本發(fā)明屬于生物飼料領(lǐng)域，具體為一種多菌種固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)杜仲葉生物飼料添加劑的方法。
背景技術(shù)：
杜仲（Eucommiaulmoides） 是中國特有的名貴中藥，屬落葉喬木，廣泛分布于陜西、甘肅、浙江、河南、湖北、四川、貴州、云南等地。樹皮粗糙，單葉互生，卵圓形、葉漸尖，齒狀邊緣，長6~16cm，寬3.5~6.5cm，葉內(nèi)所含杜仲膠可作為重要的鑒別特征?；▎涡?，花期4~5月，雌雄異株，無花被，生于幼枝基部的苞葉內(nèi)，與葉同放或先葉開放。
目前研究表明，杜仲含有112種成分，包括28種木質(zhì)素類，24種環(huán)烯萜類，27種酚類，6種固醇，5種萜類，13種黃酮類和其它8種物質(zhì)，同時被列入衛(wèi)生部保健食品名錄及農(nóng)業(yè)部飼料原料目錄。杜仲營養(yǎng)豐富，富含多種蛋白質(zhì)、維生素和微量元素，同時具有增強(qiáng)免疫力、降壓、抗炎、抗病毒、抗應(yīng)激、健筋骨、利膽、抗疲勞和抗氧化等多種功能。
杜仲葉細(xì)胞壁中的纖維素、半纖維素及木質(zhì)素相互交聯(lián)，阻止了杜仲葉有效成分的釋放。通過微生物發(fā)酵的方式對杜仲葉進(jìn)行預(yù)處理，通過微生物在發(fā)酵過程中釋放的多種酶的作用，可以使杜仲葉的細(xì)胞壁破裂，各種生物活性物質(zhì)得到有效釋放，同時微生物生長過程中產(chǎn)生多種有益代謝產(chǎn)物，明顯提高杜仲葉中活性成分的含量，降低杜仲葉中毒副作用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種多菌種固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)杜仲葉生物飼料添加劑的方法，利用本發(fā)明生產(chǎn)的產(chǎn)品，綠色安全，適用于各種階段的養(yǎng)殖動物，發(fā)酵后能明顯改善杜仲葉苦澀異味等口感問題，同時有效釋放杜仲葉中有效成分。
本發(fā)明是采用如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
一種多菌種固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)杜仲葉生物飼料添加劑的方法，包括如下步驟：
（1）、原料采集：采摘杜仲鮮葉；
（2）、殺青：采用沸騰干燥，溫度控制70~80℃，烘干時間20~30min，控制葉片含水量在12%以下，冷卻至室溫；
（3）、原料的粉碎：將杜仲葉、豆粕、玉米、麩皮進(jìn)行粉碎；
（4）、發(fā)酵菌種的制備：取枯草芽孢桿菌、黑曲霉和糞腸球菌凍干粉，經(jīng)活化、逐級擴(kuò)培制備菌種；
步驟（4）中，黑曲霉菌種制備方法如下：
菌種的活化：取黑曲霉凍干粉，接入黑曲霉液體試管中，25~30℃、160~220r/min振蕩培養(yǎng)48h；
茄子瓶菌種制備：取試管菌種1mL加入到500mL茄子瓶斜面培養(yǎng)基中，涂布均勻，25~30℃靜置培養(yǎng)48~72h；
固體擴(kuò)培：取杜仲葉30~50%，麩皮30~50%，豆粕粉20~30%，加入0.3~0.5%的氯化鈉和純水混勻，料水比控制在1:0.35~0.5，擠壓無水滴為宜，然后滅菌，冷卻至35℃以下時，將茄子瓶孢子用無菌水沖洗，接入上述物料中，放入淺盤中，覆蓋一層保鮮膜，發(fā)酵溫度25~30℃，培養(yǎng)時間48~72h，每隔24h翻料通氣，發(fā)酵好后，置于通風(fēng)干燥處風(fēng)干，密封保存，即得黑曲霉生產(chǎn)種子。
黑曲霉活化及斜面培養(yǎng)基組成成分包括：馬鈴薯200g/L，杜仲葉粉20g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂20g/L。
步驟（4）中，枯草芽孢桿菌制備方法如下：
菌種活化：取枯草芽孢桿菌凍干粉，接入牛肉膏蛋白胨液體試管中，37℃、160~220r/min培養(yǎng)16~24h；
一級搖瓶種子：將活化好的菌液接入一級搖瓶，接種量1~3%，37℃、160~220r/min培養(yǎng)16~24h；
二級搖瓶種子：將一級搖瓶接入二級搖瓶中，接種量3~6%，37℃、160~220r/min培養(yǎng)16~18h；
一級種子罐：培養(yǎng)好的二級搖瓶種子接入一級種子罐，發(fā)酵罐裝液系數(shù)60%，接種量1%，轉(zhuǎn)速150~200r/min，0~6h，通風(fēng)比1:0.5，6h后通風(fēng)比1:0.8，培養(yǎng)時間14~18h；
發(fā)酵罐培養(yǎng)：一級種子罐菌液按照5~10%比例接入發(fā)酵罐中，轉(zhuǎn)速150~200r/min，0-6h，通風(fēng)比1:0.5，6h后通風(fēng)比1:0.8，培養(yǎng)時間12~16h。
搖瓶種子培養(yǎng)基組成成分包括：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，葡萄糖5g/L，NaCl 5g/L，pH 7.0~7.2；
種子罐與發(fā)酵罐培養(yǎng)基組成成分包括：玉米粉15~20g/L，淀粉2~4g/L，豆粕20~30g/L，酵母膏2~4g/L，硫酸錳0.3~0.6g/L，碳酸鈣0.05~0.2g/L，pH 7.0~7.2。
步驟（4）中，糞腸球菌發(fā)酵液制備方法如下：
菌種活化：取糞腸球菌凍干粉，液體活化試管，35~39℃靜置培養(yǎng)22~24h；
三角瓶種子：將活化后種子接入三角瓶中，35~39℃培養(yǎng)22~24h，轉(zhuǎn)速120r/min；
搖瓶種子制備：將三角瓶成熟菌種接入搖瓶中，接種量2~5%，35~39℃，轉(zhuǎn)速120r/min，培養(yǎng)16~20小時；
一級種子罐：搖瓶種子接入一級種子罐，接種量1~2%，溫度35~39℃，通風(fēng)比與轉(zhuǎn)速：0~2h，不通風(fēng)不攪拌，之后通風(fēng)比 1:0.2，攪拌轉(zhuǎn)速80~100r/min。
發(fā)酵罐培養(yǎng)：一級種子罐菌液接入發(fā)酵罐中，接種量5~10%，溫度35~39℃，通風(fēng)比與轉(zhuǎn)速：0~2h，不通風(fēng)不攪拌，之后通風(fēng)比 1:0.2，攪拌轉(zhuǎn)速80~100r/min。
糞腸球菌活化及三角瓶培養(yǎng)基組成成分包括：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，乳糖20g/L，pH 6.8~7.2；
糞腸球菌搖瓶種子、一級種子罐及發(fā)酵罐培養(yǎng)基組成成分包括：蛋白胨20~40g/L，牛肉膏2~5g/L，氯化鈉2~5g/L，葡萄糖20~40g/L，碳酸鈣5~20g/L，pH 6.8~7.2。
（5）、固態(tài)發(fā)酵：
a、混合：將杜仲葉80~85%、豆粕粉5~10%、玉米粉5~10%按比例混合，高壓蒸汽滅菌，溫度121~123℃，時間20~30min。待物料冷卻至38~40℃后，黑曲霉加入到上述混合料中，混合均勻，然后將枯草芽孢桿菌菌液加入到純水中混勻，再與上述物料混勻，純水添加量為物料干重的40~50%，然后將最終混合料送入發(fā)酵室；按發(fā)酵物料質(zhì)量比例接種，黑曲霉接種量3~8%，枯草芽孢桿菌菌液3~8%；
b、好氧階段：將混合好的物料轉(zhuǎn)運(yùn)到發(fā)酵室，發(fā)酵室溫度控制在25~30℃，每天翻堆一次，控制發(fā)酵室相對濕度70~80%，發(fā)酵5~7d；
c、厭氧階段：好氧發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵飼料打散，將糞腸球菌接入物料中，然后裝入單向閥發(fā)酵袋中，發(fā)酵室溫度控制在25~30℃，進(jìn)行厭氧發(fā)酵，發(fā)酵時間24~36h；按發(fā)酵物料質(zhì)量比例接種，糞腸球菌菌液5~10%；
（6）、低溫烘干：將發(fā)酵好的物料轉(zhuǎn)入沸騰干燥車間，控制沸騰干燥溫度40~45℃，待物料水分達(dá)5~10%時，即可取樣送檢，檢驗(yàn)合格后，按照規(guī)定要求分裝和包裝。
杜仲葉直接飼喂動物口感較差，長時間飼喂有可能造成畜禽等養(yǎng)殖動物采食量下降，杜仲葉各種有效成分由于細(xì)胞壁的包裹，在動物體內(nèi)吸收較差。通過微生物發(fā)酵的方式可明顯改善杜仲葉的口感，有效釋放各種生物活性成分，提高其營養(yǎng)價值。本發(fā)明利用黑曲霉、枯草芽孢桿菌和糞腸球菌對杜仲葉固態(tài)發(fā)酵，前期利用黑曲霉和枯草芽孢桿菌對杜仲葉進(jìn)行好氧發(fā)酵，通過這兩種菌產(chǎn)生的纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶等對杜仲葉進(jìn)行深度酶解，產(chǎn)生大量的多糖、氨基酸及小肽；后期，利用接入糞腸球菌，糞腸球菌利用杜仲葉的營養(yǎng)成分進(jìn)行增殖，同時產(chǎn)生乳酸菌素、甘露聚糖肽、乳酸等多種代謝產(chǎn)物，極大提高了杜仲葉的營養(yǎng)價值。
利用本發(fā)明的方法生產(chǎn)發(fā)酵杜仲葉，通過兩段式固態(tài)發(fā)酵（好氧與厭氧相結(jié)合），前期黑曲霉與枯草芽孢桿菌發(fā)酵過程中，產(chǎn)生的淀粉酶、糖化酶及蛋白酶，可以將原料中的玉米粉、豆粕粉分解為葡萄糖、小分子蛋白和氨基酸，為后期糞腸球菌的生長提供碳氮源；黑曲霉發(fā)酵過程中產(chǎn)生的纖維素酶，可有效提高杜仲葉中粗纖維的降解率，促進(jìn)植物細(xì)胞壁的溫和水解。最終所得產(chǎn)品總菌數(shù)≥5.0×108CFU/g，總黃酮≥1.5%，綠原酸≥0.4%，乳酸≥2%。
具體實(shí)施方式
下面對本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)說明。
實(shí)施例1
一種多菌種固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)杜仲葉生物飼料添加劑的方法，包括如下步驟：
（1）、原料采集：采用1芽1葉、1芽2葉或1芽3葉同等嫩度的杜仲鮮葉。
（2）、殺青：采用沸騰干燥，溫度控制70℃，烘干時間20min，控制葉片含水量在12%以下，冷卻至室溫，開始粉碎。
（3）、原料的粉碎：將杜仲葉、豆粕、玉米、麩皮進(jìn)行粉碎，過30目篩。
（4）、發(fā)酵菌種的制備：
1）、黑曲霉菌種的制備：
a.菌種的活化：取黑曲霉凍干粉，接入黑曲霉液體試管中，25℃、160r/min，振蕩培養(yǎng)48h。
b.茄子瓶菌種制備：取試管菌種1mL加入到500mL茄子瓶斜面培養(yǎng)基中，涂布均勻，25℃靜置培養(yǎng)48h。
c.固體擴(kuò)培：取杜仲葉35%，麩皮35%，豆粕粉30%，加入0.3~0.5%的氯化鈉和純水混勻，料水比控制在1:0.35，用手?jǐn)D壓無水滴為宜，然后滅菌，冷卻至35℃以下時，將茄子瓶孢子用無菌水沖洗，接入上述物料中，放入淺盤中，覆蓋一層保鮮膜，發(fā)酵溫度25~30℃，培養(yǎng)時間48~72h，每隔24h翻料通氣，發(fā)酵好后，至于通風(fēng)干燥處風(fēng)干，密封保存，即得黑曲霉生產(chǎn)種子。
所述黑曲霉活化及斜面培養(yǎng)基組成成分包括：馬鈴薯（去皮）200g/L，杜仲葉粉20g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂20g/L。
2）、枯草芽孢桿菌菌種的制備：
a.菌種活化：取枯草芽孢桿菌凍干粉，接入牛肉膏蛋白胨液體試管中，試管裝液量10mL，37℃、160r/min培養(yǎng)16h。
b.一級三角瓶種子：將活化好的菌液接入一級三角瓶（500mL），搖瓶裝液量200mL，接種量1%，37℃、160r/min培養(yǎng)16h。
c.二級搖瓶種子：將一級搖瓶接入二級搖瓶中（5L），二級搖瓶裝液量2L，接種量3%，37℃、160r/min培養(yǎng)16h。
d.一級種子罐：培養(yǎng)好的二級搖瓶種子接入一級種子罐（100L），發(fā)酵罐裝液系數(shù)60%，接種量1%，轉(zhuǎn)速150r/min，0~6h，通風(fēng)比1:0.5，6h后通風(fēng)比1:0.8，培養(yǎng)時間14~18h。
e.發(fā)酵罐培養(yǎng)：一級種子罐菌液按照5%比例接入發(fā)酵罐（1000L）中，轉(zhuǎn)速150~200r/min，0~6h，通風(fēng)比1:0.5，6h后通風(fēng)比1:0.8，培養(yǎng)時間12h。
搖瓶種子培養(yǎng)基組成成分包括：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，葡萄糖5g/L，NaCl 5g/L，pH 7.0~7.2。
種子罐與發(fā)酵罐培養(yǎng)基組成成分包括：玉米粉15g/L，淀粉2g/L，豆粕20g/L，酵母膏2g/L，硫酸錳0.3g/L，碳酸鈣0.05g/L，pH 7.0。
3）、糞腸球菌菌液制備：
a.菌種活化：取糞腸球菌凍干粉，液體活化試管（裝液量9mL），35℃靜置培養(yǎng)22h。
b.三角瓶種子：將活化后種子接入三角瓶中（250mL三角瓶裝液量150mL），35℃培養(yǎng)22h，轉(zhuǎn)速120r/min。
c.搖瓶種子制備：將三角瓶成熟菌種接入搖瓶中（5L搖瓶裝液量3L)，接種量2%，35℃培養(yǎng)16h，轉(zhuǎn)速120r/min。
d.一級種子罐：搖瓶種子接入一級種子罐，接種量1%，溫度35℃，通風(fēng)比與轉(zhuǎn)速：0~2h，不通風(fēng)不攪拌，之后通風(fēng)比 1:0.2，攪拌轉(zhuǎn)速80r/min。
e.發(fā)酵罐菌液：一級種子罐菌液接入發(fā)酵罐中，接種量5%，溫度35℃，通風(fēng)比與轉(zhuǎn)速：0~2h，不通風(fēng)不攪拌，之后通風(fēng)比 1:0.2，攪拌轉(zhuǎn)速80r/min。
所述糞腸球菌活化及三角瓶培養(yǎng)基組成成分包括：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，乳糖20g/L，pH 6.8。
所述糞腸球菌搖瓶種子、一級種子罐及發(fā)酵罐培養(yǎng)基組成成分包括：蛋白胨20g/L，牛肉膏2g/L，氯化鈉2g/L，葡萄糖20g/L，碳酸鈣5g/L，pH 6.8。
（5）、固態(tài)發(fā)酵：
a.物料混合：將按照杜仲葉85%，玉米粉10%，豆粕粉5%比例將物料進(jìn)行混合，高壓蒸汽滅菌(溫度121~123℃，時間20~30 min）。待物料冷卻至38~40℃后，黑曲霉加入到上述混合料中，混合均勻，然后將枯草芽孢桿菌菌液加入到純水中混勻，再與上述物料混勻，純水添加量為物料干重的45%，然后將最終混合料送入發(fā)酵室（10萬級凈化）。
b.好氧發(fā)酵階段：將混合好的物料轉(zhuǎn)運(yùn)到發(fā)酵室，發(fā)酵室溫度控制在25~30℃，每天翻堆一次，控制發(fā)酵室相對濕度70~80%，發(fā)酵5d。
c.厭氧發(fā)酵階段：好氧發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵飼料打散，將糞腸球菌菌液接入物料中，然后裝入單向閥發(fā)酵袋中，發(fā)酵室溫度控制在25~30℃，進(jìn)行厭氧發(fā)酵，發(fā)酵時間24h。
(6)低溫烘干：將發(fā)酵好的物料轉(zhuǎn)入沸騰干燥車間，控制沸騰干燥溫度40~45℃，待物料水分達(dá)5~10%時，即可取樣送檢，檢驗(yàn)合格后，按照規(guī)定要求分裝和包裝。
實(shí)施例2
一種多菌種固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)杜仲葉生物飼料添加劑的方法，包括如下步驟：
（1）、原料采集：采用1芽1葉、1芽2葉或1芽3葉同等嫩度的杜仲鮮葉。
（2）、殺青：采用沸騰干燥，溫度控制80℃，烘干時間30min，控制葉片含水量在12%以下，冷卻至室溫，開始粉碎。
（3）、原料的粉碎：將杜仲葉、豆粕、玉米、麩皮進(jìn)行粉碎，過30目篩。
（4）、發(fā)酵菌種的制備：
1）、黑曲霉菌種的制備：
a.菌種的活化：取黑曲霉凍干粉，接入黑曲霉液體試管中，30℃、220r/min，振蕩培養(yǎng)48h。
b.茄子瓶菌種制備：取試管菌種1mL加入到500mL茄子瓶斜面培養(yǎng)基中，涂布均勻，30℃靜置培養(yǎng)72h。
c.固體擴(kuò)培：取杜仲葉粉40%，麩皮40%，豆粉粉20%，加入0.5%的氯化鈉和純水混勻，料水比控制在1:0.5，用手?jǐn)D壓無水滴為宜，然后滅菌，冷卻至35℃以下時，將茄子瓶孢子用無菌水沖洗，接入上述物料中，放入淺盤中，覆蓋一層保鮮膜，發(fā)酵溫度30℃，培養(yǎng)時間72h，每隔24h翻料通氣，發(fā)酵好后，置于通風(fēng)干燥處風(fēng)干，密封保存，即得黑曲霉生產(chǎn)種子。
所述黑曲霉活化及斜面培養(yǎng)基組成成分包括：馬鈴薯（去皮）200g/L，杜仲葉粉20g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂20g/L。
2）、枯草芽孢桿菌菌種的制備：
a.菌種活化：取枯草芽孢桿菌凍干粉，接入牛肉膏蛋白胨液體試管中，試管裝液量10ml，37℃、220r/min培養(yǎng)24h。
b.一級三角瓶種子：將活化好的菌液接入一級三角瓶（500mL），搖瓶裝液量200ml，接種量3%，37℃、220r/min培養(yǎng)24h。
c.二級搖瓶種子：將一級搖瓶接入二級搖瓶中（5L），二級搖瓶裝液量2L，接種量6%，37℃、220r/min培養(yǎng)18h。
d.一級種子罐：培養(yǎng)好的二級搖瓶種子接入一級種子罐（100L），發(fā)酵罐裝液系數(shù)60%，接種量1%，轉(zhuǎn)速200r/min，0~6h，通風(fēng)比1:0.5，6h后通風(fēng)比1:0.8，培養(yǎng)時間18h。
e.發(fā)酵罐培養(yǎng)：一級種子罐菌液按照10%比例接入發(fā)酵罐（1000L）中，轉(zhuǎn)速200r/min，0~6h，通風(fēng)比1:0.5，6h后通風(fēng)比1:0.8，培養(yǎng)時間16h。
搖瓶種子培養(yǎng)基組成成分包括：牛肉膏5g，蛋白胨10g/L，葡萄糖5g/L，NaCl 5g/L，pH 7.2。
種子罐與發(fā)酵罐培養(yǎng)基組成成分包括：玉米粉20g/L，淀粉4g/L，豆粕30g/L，酵母膏4g/L，硫酸錳0.6g/L，碳酸鈣0.2g/L，pH 7.2。
3）、糞腸球菌菌液制備：
a.菌種活化：取糞腸球菌凍干粉，液體活化試管（裝液量9mL），39℃靜置培養(yǎng)24h。
b.三角瓶種子：將活化后種子接入三角瓶中（250mL三角瓶裝液量150mL），39℃培養(yǎng)24h，轉(zhuǎn)速120r/min。
c.搖瓶種子制備：將三角瓶成熟菌種接入搖瓶中（5L搖瓶裝液量3L)，接種量5%，39℃培養(yǎng)20h，轉(zhuǎn)速120r/min。
d.一級種子罐：搖瓶種子接入一級種子罐，接種量2%，溫度39℃，通風(fēng)比與轉(zhuǎn)速：0~2h，不通風(fēng)不攪拌，之后通風(fēng)比 1:0.2，攪拌轉(zhuǎn)速100r/min。
e.發(fā)酵罐菌液：一級種子罐菌液接入發(fā)酵罐中，接種量10%，溫度39℃，通風(fēng)比與轉(zhuǎn)速：0~2h，不通風(fēng)不攪拌，之后通風(fēng)比 1:0.2，攪拌轉(zhuǎn)速100r/min。
糞腸球菌活化及三角瓶培養(yǎng)基組成成分包括：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，乳糖20g/L，pH 7.2。
糞腸球菌搖瓶種子、一級種子罐及發(fā)酵罐培養(yǎng)基組成成分包括：蛋白胨40g/L，牛肉膏5g/L，氯化鈉5g/L，葡萄糖40g/L，碳酸鈣20g/L，pH 7.2。
（5）、固態(tài)發(fā)酵：
a.物料混合：將按照杜仲葉粉80%，玉米粉10%，豆粕10%比例將物料進(jìn)行混合，高壓蒸汽滅菌（溫度121~123℃，時間20~30 min）。待物料冷卻至38~40℃后，黑曲霉加入到上述混合料中，混合均勻，然后將枯草芽孢桿菌菌液加入到純水中混勻，再與上述物料混勻，純水添加量為物料干重的40%，然后將最終混合料送入發(fā)酵室（10萬級凈化）。
b.好氧發(fā)酵階段：將混合好的物料轉(zhuǎn)運(yùn)到發(fā)酵室，發(fā)酵室溫度控制在25~30℃，每天翻堆一次，控制發(fā)酵室相對濕度70~80%，發(fā)酵7d。
c.厭氧發(fā)酵階段：好氧發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵飼料打散，將糞腸球菌菌液接入物料中，然后裝入單向閥發(fā)酵袋中，發(fā)酵室溫度控制在25~30℃，進(jìn)行厭氧發(fā)酵，發(fā)酵時間36h。
（6）、低溫烘干：將發(fā)酵好的物料轉(zhuǎn)入沸騰干燥車間，控制沸騰干燥溫度40~45℃，待物料水分達(dá)5~10%時，即可取樣送檢，檢驗(yàn)合格后，按照規(guī)定要求分裝和包裝。
實(shí)施例3
一種多菌種固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)杜仲葉生物飼料添加劑的方法，包括如下步驟：
（1）、原料采集：采用1芽1葉、1芽2葉或1芽3葉同等嫩度的杜仲鮮葉。
（2）、殺青：采用沸騰干燥，溫度控制70~80℃，烘干時間20~30min，控制葉片含水量在12%以下，冷卻至室溫，開始粉碎。
（3）、原料的粉碎：將杜仲葉、豆粕、玉米、麩皮進(jìn)行粉碎，過30目篩。
（4）、發(fā)酵菌種的制備：
1）、黑曲霉菌種的制備：
a.菌種的活化：取黑曲霉凍干粉，接入黑曲霉液體試管中，28℃、190r/min，振蕩培養(yǎng)48h。
b.茄子瓶菌種制備：取試管菌種1mL加入到500mL茄子瓶斜面培養(yǎng)基中，涂布均勻，28℃，靜置培養(yǎng)56h。
c.固體擴(kuò)培：取杜仲葉45%，麩皮30%，豆粕粉25%，加入0.35%的氯化鈉和純水混勻，料水比控制在1:0.4，用手?jǐn)D壓無水滴為宜，然后滅菌，冷卻至35℃以下時，將茄子瓶孢子用無菌水沖洗，接入上述物料中，放入淺盤中，覆蓋一層保鮮膜，發(fā)酵溫度28℃，培養(yǎng)時間60h，每隔24h，翻料通氣，發(fā)酵好后，置于通風(fēng)干燥處風(fēng)干，密封保存，即得黑曲霉生產(chǎn)種子。
黑曲霉活化及斜面培養(yǎng)基組成成分包括：馬鈴薯（去皮）200g/L，杜仲葉粉20g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂20g/L。
2）、枯草芽孢桿菌菌種的制備：
a.菌種活化：取枯草芽孢桿菌凍干粉，接入牛肉膏蛋白胨液體試管中，試管裝液量10mL，37℃、200r/min培養(yǎng)20h。
b.一級三角瓶種子：將活化好的菌液接入一級三角瓶（500mL），搖瓶裝液量200mL，接種量2%，37℃、200r/min培養(yǎng)18h。
c.二級搖瓶種子：將一級搖瓶接入二級搖瓶（5L），二級搖瓶裝液量2L，接種量4%，37℃、200r/min培養(yǎng)17h。
d.一級種子罐：培養(yǎng)好的二級搖瓶種子接入一級種子罐（100L），發(fā)酵罐裝液系數(shù)60%，接種量1%，轉(zhuǎn)速200r/min，0~6h，通風(fēng)比1:0.5，6h后通風(fēng)比1:0.8，培養(yǎng)時間15h。
e.發(fā)酵罐培養(yǎng)：一級種子罐菌液按照8%比例接入發(fā)酵罐（1000L）中，轉(zhuǎn)速180r/min，0~6h，通風(fēng)比1:0.5，6h后通風(fēng)比1:0.8，培養(yǎng)時間14h。
搖瓶種子培養(yǎng)基組成成分包括：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，葡萄糖5g/L，NaCl 5g/L，pH 7.0-7.2。
種子罐與發(fā)酵罐培養(yǎng)基組成成分包括：玉米粉18g/L，淀粉3g/L，豆粕25g/L，酵母膏2.5g/L，硫酸錳0.5g/L，碳酸鈣0.1g/L，pH 7.0-7.2。
3）、糞腸球菌菌液制備：
a.菌種活化：取糞腸球菌凍干粉，液體活化試管（裝液量9mL），37℃靜置培養(yǎng)23h。
b.三角瓶種子：將活化后種子接入三角瓶中（250mL三角瓶裝液量150mL），37℃培養(yǎng)23h，轉(zhuǎn)速120r/min。
c.搖瓶種子制備：將三角瓶成熟菌種接入搖瓶中（5L搖瓶裝液量3L)，接種量3%，37℃培養(yǎng)18h，轉(zhuǎn)速120r/min。
d.一級種子罐：搖瓶種子接入一級種子罐，接種量1.5%，溫度37℃，通風(fēng)比與轉(zhuǎn)速：0~2h，不通風(fēng)不攪拌，之后通風(fēng)比 1:0.2，攪拌轉(zhuǎn)速85r/min。
e.發(fā)酵罐菌液：一級種子罐菌液接入發(fā)酵罐中，接種量8%，溫度37℃，通風(fēng)比與轉(zhuǎn)速：0~2h，不通風(fēng)不攪拌，之后通風(fēng)比 1:0.2，攪拌轉(zhuǎn)速85r/min。
糞腸球菌活化及三角瓶培養(yǎng)基組成成分包括：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，乳糖20g/L，pH 6.8~7.2。
糞腸球菌搖瓶種子、一級種子罐及發(fā)酵罐培養(yǎng)基組成成分包括：蛋白胨25g/L，牛肉膏4g/L，氯化鈉4g/L，葡萄糖25g/L，碳酸鈣15g/L，pH 6.8-7.2。
（5）、固態(tài)發(fā)酵：
a.物料混合：將按照杜仲葉82%，玉米粉8%，豆粕粉10%比例將物料進(jìn)行混合，高壓蒸汽滅菌（溫度121~123℃，時間20~30 min）。待物料冷卻至38~40℃后，黑曲霉加入到上述混合料中，混合均勻，然后將枯草芽孢桿菌菌液加入到純水中混勻，再與上述物料混勻，純水添加量為物料干重的50%，然后將最終混合料送入發(fā)酵室（10萬級凈化）。
b.好氧發(fā)酵階段：將混合好的物料轉(zhuǎn)運(yùn)到發(fā)酵室，發(fā)酵室溫度控制在25~30℃，每天翻堆一次，控制發(fā)酵室相對濕度70~80%，發(fā)酵7d。
c.厭氧發(fā)酵階段：好氧發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵飼料打散，將糞腸球菌菌液接入物料中，然后裝入單向閥發(fā)酵袋中，發(fā)酵室溫度控制在25~30℃，進(jìn)行厭氧發(fā)酵，發(fā)酵時間30h。
（6）、低溫烘干：將發(fā)酵好的物料轉(zhuǎn)入沸騰干燥車間，控制沸騰干燥溫度40~45℃，待物料水分達(dá)5~10%時，即可取樣送檢，檢驗(yàn)合格后，按照規(guī)定要求分裝和包裝。
最后所應(yīng)說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照本發(fā)明實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，都不脫離本發(fā)明的技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋權(quán)利要求保護(hù)范圍中。