專利名稱：駱駝初乳免疫球蛋白IgA、IgG的提取工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生化產(chǎn)品領(lǐng)域，尤其是駱駝乳的深加工。
背景技術(shù)：
初乳通常是指母畜分娩后7天特別是3天內(nèi)所分泌的乳汁，其主要特點(diǎn)是色澤黃而濃稠，有特殊的乳腥味和苦味；干物質(zhì)含量明顯高于常乳，其中球蛋白、白蛋白和無(wú)機(jī)鹽類含量特別高，但乳糖含量較常乳低；富含維生素；酸度高；熱穩(wěn)定性差，加熱至60℃即開(kāi)始出現(xiàn)凝塊等。因此，世界各國(guó)乳制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)一般規(guī)定嚴(yán)禁使用初乳作原料乳，生產(chǎn)實(shí)踐中的大量初乳除用于喂養(yǎng)新生幼仔外，富余部分多被廢棄。
科學(xué)研究證實(shí)，初乳是自然界免疫因子最為富集的生物資源之一，其中較為重要的免疫因子就是免疫球蛋白。初乳中存在IgG、IgA、IgM、IgE和IgD等5類免疫球蛋白(Ig)，含量比常乳高10-100倍。IgG是含量最高的Ig，占Ig總量的55％以上。在初乳中IgG含量為50～90mg/mL，是常乳中含量的100倍以上。另外據(jù)研究，駱駝?dòng)鬃兄荒芡ㄟ^(guò)攝入初乳來(lái)獲得母源抗體，因?yàn)轳橊劦奶ケP(pán)結(jié)構(gòu)決定了母源抗體不能通過(guò)胎盤(pán)轉(zhuǎn)移到幼駝，駱駝初乳是免疫球蛋白最豐富的天然來(lái)源。目前初乳資源的開(kāi)發(fā)才開(kāi)始，主要是一些健康食品，產(chǎn)品中活性物質(zhì)的有效濃度不夠高，其免疫活性在加工過(guò)程中損失較大，而且在資源綜合利用方面也較欠缺，初乳本身所具備的潛在價(jià)值得不到充分的反映。因此，高效綜合利用初乳資源，開(kāi)發(fā)出合理的分離技術(shù)路線以提取高純度高活性的天然活性蛋白質(zhì)，特別是從中開(kāi)發(fā)天然的生物藥原料將具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的為提供駱駝初乳免疫球蛋白IgA和IgG的提取工藝。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案如下提取駱駝奶初乳免疫球蛋白IgA的工藝方案1、初乳預(yù)處理①取100mol初乳10000r/min離心10min，收集中層清液。
②取中層清液在0.2mol/l PB(pH6.0)中透析，換液3次以5000r/min，離心10min，收集上清液。
③取上清液，加入飽和0.06mol/l ZnSO4200ml，用1mol/l Na2CO3調(diào)節(jié)pH到6.8--6.9，以5000r/min離心15min，收集上清液。
④取上清液加入飽和(NH4)2SO4300mol，室溫放置30min，以5000r/min離心30min，收集沉淀。
⑤取沉淀溶于60mol H2O中，在0.02mol/l PB(pH8.0)中透析至無(wú)NH4+。
2、IgA分離純化⑥將透析液上DEAE梯度洗脫柱，用0.02mol/l PB至0.3mol/l PB(pH8.0)進(jìn)行梯度洗脫，收集洗脫峰位洗脫液。
⑦將洗脫峰位洗脫液用PEG濃縮至3mol，收集濃縮液。
⑧將濃縮液上分離純化器，用0.01mol/l PBS(pH7.4)緩沖液進(jìn)行洗脫，收集洗脫峰位液，即獲得較純的球蛋白IgA。
提取駱駝初乳免疫球蛋白IgG的工藝方案有超濾法提取工藝和金屬螯合色譜法提取工藝兩種。
一、超濾法提取工藝①將初乳離心分離，得到去脂初乳；
②去除酪蛋白，以去脂初乳∶生理鹽水＝1∶3的比例將去脂初乳稀釋，調(diào)pH4.6，離心去除酪蛋白，得到乳清。
③超濾在超濾儀上用10KD、30KD膜進(jìn)行過(guò)濾，得到濃縮了的乳清。
④梯度洗脫濃縮將超濾得到的濃縮乳清加入PBS緩沖液進(jìn)行梯度洗脫濃縮，取12-17管之間洗脫液峰位的目的蛋白洗脫液。
⑤凝膠層析將目的蛋白洗脫液進(jìn)行凝膠層析，用層析分析儀進(jìn)行分析，得到較純的球蛋白IgG。
二、金屬螯合色譜法提取工藝①將初乳離心分離，得到去脂初乳；②去除酪蛋白，以去脂初乳∶生理鹽水＝1∶3的比例將去脂初乳稀釋，調(diào)pH4.6，離心去除酪蛋白，得到乳清。
③超濾在超濾儀上用10KD、30KD膜進(jìn)行過(guò)濾，得到濃縮了的乳清。
④梯度洗脫濃縮將超濾得到的濃縮乳清在pH8.0-2.8，0.05ml/l Tris HAc和0.5ml/l NaCl連續(xù)梯度洗脫，得到得到UB、P1、P2、P3四種峰位洗脫液，其中P2、P3峰位洗脫液的主要成分為免疫球蛋白G，純度為90％。
⑤將P2、P3峰位洗脫液進(jìn)行金屬螯合色譜法提取，得到純高達(dá)97％的IgG。
本發(fā)明用以上技術(shù)方案成功提取了駱駝初乳免疫球蛋白IgA和IgG，其特點(diǎn)和有益效果如下①I(mǎi)gA在體內(nèi)的存在形式有2種。一種存在于血液中，稱為血清型；另一種存在于分泌的乳汁或體液中，稱為分泌型。分泌型IgA多以二聚體形式存在，其含量比血清中IgA高6～8倍。同時(shí)，在外分泌液中，IgA的含量比IgG高20倍以上，甚至高達(dá)100倍。因此，本發(fā)明在DEAE柱上用適當(dāng)?shù)奶荻认疵摚纯傻玫捷^純的IgA；進(jìn)一步用分子篩提純可得到高純度的IgA。其后梯度PAGE電泳結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)。
②通過(guò)對(duì)駱駝初乳免疫球蛋白IgG乳清液進(jìn)行超濾法濃縮實(shí)驗(yàn)，研究梯度洗脫法對(duì)其純度的影響。結(jié)果表明，梯度洗脫法可以大大提高洗脫液中IgG的含量。說(shuō)明超濾濃縮中的梯度洗脫法是進(jìn)一步提高駱駝初乳中IgG分離純度的有效手段。
③金屬螯合色譜是一種利用金屬離子與蛋白質(zhì)中的某些氨基酸具有獨(dú)特親和力而分離純化蛋白質(zhì)的新技術(shù)。條件溫和，蛋白活性回收率高，同時(shí)具有操作簡(jiǎn)單、處理能力較高、壽命長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)。適宜于生物活性蛋白質(zhì)的提取分離和純化。本發(fā)明應(yīng)用金屬螯合色譜有效的分離純化了駱駝初乳中的免疫球蛋白IgG，純度達(dá)到97％。
④駱駝初乳是免疫球蛋白的優(yōu)良資源，其分離純化條件成熟、處理能力較強(qiáng)?？梢砸择橊劤跞樽鳛樵系玫郊兌容^高的免疫球蛋白，是一種極具開(kāi)發(fā)利用價(jià)值的食品資源。


圖1為本發(fā)明駱駝初乳免疫球蛋白IgA在乳清DEAD洗脫時(shí)測(cè)得DEAE洗脫結(jié)果2為IgA在乳清DEAD洗脫后再經(jīng)分子篩洗脫的結(jié)果3為駱駝初乳免疫球蛋白IgG乳清超濾濃縮時(shí)工作壓力下的流量4為不同濃縮倍數(shù)的乳清梯度洗脫后IgG含量圖5為梯度洗脫后經(jīng)紫外檢測(cè)得到的IgG洗脫曲線圖6IgG的初乳清金屬螯合色譜分離結(jié)果圖上樣量20mol
洗脫方法pH8.0-2.8 0.05mol/l Tris HAc，0.5mol/l NaCl梯度洗脫P(yáng)2、P3峰主要成分為免疫球蛋白IgG具體實(shí)施方式
通過(guò)下述實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步說(shuō)明。
一、駱駝初乳免疫球蛋白IgA的提取1、實(shí)驗(yàn)材料駱駝初乳來(lái)自甘肅安西鎖陽(yáng)鎮(zhèn)張溝村農(nóng)戶。
分離純化用DEAE SepHarose(Fast Flow)及Superdex-200購(gòu)自PHarmacia公司。
室驗(yàn)用0.06mol/l ZnSO4，1mol/l Na2CO3，飽和(NH4+)2SO4，0.2mol/L PB(pH值為8.0)，0.02mol/L PB(pH值為8.0)，0.3mol/L PB(pH值為8.0)，0.01mol/LPBS(pH值為7.4)，梯度PAGE所需試劑為自行配制。
垂直電泳儀為Hofer公司產(chǎn)品，紫外分光光度計(jì)為PHarmacia公司產(chǎn)品，凝膠成像系統(tǒng)為Kodak公司產(chǎn)品。
2實(shí)驗(yàn)方法2.1駱駝初乳的預(yù)處理取100ml駱駝初乳，在10000r/min下，離心10min，取中層乳清，于0.2mol/L PB(pH值為6.0)中透析，換液3次，以5000r/min、離心10min。取上清液，加入200ml、0.06mol/L ZnSO4，用1mol/L Na2CO3調(diào)pH值為6.8～6.9，以5000r/min、離心15min。取上清，加入300ml飽和(NH4)2SO4，室溫放置30min后，以5000r/min、離心30min。取沉淀，溶于60ml H2O中，于0.02mol/L PB(pH值為8.0)中透析至無(wú)NH4+。
2.2駱駝初乳中IgA的分離純化樣品上DEAE SepHarose(Fast Flow)柱，用0.02mol/LPB(pH值為8.0)至0.3mol/L PB(pH值為8.0)梯度洗脫。收集洗脫峰位液，用PEG 20000濃縮至3ml。上Superdex-200柱，用0.01mol/L PBS(pH值為7.4)洗脫，收集洗脫峰位液。經(jīng)PEG 20000濃縮后測(cè)280nm和260nm處的OD值，計(jì)算蛋白濃度。
3實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1駱駝初乳中IgA的分離純化將預(yù)處理后的駱駝初乳清上DEAE SepHarose(Fast Flow)柱，得到的洗脫峰如圖1所示。
由圖1可以看出，駱駝IgA洗脫峰分布在25～38號(hào)管。收集上述各管內(nèi)樣品濃縮后上Superdex-200柱，得到的洗脫峰如圖2所示。
分子篩洗脫只有一個(gè)洗脫峰，可見(jiàn)DEAE梯度洗脫已能將IgA從樣品中分離出來(lái)。為進(jìn)一步鑒定提純的IgA純度，收集19～23號(hào)試管內(nèi)樣品濃縮后采用4％～20％梯度PAGE。結(jié)果表明IgA分子量大小為17ku左右，基本不存在其他雜帶?？梢詳喽ㄔ擇橊劤跞榻?jīng)提純后，已從中得到純的駱駝IgA。測(cè)280nm和260nm處的OD值，計(jì)算其濃度為4.25mg/ml。
二、駱駝初乳免疫球蛋白IgG的提取1材料與方法1.1材料與儀器新鮮駱駝初乳甘肅定西鎖陽(yáng)鎮(zhèn)新溝村農(nóng)戶提供；葡聚糖SepHadex-G200，標(biāo)準(zhǔn)IgG，SDS-PAGE電泳試劑購(gòu)自Sigma公司；Chelating SepHarose fast flow購(gòu)自Pharmacia公司；洗脫液0.1mol/L(pH6.8)磷酸鈉緩沖液自制；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。
超濾儀(法國(guó)Millipore公司)；層析柱(1cm×9cm)，DHL-A電腦恒流泵，梯度混合儀，蠕動(dòng)泵，HD-3紫外檢測(cè)儀，DBS電腦全自動(dòng)部分收集器(上海滬西分析儀器廠)；垂直電泳系統(tǒng)，低溫冷凍離心機(jī)(日本日立公司)。
1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1初乳清的制備新鮮初乳經(jīng)過(guò)濾后，低溫離心3000r/min 30min。棄去上層油脂和下層沉淀，得到去脂初乳。以去脂初乳∶生理鹽水1∶3的比例稀釋，調(diào)pH至4.6，34℃恒溫培養(yǎng)30min，4000r/min 20min離心。棄去上層殘余油脂和下層的酪蛋白沉淀，即得到初乳清。
1.2.2乳清的超濾濃縮超濾儀進(jìn)口壓力207Kpa，出口壓力69Kpa，壓力差134Kpa。分別以10KD、30KD膜過(guò)濾狀態(tài)下工作。
1.2.3凝膠的處理Sephadex G-200干粉蒸餾水室溫充分溶脹24小時(shí)，然后用傾泌法將懸浮的較細(xì)顆粒除去。
1.2.4金屬螯合色譜柱的制備取Chelating SepHarose fast flow 16ml裝柱(1.6cm×20cm)，用0.05mol/L的CuCl2上柱，使柱子的上部1/2至2/3成為載Cu2+樹(shù)脂。用5倍體積的去離子水洗柱，使未吸附的Cu2+洗脫。最后用0.05mol/LTrisHAc、0.5mol/LNaCl起始緩沖液平衡色譜柱。
1.2.5免疫球蛋白的測(cè)定單向免疫法測(cè)定1.2.6洗脫液的分析自上樣起用自動(dòng)收集器收集洗脫液，每管5ml，在280nm下測(cè)定吸光度值(OD280)，并繪制洗脫曲線。相關(guān)組分用SDS-PAGE電泳分析其成分。
1.2.7SDS-PAGE電泳濃縮膠濃度4％，分離膠濃度10％。
2結(jié)果與討論2.1超濾法結(jié)果討論2.1.1初乳清的制備初乳由于含有較多的蛋白與脂肪，所以其黏度遠(yuǎn)大于常乳。離心分離后的脂肪殘留率高達(dá)5％。針對(duì)初乳不穩(wěn)定的特性，采取去脂初乳∶生理鹽水1∶3的比例稀釋并調(diào)pH至4.6，然后離心去除酪蛋白。這樣既最大限度的去除了酪蛋白，又減少了因免疫球蛋白與酪蛋白在離心時(shí)共沉淀而造成的損失，同時(shí)也進(jìn)一步降低了脂肪的殘余含量。
2.1.2乳清的超濾濃縮乳清的超濾濃縮結(jié)果見(jiàn)圖3。在10KD、30KD膜過(guò)濾狀態(tài)下工作時(shí)流速都較為穩(wěn)定。此種情況下，超濾效率較高，適于實(shí)際情況應(yīng)用。
2.1.3梯度洗脫法濃縮乳清中的IgG當(dāng)乳清超濾濃縮后，乳清中蛋白濃度越來(lái)越高，影響超濾速度。且如果繼續(xù)濃縮會(huì)加大膜的壓力，對(duì)膜產(chǎn)生破壞。為了進(jìn)一步提高IgG純度，用PBS緩沖液進(jìn)行梯度洗脫。結(jié)果見(jiàn)圖42.1.4凝膠層析結(jié)果用部分收集儀收集洗脫液，每管5ml，紫外檢測(cè)儀在280nm下測(cè)定吸光度值，記錄儀繪制。結(jié)果見(jiàn)圖5由圖5可見(jiàn)，初乳乳清經(jīng)洗脫后只有一個(gè)洗脫峰位于12-17管之間，經(jīng)紫外檢測(cè)證明是目的蛋白。經(jīng)SepHadex G-200層析以后得到較純的目的蛋白。
2.2金屬螯合色譜分離結(jié)果討論2.2.1洗脫結(jié)果在應(yīng)用pH8.0-2.8 0.05mol/LTrisHAc、0.5mol/LNaCl連續(xù)梯度洗脫時(shí)，共得到四種組分，即UB、P1、P2、P3.
2.2.2電泳結(jié)果由圖6可見(jiàn)，洗脫分離組分中P2、P3峰主要成分為免疫球蛋白IgG，純度為90％。免疫球蛋白對(duì)金屬螯合色譜的親合能力最大，因此可以采用增加上樣量使其突破飽和點(diǎn)再用強(qiáng)洗脫液洗下吸附的免疫球蛋白的方法得到純度較高的免疫球蛋白。此法得到的免疫球蛋白純度可達(dá)到97％，活力幾乎無(wú)損失。
從上述實(shí)施例得出提取IgG的超濾法工藝和金屬螯合色譜法工藝都能對(duì)駱駝初乳進(jìn)行純化，獲得高純度的IgG。
權(quán)利要求
1.駱駝初乳免疫球蛋白IgA的提取工藝，其特征為具有下列步驟(1)初乳預(yù)處理①取100ml初乳，10000r/min離心10min，收集中層清液。②取中層清液在0.2ml/l PB(pH 6.0)中透析，換液3次，以5000r/min，離心10min，收集上清液。③取上清液，加入0.06ml/l ZnSO4200ml，用1ml/l Na2CO3調(diào)節(jié)pH到6.8-6.9，以5000r/min離心15min，收集上清液。④取上清液加入飽和(NH4)2SO4300ml，室溫放置30min，以5000r/min離心30min，收集沉淀。⑤取沉淀，溶于60mlH2O中，在0.02ml/l PB(pH8.0)中透析至無(wú)NH4+。(2)IgA分離純化⑥將透析液上DEAE梯度洗脫柱，用0.02ml/l PB至0.3ml/l PB(pH 8.0)進(jìn)行梯度洗脫，收集洗脫峰位洗脫液。⑦將洗脫峰位洗脫液用PEG濃縮至3ml，收集濃縮液。⑧將濃縮液上分離純化器，用0.01ml/l PBS(pH 7.4)緩沖液進(jìn)行洗脫，收集洗脫峰位液，即獲得較純的球蛋白IgA。
2.駱駝初乳免疫球蛋白IgG的提取工藝，其特征為超濾法提取工藝具有以下列步驟①將初乳離心分離，得到去脂初乳；②去除酪蛋白，以去脂初乳∶生理鹽水＝1∶3的比例將去脂初乳稀釋，調(diào)pH4.6，離心去除酪蛋白，得到乳清。③超濾 在超濾儀上用10KD、30KD膜進(jìn)行過(guò)濾，得到濃縮了的乳清。④梯度洗脫濃縮 將超濾得到的濃縮乳清加入PBS緩沖液進(jìn)行梯度洗脫濃縮，取12-17管之間洗脫液峰位的目的蛋白洗脫液。⑤凝膠層析 將目的蛋白洗脫液進(jìn)行凝膠層析，用層析分析儀進(jìn)行分析，得到較純的球蛋白IgG。
3.駱駝初乳免疫球蛋白IgG的提取工藝，其特征為金屬螯合色譜法提取工藝具有下列步驟①將初乳離心分離，得到去脂初乳；②去除酪蛋白，以去脂初乳∶生理鹽水＝1∶3的比例將去脂初乳稀釋，調(diào)pH4.6，離心去除酪蛋白，得到乳清。③超濾 在超濾儀上用10KD、30KD膜進(jìn)行過(guò)濾，得到濃縮了的乳清。④梯度洗脫濃縮 將超濾得到的濃縮乳清在pH8.0-2.8，0.05ml/l Tris HAc和0.5ml/NaCl連續(xù)梯度洗脫，得到UB、P1、P2、P3四種峰位洗脫液，其中P2、P3峰位洗脫液的主要成分為免疫球蛋白G，純度為90％。⑤將P2、P3峰位洗脫液進(jìn)行金屬螯合色譜法提取，得到純度高達(dá)97％的IgG。
全文摘要
本發(fā)明為駱駝初乳免疫球蛋白IgA、IgG的提取工藝，涉及生化產(chǎn)品領(lǐng)域，駱駝初乳是免疫球蛋白最豐富的天然來(lái)源，是自然界免疫因子最富集的生物資源之一，目前初乳資源的開(kāi)發(fā)剛開(kāi)始，產(chǎn)品中活性物質(zhì)的有效濃度不夠高，在加工過(guò)程中損失較大，因此開(kāi)發(fā)高純度天然活性免疫球蛋白的提取工藝是當(dāng)務(wù)之急，本發(fā)明提供了用梯度洗脫法提取IgA和用超濾法、金屬螯合色譜法提取IgG的工藝，經(jīng)測(cè)試證明本發(fā)明分離純化效率高，在IgA中基本不存在其它雜質(zhì)，IgG純度可達(dá)97％以上，還具有條件溫和，操作簡(jiǎn)單，處理能力高，有利于駱駝奶的綜合開(kāi)發(fā)利用的有益效果。
文檔編號(hào)C07K16/04GK101045750SQ20071008649
公開(kāi)日2007年10月3日 申請(qǐng)日期2007年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月13日
發(fā)明者王曙陽(yáng), 梁劍平, 宋楠楠, 邵伍軍, 華蘭英 申請(qǐng)人:甘肅省華龍農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)總公司