本發(fā)明涉及一種脫除大米蛋白中苯丙氨酸的方法。

背景技術(shù)：

苯丙酮尿癥(phenylketonuria，PKU)或稱苯丙氨酸羥化酶缺乏癥(phenylalanine hydroxylase deficiency)是一種常染色體隱性遺傳疾病。它是由于體內(nèi)無法正常代謝苯丙氨酸而導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)的永久性損傷。只要在新生兒期獲得診斷和給予及時(shí)的低苯丙氨酸飲食，可避免患兒的智力損害。食療法是治療苯丙酮尿癥一種公認(rèn)的，長期堅(jiān)持具有顯著效果的方法，即控制患兒食物中苯丙氨酸攝入量以達(dá)到機(jī)體代謝平衡的一種方法。

目前低苯丙氨酸產(chǎn)品主要有酶解吸附法、配方法、基因法。但究其根本是將苯丙氨酸進(jìn)行高效脫除，苯丙氨酸的脫除現(xiàn)主要有酶解與吸附結(jié)合、酶解與超濾結(jié)合兩種，Cabrera-Padilla等采用酶解與超濾結(jié)合的方法，首先用糜蛋白酶和羧肽酶-A酶解乳清蛋白，酶解時(shí)間18h，酶解后水解物經(jīng)截流量為10KD的濾膜進(jìn)行超濾，苯丙氨酸含量降至0.19％；可以看出，采用酶解與超濾結(jié)合的方法可以將苯丙氨酸有效脫除，但低于10KD的物質(zhì)多為小分子肽、氨基酸等活性物質(zhì)，這造成了營養(yǎng)浪費(fèi)，在實(shí)際生產(chǎn)中不宜推廣。周志偉等采用酶解與吸附結(jié)合的方法，一種經(jīng)純化的粗制微生物蛋白酶作用于酪蛋白，蛋白水解物通過選擇性吸附，其苯丙氨酸含量由4.8％降至0.5％；由此可見，采用超濾脫除苯丙氨酸的方法高于吸附脫除，但在低苯丙氨酸蛋白的制備中，應(yīng)盡可能多的保留天然蛋白中的營養(yǎng)素。采用酶解與吸附結(jié)合的方法可較大程度的保留天然蛋白中的營養(yǎng)物質(zhì)，且工業(yè)生產(chǎn)中易于實(shí)現(xiàn)。

因此，利用酶解與吸附結(jié)合的方法脫除苯丙氨酸的研究至關(guān)重要，現(xiàn)存在的苯丙氨酸脫除方法耗時(shí)長，步驟繁瑣，產(chǎn)生的經(jīng)濟(jì)效益低。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種脫除大米蛋白中苯丙氨酸的方法，該方法簡單、條件溫和、快速有效的脫除大米蛋白中苯丙氨酸，制備針對苯丙酮尿癥患者的特膳飲食作基料。本發(fā)明所述的方法快速高效、操作簡單、條件溫和。應(yīng)用該方法對大米蛋白進(jìn)行處理，大米蛋白中苯丙氨酸可由4.72％降低至0.29％。

本發(fā)明技術(shù)方案如下：

一種脫除大米蛋白中苯丙氨酸的方法，包括以下步驟：

將大米蛋白充分溶解，制得大米蛋白溶解液，加入糜蛋白酶進(jìn)行酶解，得到酶解液I；再加入鏈霉蛋白酶，繼續(xù)進(jìn)行酶解，得到酶解液II；使(所述酶解液II中的)糜蛋白酶和鏈霉蛋白酶失活，離心取上清液(即得大米蛋白酶解液III)；用D101大孔吸附樹脂吸附，收集洗脫液(即吸附后的溶液)，即為脫除苯丙氨酸的大米蛋白溶液。

上述脫除大米蛋白中苯丙氨酸的方法，其中，

所述大米蛋白的蛋白質(zhì)含量≥75％，脂肪含量≤1％，苯丙氨酸含量≥4.72％。

所述大米蛋白溶解液的質(zhì)量濃度為1-2％，優(yōu)選質(zhì)量濃度為1％。

所述糜蛋白酶的加入量為4800-14400U/g蛋白，優(yōu)選為4800-9600U/g蛋白，進(jìn)一步優(yōu)選為7200U/g蛋白；所述酶解的條件為：酶解溫度：40-60℃，優(yōu)選為45-55℃，更優(yōu)選50-55℃；酶解時(shí)間：4-12h，優(yōu)選6-10h，進(jìn)一步優(yōu)選為6-8h。所述酶解優(yōu)選在恒溫水浴振蕩器中進(jìn)行。優(yōu)選地，所述糜蛋白酶的酶活≥1.20×10⁶U/g。

所述鏈霉蛋白酶的加入量50-146U/g蛋白，優(yōu)選為74-122U/g蛋白，進(jìn)一步優(yōu)選為98U/g蛋白；所述酶解的條件為：酶解溫度：30-50℃，優(yōu)選為35-45℃，更優(yōu)選35-40℃；酶解時(shí)間：1-5h，優(yōu)選2-4h，進(jìn)一步優(yōu)選為3h。所述酶解優(yōu)選在恒溫水浴振蕩器中進(jìn)行。優(yōu)選地，所述鏈霉蛋白酶的酶活≥7.00×10³U/g。

所述使糜蛋白酶和鏈霉蛋白酶滅活的方法包括：將所述酶解液II升溫至90-95℃，保持10-20min。

所述離心的條件為：轉(zhuǎn)速4000-4500rpm，時(shí)間20-30min。

所述吸附速度為10-50r/min，優(yōu)選為20-40r/min，進(jìn)一步優(yōu)選為20-30r/min。

具體地，所述脫除大米蛋白中苯丙氨酸的方法，包括以下步驟：

將蛋白質(zhì)含量≥75％、脂肪含量≤1％、苯丙氨酸含量≥4.72％的大米蛋白充分溶解，制得質(zhì)量濃度為1-2％的大米蛋白溶解液，按照4800-9600U/g蛋白的用量加入糜蛋白酶進(jìn)行酶解6-8h，酶解溫度50-55℃，得到酶解液I；再按照74-122U/g蛋白的用量加入鏈霉蛋白酶，繼續(xù)進(jìn)行酶解，酶解溫度35-45℃，得到酶解液II；使(所述酶解液II中的)糜蛋白酶和鏈霉蛋白酶失活，離心取上清液(即得大米蛋白酶解液III)；用D101大孔吸附樹脂吸附，吸附速度為20-40r/min，收集洗脫液(即吸附后的溶液)，即為脫除苯丙氨酸的大米蛋白溶液。

上述脫除大米蛋白中苯丙氨酸的方法，進(jìn)一步地還包括將所述洗脫液(即吸附后的溶液，脫除苯丙氨酸的大米蛋白溶液)進(jìn)行干燥的步驟；優(yōu)選為冷凍干燥。

如無特殊指明，本發(fā)明所述的糜蛋白酶是指?；蜇i胰中提取的一種蛋白分解酶，用于肽鏈的酶解，專門水解肽鍵，屬于肽鏈內(nèi)切酶，水解產(chǎn)率很高。所述糜蛋白酶可按現(xiàn)有技術(shù)方法制備，也可外購商品化產(chǎn)品，例如購自北京索萊寶科技有限公司，商品目錄號：C8660，酶活為1.20×10⁶U/g。

如無特殊指明，本發(fā)明所述鏈霉蛋白酶是自灰色鏈霉菌中分離的非特異性蛋白水解酶；所鏈霉蛋白酶可按現(xiàn)有技術(shù)方法制備，也可外購商品化產(chǎn)品，例如購自北京索萊寶科技有限公司，商品目錄號：P8360，酶活為7.00×10³U/g。

本發(fā)明對糜蛋白酶酶活的定義為：酪蛋白底物在特定條件下經(jīng)酶水解，每分鐘產(chǎn)生lμg酪氨酸為一個(gè)活力單位，以U表示。

本發(fā)明對鏈霉蛋白酶酶活定義為：酪蛋白底物在特定條件下經(jīng)酶水解，每分鐘產(chǎn)生lμg酪氨酸為一個(gè)活力單位，以U表示。

本發(fā)明還包括按上述方法制備的脫除苯丙氨酸的大米蛋白；優(yōu)選地，所述大米蛋白中苯丙氨酸含量≤0.29％。本發(fā)明所述方法可特異性吸附苯丙氨酸，對其他氨基酸含量損失較小，也可有效保留天然蛋白中的其他營養(yǎng)成分。

如無特殊指明，本發(fā)明所述大米蛋白中苯丙氨酸均為總苯丙氨酸。

本發(fā)明通過大量客觀實(shí)驗(yàn)對酶解條件和吸附條件進(jìn)行多因素優(yōu)化，最終確定了能夠脫除大米蛋白中苯丙氨酸的方法。本發(fā)明所述的方法快速高效、操作簡單、條件溫和。應(yīng)用該方法對大米蛋白進(jìn)行處理，大米蛋白中苯丙氨酸可由4.72％降低至0.29％。

附圖說明

圖1表示實(shí)驗(yàn)例1糜蛋白酶不同酶解時(shí)間對苯丙氨酸游離效果的影響；

圖2表示實(shí)驗(yàn)例2糜蛋白酶加入量對苯丙氨酸游離效果的影響；

圖3表示實(shí)驗(yàn)例3糜蛋白酶酶解溫度對苯丙氨酸游離效果的影響；

圖4表示表示實(shí)驗(yàn)例4鏈霉蛋白酶酶解時(shí)間對苯丙氨酸游離效果的影響；

圖5表示實(shí)驗(yàn)例5鏈霉蛋白酶加入量對苯丙氨酸游離效果的影響；

圖6表示實(shí)驗(yàn)例6鏈霉蛋白酶酶解溫度對苯丙氨酸游離效果的影響；

圖7表示實(shí)驗(yàn)例7吸附條件對苯丙氨酸脫除效果的影響。

圖1-6中，縱坐標(biāo)均指游離苯丙氨酸濃質(zhì)量度；

圖7中縱坐標(biāo)Phe content指總苯丙氨酸濃質(zhì)量度，Time指吸附時(shí)間；橫坐標(biāo)Speed指流速。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件，或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可通過正規(guī)渠道商購買得到的常規(guī)產(chǎn)品。

下述實(shí)施例中所采用的糜蛋白酶購自北京索萊寶科技有限公司，商品目錄號：C8660，酶活為1.20×10⁶U/g；所采用的鏈霉蛋白酶購自北京索萊寶科技有限公司，商品目錄號：P8360，酶活為7.00×10³U/g。下述實(shí)施例、對比例及實(shí)驗(yàn)例中所采用的大米蛋白，其蛋白質(zhì)含量≥75％，脂肪含量≤1％，苯丙氨酸含量4.72％。下述實(shí)施例中游離苯丙氨酸測定：熒光法；總苯丙氨酸測定采用氨基酸分析儀。

實(shí)施例1

脫除大米蛋白中苯丙氨酸的方法，包括以下步驟：

第一步：將大米蛋白前處理充分溶解；

第二步：第一步反應(yīng)后大米蛋白充分溶解，加入糜蛋白酶(加入量7200U/g蛋白)，在55℃的恒溫水浴振蕩器中進(jìn)行酶解6h；

第三步：第二步反應(yīng)結(jié)束后，加入鏈霉蛋白酶(加入量98U/g蛋白)混合均勻，在45℃的恒溫水浴振蕩器中進(jìn)行酶解3h；

第四步：第三步反應(yīng)結(jié)束后取出，放入90℃恒溫水浴中保持l0min，使蛋白酶失活，4200r/min離心20min取上清液即得大米蛋白酶解液；

第五步：第四步反應(yīng)結(jié)束后，采用D101大孔吸附樹脂吸附大米蛋白酶解液中的苯丙氨酸，吸附流速為40r/min，收集洗脫液(即吸附后的溶液)；

第六步：第五步反應(yīng)結(jié)束后，溶液即為脫除苯丙氨酸的大米蛋白溶液，該溶液經(jīng)冷凍干燥保存。

采用上述方法脫除大米蛋白中苯丙氨酸，最終苯丙氨酸的含量為0.29％。

對比例1

脫除大米蛋白中苯丙氨酸的方法，與實(shí)施例1的區(qū)別僅在于不包括加入鏈霉蛋白酶進(jìn)行二次酶解的步驟。

采用上述方法脫除大米蛋白中的苯丙氨酸，最終苯丙氨酸的含量為0.86％。

對比例2

脫除大米蛋白中苯丙氨酸的方法，與實(shí)施例1的區(qū)別僅在于采用活性炭代替D101大孔吸附樹脂進(jìn)行苯丙氨酸的吸附。

采用上述方法脫除大米蛋白中的苯丙氨酸，最終苯丙氨酸的含量為0.08％。

以下實(shí)驗(yàn)例1-6考察指標(biāo)為游離苯丙氨酸含量，實(shí)驗(yàn)例7考察指標(biāo)為總苯丙氨酸含量。

實(shí)驗(yàn)例1糜蛋白酶不同酶解時(shí)間對苯丙氨酸游離效果的影響

第一步：將大米蛋白前處理充分溶解；

第二步：第一步反應(yīng)后大米蛋白充分溶解，加入糜蛋白酶(加入量7200U/g蛋白)，在55℃的恒溫水浴振蕩器中進(jìn)行酶解(4h/6h/8h/10h/12h)；

第三步：第二步反應(yīng)結(jié)束后取出，放入90℃恒溫水浴中保持l0min，使蛋白酶失活，4200r/min離心20min取上清液即得大米蛋白酶解液；

第四步：第三步反應(yīng)結(jié)束后，溶液即為苯丙氨酸充分游離的大米蛋白溶液，該溶液經(jīng)冷凍干燥保存。

糜蛋白酶不同酶解時(shí)間對苯丙氨酸游離效果影響的結(jié)果，見圖1。由圖1可以看出：在4-6h內(nèi)，游離苯丙氨酸量顯著增高，6-12h內(nèi)，游離苯丙氨酸量基本保持不變，這可能是由于在6h左右，酶制劑與底物已充分接觸，反應(yīng)完全，苯丙氨酸在該反應(yīng)條件下已充分游離，因此選擇6h作為糜蛋白酶的最佳酶解時(shí)間。

實(shí)驗(yàn)例2糜蛋白酶加入量對苯丙氨酸游離效果的影響

第一步：將大米蛋白前處理充分溶解；

第二步：第一步反應(yīng)后大米蛋白充分溶解，加入糜蛋白酶(加入量4800-14400U/g蛋白)，在55℃的恒溫水浴振蕩器中進(jìn)行酶解6h；

第三步：第二步反應(yīng)結(jié)束后取出，放入90℃恒溫水浴中保持l0min，使蛋白酶失活，4200r/min離心20min取上清液即得大米蛋白酶解液；

第四步：第三步反應(yīng)結(jié)束后，溶液即為苯丙氨酸充分游離的大米蛋白溶液，該溶液經(jīng)冷凍干燥保存。

糜蛋白酶加入量對苯丙氨酸游離效果影響的結(jié)果，見圖2。如圖2所示：糜蛋白酶加入量4800U/g蛋白、7200U/g蛋白、9600U/g蛋白、12000U/g蛋白、14400U/g蛋白，在加酶量4800-7200U/g蛋白之間，苯丙氨酸游離量顯著升高，這可能是由于加酶量在底物蛋白充分接觸，7200-14400U/g蛋白之間，苯丙氨酸的游離量逐漸降低，這可能是因?yàn)榧用噶窟^大，酶進(jìn)行自我分解，導(dǎo)致苯丙氨酸游離效果下降。

實(shí)驗(yàn)例3糜蛋白酶酶解溫度對苯丙氨酸游離效果的影響

第一步：將大米蛋白前處理充分溶解；

第二步：第一步反應(yīng)后大米蛋白充分溶解，加入糜蛋白酶7200U/g蛋白，在恒溫水浴振蕩器中進(jìn)行酶解6h，酶解溫度控制在45/50/55/60/65℃；

第三步：第二步反應(yīng)結(jié)束后取出，放入90℃恒溫水浴中保持l0min，使蛋白酶失活，4200r/min離心20min取上清液即得大米蛋白酶解液；

第四步：第三步反應(yīng)結(jié)束后，溶液即為苯丙氨酸充分游離的大米蛋白溶液，該溶液經(jīng)冷凍干燥保存。

糜蛋白酶不同酶解溫度對苯丙氨酸游離效果影響的結(jié)果，見圖3。如圖3所示：糜蛋白酶推薦最適溫度是55℃在45-50℃之間，游離苯丙氨酸量顯著升高，在50℃之后，游離苯丙氨酸量先趨于平緩后呈下降趨勢，這可能是由于糜蛋白酶活性在55℃左右達(dá)到最高，但由于考慮到資源成本的節(jié)約，選定55℃作為最適酶解溫度。

實(shí)驗(yàn)例4鏈霉蛋白酶酶解時(shí)間對苯丙氨酸游離效果的影響

第一步：將大米蛋白前處理充分溶解；

第二步：第一步反應(yīng)后大米蛋白充分溶解，加入糜蛋白酶(加入量7200U/g蛋白)，在55℃的恒溫水浴振蕩器中進(jìn)行酶解6h；

第三步：第二步反應(yīng)結(jié)束后，加入鏈霉蛋白酶(加入量100U/g蛋白)混合均勻，在55℃的恒溫水浴振蕩器中進(jìn)行酶解1/2/3/4/5h；

第四步：第三步反應(yīng)結(jié)束后取出，放入90℃恒溫水浴中保持l0min，使蛋白酶失活，4200r/min離心20min取上清液即得大米蛋白酶解液；

第五步：第四步反應(yīng)結(jié)束后，溶液即為苯丙氨酸充分游離的大米蛋白溶液，該溶液經(jīng)冷凍干燥保存。

鏈霉蛋白酶不同酶解時(shí)間對苯丙氨酸游離效果影響的結(jié)果，見圖4。由圖4可以看出：在鏈霉蛋白酶酶解1-3h內(nèi)，游離苯丙氨酸量逐漸升高，3h后游離苯丙氨酸量基本保持不變，這可能是由于在3h左右，鏈霉蛋白酶與底物充分接觸，苯丙氨酸在該反應(yīng)條件下已充分游離，在糜蛋白酶酶解后，鏈霉蛋白酶對大米蛋白水解液進(jìn)行特異性剪切。因此，選擇3h作為鏈霉蛋白酶的最佳酶解時(shí)間。

實(shí)驗(yàn)例5鏈霉蛋白酶加入量對苯丙氨酸游離效果的影響

第一步：將大米蛋白前處理充分溶解；

第二步：第一步反應(yīng)后大米蛋白充分溶解，加入糜蛋白酶(加入量7200U/g蛋白)，在55℃的恒溫水浴振蕩器中進(jìn)行酶解6h；

第三步：第二步反應(yīng)結(jié)束后，加入鏈霉蛋白酶(加入量50/74/98/122/146U/g蛋白)混合均勻，在55℃的恒溫水浴振蕩器中進(jìn)行酶解3h；

第四步：第三步反應(yīng)結(jié)束后取出，放入90℃恒溫水浴中保持l0min，使蛋白酶失活，4200r/min離心20min取上清液即得大米蛋白酶解液；

第五步：第四步反應(yīng)結(jié)束后，溶液即為苯丙氨酸充分游離的大米蛋白溶液，該溶液經(jīng)冷凍干燥保存。

鏈霉蛋白酶加入量對苯丙氨酸游離效果影響的結(jié)果，見圖5。由圖5可以看出：在鏈霉蛋白酶加入量在50-98U/g蛋白范圍內(nèi)，游離苯丙氨酸量顯著升高，但98U/g蛋白后，游離苯丙氨酸量劇烈下降。這可能是由于鏈霉蛋白酶可作用的酶切位點(diǎn)已充分反應(yīng)，苯丙氨酸已從大米蛋白中充分解離出來，加酶量過多會使在反應(yīng)中自我分解，導(dǎo)致苯丙氨酸不能充分游離。因此，選擇98U/g蛋白作為鏈霉蛋白酶的最佳加入量。

實(shí)驗(yàn)例6鏈霉蛋白酶酶解溫度對苯丙氨酸游離效果的影響

第一步：將大米蛋白前處理充分溶解；

第二步：第一步反應(yīng)后大米蛋白充分溶解，加入糜蛋白酶(加入量7200U/g蛋白)，在55℃的恒溫水浴振蕩器中進(jìn)行酶解6h；

第三步：第二步反應(yīng)結(jié)束后，加入鏈霉蛋白酶98U/g蛋白混合均勻，在恒溫水浴振蕩器中進(jìn)行酶解3h，酶解溫度控制在30/35/40/45/50℃；

第四步：第三步反應(yīng)結(jié)束后取出，放入90℃恒溫水浴中保持l0min，使蛋白酶失活，4200r/min離心20min取上清液即得大米蛋白酶解液；

第五步：第四步反應(yīng)結(jié)束后，溶液即為苯丙氨酸充分游離的大米蛋白溶液，該溶液經(jīng)冷凍干燥保存。

鏈霉蛋白酶酶解溫度對苯丙氨酸游離效果影響的結(jié)果，見圖6。由圖6可以看出：在30-50℃范圍內(nèi)，游離苯丙氨酸量先升高后趨于平緩，在40℃后游離苯丙氨酸量顯著下降，這是因?yàn)闇囟冗^高，酶活逐漸下降，反應(yīng)效率低，考慮到經(jīng)濟(jì)效益。因此，選擇35℃作為鏈霉蛋白酶最佳酶解溫度。

實(shí)驗(yàn)例7吸附條件對苯丙氨酸脫除效果的影響

第一步：將大米蛋白前處理充分溶解；

第二步：第一步反應(yīng)后大米蛋白充分溶解，加入糜蛋白酶(加入量7200U/g蛋白)，在55℃的恒溫水浴振蕩器中進(jìn)行酶解6h；

第三步：第二步反應(yīng)結(jié)束后，加入鏈霉蛋白酶(加入量98U/g蛋白)混合均勻，在55℃的恒溫水浴振蕩器中進(jìn)行酶解3h；

第四步：第三步反應(yīng)結(jié)束后取出，放入90℃恒溫水浴中保持l0min，使蛋白酶失活，4200r/min離心20min取上清液即得大米蛋白酶解液；

第五步：第四步反應(yīng)結(jié)束后，采用大孔吸附樹脂吸附大米蛋白酶解液中的苯丙氨酸，吸附時(shí)間為1/2/3/4/5h，收集吸附后的溶液。

第六步：第五步反應(yīng)結(jié)束后，溶液即為脫除苯丙氨酸的大米蛋白溶液，該溶液經(jīng)冷凍干燥保存。

吸附條件對總苯丙氨酸脫除效果影響的結(jié)果，見圖7。由圖7可以看出：在10-50r/min，隨著流速的增加，苯丙氨酸量增加，這意味著吸附效果逐漸降低，但流速過慢，會使吸附時(shí)間過長，因此，需要尋找一個(gè)平衡點(diǎn)既能有效降低苯丙氨酸量，又可節(jié)約時(shí)間成本。因此，選擇流速30r/min。

實(shí)驗(yàn)例8

分別比較實(shí)施例1(D101大孔吸附樹脂吸附)和對比例2(活性炭吸附)方法所制得的脫除苯丙氨酸后的大米蛋白中的氨基酸含量，結(jié)果見下表1。結(jié)果表明，采用活性炭吸附將其他氨基酸也一并吸附且吸附量較大，對整體氨基酸量帶來不利影響。因此，對比例2方法不是最佳選擇。

表1不同吸附劑對氨基酸含量的影響

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。