本發(fā)明涉及雞蛋的孵化工藝，具體涉及提高免疫球蛋白含量的胚蛋孵化工藝。
背景技術(shù)：
：雞胚蛋是受精雞蛋經(jīng)特殊孵化工藝，使胚胎不斷生長發(fā)育，具有生命力的雞蛋，又稱之為“活珠子”、“毛蛋”等。實際上雞胚蛋就是受精雞蛋孵化至一定天數(shù)后，還未破殼，可食用的雞蛋?！侗静菥V目》記載：“雞胚蛋有治頭痛、偏頭痛、頭瘋病及四肢瘋瘴之功能”。童叟弱者常食之，有健脾胃作用，遂而起到強身健體之功效。雞胚蛋味道鮮美，功效神奇，民間早有食用習(xí)慣，并作為營養(yǎng)、進補和治病的佳品，廣為流傳?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明，雞胚蛋所含成分大體上可分為三類，即營養(yǎng)成分、抗感染成分和生物活性物質(zhì)。營養(yǎng)成分有蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪、維生素和礦物質(zhì)等；抗感染成分有球蛋白、干擾素、溶菌酶和磷酸二酯酶；生物活性物質(zhì)有免疫球蛋白、唾液酸等。免疫球蛋白，尤其是雞蛋黃免疫球蛋白IgY，具有抗體活性，參與人體營養(yǎng)代謝和生理調(diào)節(jié)功能，能排除人體毒素，防御和殺死進入人體的細菌和病毒，具有抗疲勞和提高免疫力的作用。在雞胚生長發(fā)育過程中，IgY的含量會逐漸增加，一般情況下，在孵化期的第10～19天內(nèi)維持在一個較高水平，通常比鮮雞蛋提高50％，鮮雞蛋中IgY的含量為8～10mg/ml。因此，在孵化期的第10～19天內(nèi)突然中斷孵化，得到的胚蛋中IgY含量最高，具有較高的抗疲勞和提高免疫力的功效。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種進一步提高蛋黃免疫球蛋白(IgY)含量的提高免疫球蛋白含量的胚蛋孵化工藝。本發(fā)明提供的技術(shù)方案是一種提高免疫球蛋白含量的胚蛋孵化工藝，將受精種蛋送入孵化器中，在黑暗條件下孵化10～19天，在孵化期，對受精種蛋進行60Coγ射線輻射總時間為2～5min，輻射劑量率為20～30GY/min。在整個孵化期間，對受精種蛋進行60Coγ射線輻射總時間為2～5min，輻射劑量率為20～30GY/min。受精種蛋為雞受精種蛋，在雞胚蛋在孵育期，進行低劑量的60Coγ射線輻射，可以刺激淋巴細胞和單核巨噬細胞增殖，促進細胞分化，提高免疫球蛋白的合成。在整個孵化期間，對受精種蛋進行60Coγ射線輻射總時間為2～5min，輻射劑量率為20～30GY/min。其中，可以在孵化期的第4～5天，對受精種蛋進行60Coγ射線輻射1～1.5min,,輻射劑量率為20～25GY/min，剩余輻射劑量和輻射時間可以在孵化期內(nèi)任意時間內(nèi)進行。雞胚蛋在孵育期的第4～5天，腔上囊出現(xiàn)上皮細胞團的原基，繼之原基發(fā)育出粘膜腔，此時是腔上囊的發(fā)育的第一個高峰期，在這個時候?qū)﹄u蛋進行60Coγ射線輻射，可以刺激上皮細胞的分化，而上皮細胞可以大量分化產(chǎn)生淋巴細胞，而淋巴細胞又能分化產(chǎn)生免疫球蛋白，從而為免疫球蛋白的合成提供了前提。在整個孵化期間，對受精種蛋進行60Coγ射線輻射總時間為2～5min，輻射劑量率為20～30GY/min。其中，可以在孵化期的第4～5天，對受精種蛋進行60Coγ射線輻射1～1.5min,,輻射劑量率為20～25GY/min；進一步地，還可以在孵化期的第12～13天，對受精種蛋進行60Coγ射線輻射1～3.5min,輻射劑量率為25～30GY/min。雞胚蛋在孵育期的第12～13天，腔上囊的粘膜上皮出現(xiàn)上皮芽的芽狀突起，上皮芽不斷分化、長大，逐漸深入粘膜上皮下的固有膜中，同時，淋巴細胞在芽體中和芽體周圍的組織中出現(xiàn)，最后形成濾泡。濾泡形成的同時，粘膜上皮也隨之分化成連濾泡上皮和濾泡間上皮。此時是腔上囊發(fā)育的第二個高峰期，腔上囊粘膜層固有膜中有大量淋巴上皮濾泡和與此相關(guān)的粘膜上皮的分化，淋巴上皮濾泡的頂部朝向粘膜腔，在固有膜中緊密排成層；濾泡由皮質(zhì)和髓質(zhì)組成，中央為髓質(zhì)，皮質(zhì)套在髓質(zhì)外。髓質(zhì)來源于粘膜上皮，多凸起的網(wǎng)狀上皮細胞構(gòu)成網(wǎng)狀支架，網(wǎng)眼中填充著淋巴細胞、巨噬細胞和少量漿細胞、粒細胞。此時對其進行第二次60Coγ射線輻射可以刺激網(wǎng)眼中淋巴細胞和單核巨噬細胞的增殖，促進細胞分化，從而產(chǎn)生大量的免疫球蛋白。孵化期間，控制孵化溫度為37.5～38.5℃，濕度為50～60％。受精種蛋孵化14～19天為宜，因為孵育期第12-13天時，大量的巨噬細胞和淋巴細胞生成，從而產(chǎn)生大量的免疫球蛋白。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的孵化工藝可以大大提高胚蛋中免疫球蛋白的含量，尤其是蛋黃免疫球蛋白的含量，從而大大提升了胚蛋的抗疲勞和提高免疫力的功效，十分具有商業(yè)價值。具體實施方式以下具體實施例對本發(fā)明作進一步闡述，但不作為對本發(fā)明的限定。實施例1將商品代尼克珊瑚粉蛋雞的受精種蛋送入孵化器中，在黑暗條件下孵化10天，控制孵化溫度為37.5℃，濕度為50％；在孵化期的第1天，對受精種蛋進行60Coγ射線輻射2min，輻射劑量率為20GY/min。實施例2將商品代尼克珊瑚粉蛋雞雞受精種蛋送入孵化器中，在黑暗條件下孵化15天，控制孵化溫度為38.5℃，濕度為60％；在孵化期的第10天，對受精種蛋進行60Coγ射線輻射5min，輻射劑量率為30GY/min。實施例3將商品代尼克珊瑚粉蛋雞的受精種蛋送入孵化器中，在黑暗條件下孵化19天，控制孵化溫度為38℃，濕度為55％；在孵化期的第19天，對受精種蛋進行60Coγ射線輻射3min，輻射劑量率為25GY/min。實施例4將商品代尼克珊瑚粉蛋雞的受精種蛋送入孵化器中，在黑暗條件下孵化19天，控制孵化溫度為38℃，濕度為55％；在孵化期的第4天，對受精種蛋進行60Coγ射線輻射1min,輻射劑量率為20GY/min。在孵化期的第19天，對受精種蛋進行60Coγ射線輻射3min,輻射劑量率為20GY/min。實施例5將商品代尼克珊瑚粉蛋雞的受精種蛋送入孵化器中，在黑暗條件下孵化19天，控制孵化溫度為38℃，濕度為55％；在孵化期的第4天，對受精種蛋進行60Coγ射線輻射1.5min,輻射劑量率為25GY/min。在孵化期的第19天，對受精種蛋進行60Coγ射線輻射3.5min,輻射劑量率為30GY/min。實施例6將商品代尼克珊瑚粉蛋雞的受精種蛋送入孵化器中，在黑暗條件下孵化19天，控制孵化溫度為38℃，濕度為55％；在孵化期的第5天，對受精種蛋進行60Coγ射線輻射1min,輻射劑量率為25GY/min。在孵化期的第13天，對受精種蛋進行60Coγ射線輻射3.5min,輻射劑量率為30GY/min。對照例將商品代尼克珊瑚粉蛋雞的受精種蛋送入孵化器中，在黑暗條件下孵化孵化19天，控制孵化溫度為38℃，濕度為55％。取實施例1～6和對照例的胚蛋各10枚，去殼，逐一檢測每枚胚蛋中IgY的含量，具體結(jié)果見下表：注：與對照組相比，*p＜0.05；**p＜0.01。為檢測本申請的胚蛋提高免疫力的效果，對小鼠進行免疫試驗，詳情如下：1、試驗方法將實施例1～6以及對照例的雞胚進行預(yù)煮，煮制，去殼，絞碎，烘干，粉碎過篩加生理鹽水分別配制成濃度為1.2g/kg的胚蛋混懸液。免疫試驗：將2月齡SPF級KM雌性小白鼠56只，隨機分為7組，分別為試驗組1～6和對照組，每組8只。試驗組1～6的每只小鼠分別灌喂0.4ml實施例1～6的胚蛋制成的胚蛋混懸液，對照組的每只小鼠灌胃0.4ml對照例的胚蛋制成胚蛋混懸液。小鼠自由采食、飲水，飼養(yǎng)過程中，每天換水，隔日換墊料。每日灌胃一次，連續(xù)灌胃30d。2、試劑配制雞紅細胞CRBC)懸液：新鮮抗凝雞血，置2500r/min離心5min，棄上層血漿和白細胞層，用生理鹽水稀釋紅細胞8倍，輕輕混合洗滌，吸棄上清液，反復(fù)洗滌，至上清液無色，以除去血漿蛋白的蛋白細胞，最后一次盡量吸棄生理鹽水，即為壓積紅細胞，根據(jù)所需濃度，用生理鹽水稀釋雞紅細胞即可。綿羊紅細胞(SRBC)懸液：綿羊靜脈取血，將羊血放入玻璃珠的滅菌錐形瓶中朝一個方向搖動，以脫纖維，放入4℃冰箱保存?zhèn)溆?。補體：采集豚鼠血，分離出血清(至少5只豚鼠的混合血清)，將1ml壓積SRBC加入到5ml豚鼠血清中，4℃冰箱放置30min，經(jīng)常振蕩，離心去上清，分裝，-70℃保存。用時以SA緩沖液按1：10稀釋。Hank’s液：NaCl8g、KCl0.4g、Na2HPO4·12H2O0.152g、KH2PO40.06g、酚紅(0.005g，先用NaHCO3溶液溶解)用蒸餾水定容至1000ml，用NaHCO3溶液調(diào)節(jié)PH值7.2～7.4，高溫滅菌。3、脾臟指數(shù)的測定試驗結(jié)束后小鼠禁食12h稱重，取小鼠脾臟稱重，按下式計算脾臟指數(shù)：脾臟指數(shù)＝脾臟重/體重；4、小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的測定小鼠巨噬細胞的激活：試驗前4d給每只小鼠腹腔注射2％壓積綿羊紅細胞0.2ml。巨噬細胞的孵育：用頸椎脫臼法處死小鼠，腹腔注射加入小牛血清的Hank’s液4ml/只，輕輕按揉腹部20次，以充分洗出腹腔巨噬細胞，然后將腹腔剪開一個小口，吸取腹腔洗液0.5ml與0.5ml1％CRBC懸液混合，取0.5ml混合液，低于載玻片的瓊脂圈內(nèi)，放置孵化器內(nèi)孵育15min。染色：孵育結(jié)束后迅速用生理鹽水將未貼壁細胞沖掉，于甲醇液中固定1min，Giemsa液染色15min，用蒸餾水沖洗干凈，晾干，用40倍顯微鏡計數(shù)，并按下式計算吞噬率和吞噬指數(shù)。吞噬率＝吞噬雞紅細胞的巨噬細胞數(shù)/200個巨噬細胞×100％吞噬指數(shù)＝吞噬的雞紅細胞總數(shù)/200個巨噬細胞5、血清溶血素(IgM)測定免疫動物：將壓積SRBC用生理鹽水配成2％的細胞懸液，每只小鼠付清注射0.2ml進行免疫。免疫7d后摘除眼球取血置于離心管，放置約1h,將凝固血瘀管壁剝離，使血清充分析出，2000r/min離心10min，收集血清。取血清10μl，用生理鹽水稀釋100倍。稀釋血清1ml與0.5ml5％CRBC\0.5ml10％補體混合，在37℃下保溫30min，冰水浴上終止反應(yīng)。離心取上清液，在540nm波長處比色，以不加血清的空白作為對照。6、對小鼠游泳時間的影響末次灌胃30min后，將尾根部負(fù)荷5％(體重)鉛皮的小鼠置游泳箱(50cm×50cm×40cm)中游泳，水溫25℃±1.0℃，記錄小鼠自游泳開始至死亡時間，即小鼠負(fù)重游泳時間(min)。7、試驗結(jié)果1)雞胚蛋對小鼠脾臟指數(shù)的影響(x±s)組別脾臟指數(shù)(mg/g)對照組3.6134±0.6465試驗1組5.5261±0.6338*試驗2組5.4285±0.2334*試驗3組5.5282±0.4965*試驗4組6.0921±0.7335**試驗5組6.0295±0.9591*試驗6組6.6134±0.3579*注：與對照組相比，*p＜0.05；**p＜0.01。2)對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響組別吞噬率吞噬指數(shù)對照組43.50±3.700.64±0.07試驗1組59.75±2.84*0.81±0.17*試驗2組60.75±4.5**0.82±0.02*試驗3組58.00±3.74*0.80±0.03*試驗4組65.50±4.43*0.85±0.06**試驗5組65.16±1.73*0.84±0.08*試驗6組70.25±5.31**0.89±0.05*注：與對照組相比，*p＜0.05；**p＜0.01。3)對小鼠血清溶血素生成的影響雞紅細胞CRBC)懸液：新鮮抗凝雞血，置2500r/min離心5min，棄上層血漿和白細胞層，用生理鹽水稀釋紅細胞8倍，輕輕混合洗滌，吸棄上清液，反復(fù)洗滌，至上清液無色，以除去血漿蛋白的蛋白細胞，最后一次盡量吸棄生理鹽水，即為壓積紅細胞，根據(jù)所需濃度，用生理鹽水稀釋雞紅細胞即可。對CRBC免疫小鼠，使其淋巴細胞產(chǎn)生特異性抗CRBC抗體，并釋放至外周血，含抗體的血清與CRBC一起孵育時，在補體參與下產(chǎn)生溶血并釋放出血紅蛋白，溶液呈紅色，測定溶液的吸收值，計算半數(shù)溶血值HC50，反映IgM抗體水平。組別半數(shù)溶血值HC50對照組428.91±36.43試驗1組585.35±61.40*試驗2組576.71±27.89*試驗3組568.16±26.94*試驗4組594.98±79.24**試驗5組599.60±19.17*試驗6組609.42±94.18*注：與對照組相比，*p＜0.05；**p＜0.01。4)對小鼠游泳時間的影響組別時間(min)對照組7.67±0.35試驗1組16.65±1.42試驗2組16.72±2.01試驗3組16.49±1.31試驗4組18.35±2.43試驗5組18.26±3.16試驗6組19.47±1.43注：與對照組相比，*p＜0.05；**p＜0.01。為檢測本申請的胚蛋抗疲勞的效果，對小鼠進行抗疲勞試驗，詳情如下：1、試驗方法將實施例1～6以及對照例的雞胚進行預(yù)煮，煮制，去殼，絞碎，烘干，粉碎過篩加生理鹽水分別配制成濃度為1.2g/kg的胚蛋混懸液。SPF級昆明種雄性小白鼠210只，體重20g±2g，小白鼠預(yù)飼一周后，隨機分為7組，分別為試驗組1～6和對照組，每組30只。試驗組1～6的每只小鼠分別灌喂0.4ml實施例1～6的胚蛋制成的胚蛋混懸液，對照組的每只小鼠灌胃0.4ml對照例的胚蛋制成胚蛋混懸液。小鼠自由采食、飲水，飼養(yǎng)過程中，每天換水，隔日換墊料。每日灌胃一次，連續(xù)灌胃30d。2、負(fù)重游泳試驗?zāi)┐喂辔?0min后，將尾根部負(fù)荷5％(體重)鉛皮的小鼠置游泳箱(50cm×50cm×40cm)中游泳，水溫25℃±1.0℃，記錄小鼠自游泳開始至沉下水8s不浮起，即小鼠游泳時間(min)。逐只記錄運動開始至力竭時間，作為小鼠游泳時間，小鼠力竭后，迅速將其撈出水池，于保溫箱內(nèi)用吹風(fēng)筒吹干放入籠中正常飼養(yǎng)。3、血尿素氮BUN乳酸脫氫酶LDH的測定末次灌胃30min后，在水溫30℃±1.0℃的水中不負(fù)重游泳90min，休息60min后眼球采血，分離出血清，全自動生化分析儀測定血清尿素氮含量。末次灌胃30min后，眼球采血，分離出血清，全自動生化分析儀測定乳酸脫氫酶活性。4、肝糖原HG的測定1)樣品制備小鼠末次灌胃30min后，在水溫30℃±1.0℃的水中游泳90min，立即處死，取肝臟，經(jīng)審理鹽水漂洗后用濾渣吸干，精確稱取肝臟越100mg，加入4mlTCA，每管勻漿1min，將勻漿液倒入離心管，以3000r/min離心15min，將上清液移至另一試管內(nèi)。在沉淀中再加入TCA，勻漿1min，再離心15min，去上清液，并與第一次離心的上清液合并，充分混勻。取1ml上清液，放入10ml離心管中，每管加入95％乙醇4ml，充分混勻至兩種液體間不留界面。用干凈塞子塞上，室溫下豎直放置過夜。沉淀完全后，經(jīng)試管于3000r/min離心15min。小心倒掉上清液并使試管倒立放置10min.用2ml蒸餾水溶解糖原，加水時管壁的糖原洗下。試劑空白：吸2ml蒸餾水到干凈離心管。標(biāo)準(zhǔn)管：吸0.5ml葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液和1.5ml蒸餾水放入同一管中。2)樣品糖原含量測定72％H2SO4：燒杯中加入280ml蒸餾水，再加入濃硫酸720ml。蒽酮試劑：H2SO4中放入500mg蒽酮，10g高純度的硫脲，適當(dāng)晃動燒杯混勻。冷卻后放入冰箱備用。將10ml蒽酮試劑加入樣品試管，充分混勻。從試管注入蒽酮試劑時起，將試管放在冷水龍頭下沖涼。在所有試管都達到?jīng)鏊疁囟群?，將其浸入沸水?5min，然后移到冷水浴，冷卻到室溫。將管內(nèi)液體移入比色管，在620nm波長下用試劑空白管調(diào)零后測定吸光度。根據(jù)所稱取的肝臟的質(zhì)量換算成糖原含量。3)糖原含量計算肝組織中糖原含量(mg/100g)＝A1/A2×0.5×8/0.1×100×0.9；式中A1，A2：分別代表樣品管吸光度和標(biāo)準(zhǔn)管吸光度；0.5：0.5ml葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液中的葡萄糖含量；0.9：將葡萄糖換算成糖原的系數(shù)；8：提取液體積，ml；0.1：肝組織克數(shù)，g。6、血乳酸(LD)的測定末次灌胃30min后，負(fù)重2％(體重)在溫度30℃±1.0℃的水中游泳30min后停止，安靜15min后眼球采血，分離出血清，嚴(yán)格按照試劑盒說明操作測定吸光度，計算血乳酸含量。6、試驗結(jié)果1)雞胚對小鼠游泳時間的影響組別游泳時間(min)對照組12.52±1.06試驗1組25.30±3.07*試驗2組23.08±2.43*試驗3組26.52±3.50*試驗4組30.42±2.50**試驗5組31.95±6.60*試驗6組35.15±2.82*注：與對照組相比，*p＜0.05；**p＜0.01。2)對小鼠血尿素氮(BUN)、乳酸脫氫酶(LDH)的影響機體血尿素氮含量隨著勞動及運動負(fù)荷的增加而增加，機體對負(fù)荷適應(yīng)能力越差，血尿素氮增加越明顯。組別BUN(mmol/L)LDH(U/L)對照組9.37±1.081877.67±134.03試驗1組6.98±0.58*2302.33±147.00試驗2組6.89±0.95*2377.50±89.80*試驗3組6.78±0.47*2351.33±250.86*試驗4組6.45±0.68*2495.00±104.65*試驗5組6.52±0.78**2405.00±89.10*試驗6組6.11±0.78*2485.00±81.17*注：與對照組相比，*p＜0.05；**p＜0.01。3)對小鼠肝糖原(HG)含量的影響注：與對照組相比，*p＜0.05；**p＜0.01。4)對小鼠血乳酸(LD)含量的影響血乳酸含量的變化說明在無氧條件下體內(nèi)的糖酵解的程度，是評價抗疲勞常用的生化指標(biāo)。組別LD(mmol/L)對照組10.18±1.48試驗1組7.98±0.77*試驗2組7.56±1.00*試驗3組7.73±0.66*試驗4組6.59±0.84*試驗5組6.20±0.45*試驗6組6.01±0.22**注：與對照組相比，*p＜0.05；**p＜0.01。當(dāng)前第1頁1 2 3