷卻至室溫;
(3)、原料的粉碎:將杜仲葉、豆粕、玉米、麩皮進(jìn)行粉碎;
(4)、發(fā)酵菌種的制備:取枯草芽孢桿菌、黑曲霉和糞腸球菌凍干粉,經(jīng)活化、逐級(jí)擴(kuò)培制備菌種;
(5)、固態(tài)發(fā)酵:
a、混合:將杜仲葉、豆粕粉、玉米粉按比例混合,高壓蒸汽滅菌,待物料冷卻至38~40℃后,黑曲霉加入到上述混合料中,混合均勻,然后將枯草芽孢桿菌菌液加入到純水中混勻,再與上述物料混勻,純水添加量為物料干重的40~50%,然后將最終混合料送入發(fā)酵室;
b、好氧階段:將混合好的物料轉(zhuǎn)運(yùn)到發(fā)酵室,發(fā)酵室溫度控制在25~30℃,每天翻堆一次,控制發(fā)酵室相對(duì)濕度70~80%,發(fā)酵5~7d;
c、厭氧階段:好氧發(fā)酵結(jié)束后,將發(fā)酵飼料打散,將糞腸球菌接入物料中,然后裝入單向閥發(fā)酵袋中,發(fā)酵室溫度控制在25~30℃,進(jìn)行厭氧發(fā)酵,發(fā)酵時(shí)間24~36h;
(6)、低溫烘干:將發(fā)酵好的物料轉(zhuǎn)入沸騰干燥車間,控制沸騰干燥溫度40~45℃,待物料水分達(dá)5~10%時(shí),即可。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多菌種固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)杜仲葉生物飼料添加劑的方法,其特征在于:步驟(2)中,沸騰干燥條件為,溫度控制70~80℃,烘干時(shí)間20~30min。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多菌種固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)杜仲葉生物飼料添加劑的方法,其特征在于:步驟(5)中,步驟a,發(fā)酵物料的混合組分比例為,杜仲葉80~85%,玉米粉5~10%,豆粕5~10%;發(fā)酵物料的滅菌條件為,溫度121~123℃,時(shí)間20~30min。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的多菌種固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)杜仲葉生物飼料添加劑的方法,其特征在于:按發(fā)酵物料質(zhì)量比例接種,黑曲霉接種量3~8%,枯草芽孢桿菌菌液3~8%,糞腸球菌菌液5~10%。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多菌種固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)杜仲葉生物飼料添加劑的方法,其特征在于:步驟(4)中,黑曲霉菌種制備方法如下:
菌種的活化:取黑曲霉凍干粉,接入黑曲霉液體試管中,25~30℃、160~220r/min,振蕩培養(yǎng)48h;
茄子瓶菌種制備:取試管菌種1mL加入到500mL茄子瓶斜面培養(yǎng)基中,涂布均勻,25~30℃靜置培養(yǎng)48~72h;
固體擴(kuò)培:取杜仲葉30~50%,麩皮30~50%,豆粕粉20~30%,加入0.3~0.5%的氯化鈉和純水混勻,料水比控制在1:0.35~0.5,擠壓無水滴為宜,然后滅菌,冷卻至35℃以下時(shí),將茄子瓶孢子用無菌水沖洗,接入上述物料中,放入淺盤中,覆蓋一層保鮮膜,發(fā)酵溫度25~30℃,培養(yǎng)時(shí)間48~72h,每隔24h翻料通氣,發(fā)酵好后,置于通風(fēng)干燥處風(fēng)干,密封保存,即得黑曲霉生產(chǎn)種子。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的多菌種固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)杜仲葉生物飼料添加劑的方法,其特征在于:黑曲霉活化及斜面培養(yǎng)基組成成分包括:馬鈴薯200g/L,杜仲葉粉20g/L,葡萄糖20g/L,瓊脂20g/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多菌種固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)杜仲葉生物飼料添加劑的方法,其特征在于:步驟(4)中,枯草芽孢桿菌制備方法如下:
菌種活化:取枯草芽孢桿菌凍干粉,接入牛肉膏蛋白胨液體試管中,37℃、160~220r/min培養(yǎng)16~24h;
一級(jí)搖瓶種子:將活化好的菌液接入一級(jí)搖瓶,接種量1~3%,37℃、160~220r/min培養(yǎng)16~24h;
二級(jí)搖瓶種子:將一級(jí)搖瓶接入二級(jí)搖瓶中,接種量3~6%,37℃、160~220r/min培養(yǎng)16~18h;
一級(jí)種子罐:培養(yǎng)好的二級(jí)搖瓶種子接入一級(jí)種子罐,發(fā)酵罐裝液系數(shù)60%,接種量1%,轉(zhuǎn)速150~200r/min,0~6h,通風(fēng)比1:0.5,6h后通風(fēng)比1:0.8,培養(yǎng)時(shí)間14~18h;
發(fā)酵罐培養(yǎng):一級(jí)種子罐菌液按照5~10%比例接入發(fā)酵罐中,轉(zhuǎn)速150~200r/min,0-6h,通風(fēng)比1:0.5,6h后通風(fēng)比1:0.8,培養(yǎng)時(shí)間12~16h。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的多菌種固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)杜仲葉生物飼料添加劑的方法,其特征在于:搖瓶種子培養(yǎng)基組成成分包括:牛肉膏5g/L,蛋白胨10g/L,葡萄糖5g/L,NaCl 5g/L,pH 7.0~7.2;
種子罐與發(fā)酵罐培養(yǎng)基組成成分包括:玉米粉15~20g/L,淀粉2~4g/L,豆粕20~30g/L,酵母膏2~4g/L,硫酸錳0.3~0.6g/L,碳酸鈣0.05~0.2g/L,pH 7.0~7.2。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多菌種固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)杜仲葉生物飼料添加劑的方法,其特征在于:步驟(4)中,糞腸球菌發(fā)酵液制備方法如下:
菌種活化:取糞腸球菌凍干粉,液體活化試管,35~39℃靜置培養(yǎng)22~24h;
三角瓶種子:將活化后種子接入三角瓶中,35~39℃培養(yǎng)22~24h,轉(zhuǎn)速120r/min;
搖瓶種子制備:將三角瓶成熟菌種接入搖瓶中,接種量2~5%,35~39℃培養(yǎng)16~20h,轉(zhuǎn)速120r/min;
一級(jí)種子罐:搖瓶種子接入一級(jí)種子罐,接種量1~2%,溫度35~39℃,通風(fēng)比與轉(zhuǎn)速:0~2h,不通風(fēng)不攪拌,之后通風(fēng)比 1:0.2,攪拌轉(zhuǎn)速80~100r/min;
發(fā)酵罐培養(yǎng):一級(jí)種子罐菌液接入發(fā)酵罐中,接種量5~10%,溫度35~39℃,通風(fēng)比與轉(zhuǎn)速:0~2h,不通風(fēng)不攪拌,之后通風(fēng)比 1:0.2,攪拌轉(zhuǎn)速80~100r/min。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的多菌種固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)杜仲葉生物飼料添加劑的方法,其特征在于:糞腸球菌活化及三角瓶培養(yǎng)基組成成分包括:牛肉膏5g/L,蛋白胨10g/L,乳糖20g/L,pH 6.8~7.2;
糞腸球菌搖瓶種子、一級(jí)種子罐及發(fā)酵罐培養(yǎng)基組成成分包括:蛋白胨20~40g/L,牛肉膏2~5g/L,氯化鈉2~5g/L,葡萄糖20~40g/L,碳酸鈣5~20g/L,pH 6.8~7.2。