對(duì)序列表的引用本申請(qǐng)包含計(jì)算機(jī)可讀形式的序列表，將其通過引用結(jié)合在此。發(fā)明背景發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及包含具有蛋白酶活性的多肽的動(dòng)物飼料或動(dòng)物飼料添加劑及其用途。它還涉及用于生產(chǎn)這些蛋白酶以及使用蛋白酶來改進(jìn)動(dòng)物性能和動(dòng)物飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的方法。發(fā)明背景在動(dòng)物飼料中使用蛋白酶(體內(nèi))，和/或這類的蛋白酶用于處理植物性蛋白(體外)的用途中，注意的是蛋白對(duì)于動(dòng)物和人類是必需營(yíng)養(yǎng)因子。大部分家畜和許多人從植物性蛋白來源獲得這些必需蛋白。重要的植物性蛋白來源是例如油籽作物、豆類和谷類。當(dāng)例如大豆粉包含在單胃動(dòng)物如豬和家禽的飼料中時(shí)，相當(dāng)比例的大豆粉未被有效地消化(在小豬、生長(zhǎng)豬和家禽如肉仔雞、蛋雞和公雞中的表觀回腸蛋白消化率僅是80％左右)。動(dòng)物的胃腸道是由一系列各自呈現(xiàn)不同ph環(huán)境的段組成。在單胃動(dòng)物如豬和家禽以及許多類型的魚中，胃是具有潛在地低至1-2的ph的強(qiáng)酸性的，而腸具有一個(gè)6-7.5左右的更中性的ph。除胃和腸之外，家禽在胃之前還具有一個(gè)嗉囊。嗉囊中的ph主要由消化的飼料決定并且因此典型地位于ph4-6的范圍內(nèi)。通過一種蛋白酶消化蛋白可發(fā)生在整個(gè)消化道中，其條件是該蛋白酶是有活性的并存活于該消化道的條件下。因此，以下這樣的蛋白酶是特別令人希望的：它們是高度地酸穩(wěn)定的并且所以可以在胃環(huán)境中存活，并且同時(shí)在靶動(dòng)物的消化道的寬范圍的生理ph下是有效地有活性的。由于動(dòng)物飼料通常以粒狀形式配制，其中在造粒過程中應(yīng)用蒸汽，因此在暴露于所述蒸汽處理之后用于動(dòng)物飼料中的蛋白酶仍能夠保持是有活性的也是令人希望的。為了生產(chǎn)用于工業(yè)使用的蛋白酶，重要的是生產(chǎn)高產(chǎn)量的蛋白酶，使得可獲得足夠量的該產(chǎn)品以能夠以有利的價(jià)格提供該蛋白酶。相關(guān)技術(shù)說明來自s1家族的蛋白酶在本領(lǐng)域是已知的并且用于在動(dòng)物飼料中使用。例如，wo01/58275披露了枯草桿菌蛋白酶家族的酸穩(wěn)定性蛋白酶在動(dòng)物飼料中的用途。wo01/58276披露了衍生自擬諾卡氏菌屬nrrl18262的酸穩(wěn)定性蛋白酶(10r蛋白酶)以及衍生自白擬諾卡氏菌dsm14010的蛋白酶在動(dòng)物飼料中的用途。wo04/072221、wo04/111220、wo04/111223、wo05/035747以及wo05/123911披露了與10r蛋白酶相關(guān)的蛋白酶及其在動(dòng)物飼料中的用途。wo04/072279披露了其他蛋白酶在動(dòng)物飼料中的用途。wo04/034776披露了枯草桿菌蛋白酶/角蛋白酶，來自地衣芽孢桿菌的pwd-1，在家禽飼料中的用途。大豆和玉米是在農(nóng)業(yè)中兩種高度使用的蛋白質(zhì)來源，并且因此重要的是，蛋白酶對(duì)這類底物具有良好的活性。有許多披露示出來自以下不同細(xì)菌來源的蛋白酶對(duì)大豆-玉米粉的活性，如韓國(guó)生工菌屬(kribbella)物種(wo2013/026796)、糖多孢紅霉菌(wo2013/110766和wo2014/122161)、綠色糖單孢菌(wo2013/189972)、澳大利亞糖絲菌(wo2013/041689)和指孢囊菌屬物種(wo2014/096259)。此外，從其他細(xì)菌物種(例如兩面神菌屬(janibactersp.))分離的蛋白酶是本領(lǐng)域已知的。思拉什(thrash)等人進(jìn)行了如在“海上的兩面神菌屬菌株htcc2649的基因組序列(genomesequenceofthemarinejanibactersp.strainhtcc2649)”，2011，細(xì)菌學(xué)雜志(j.bacteriol.)193:584-585中所描述的細(xì)菌兩面神菌屬htcc2649的全基因組鳥槍法，該菌株已經(jīng)在登錄號(hào)aamn01000001下被提交至embl/genbank。由此基因組測(cè)序，將具有uniprot編號(hào)a3tj83(本文的seqidno:2)的多肽注釋為絲氨酸蛋白酶。吉田(yoshida)等人進(jìn)行了細(xì)菌austwickiachelonaenbrc105200的全基因組鳥槍法，該細(xì)菌被提交至embl/genbank/ddbj數(shù)據(jù)庫(kù)，來自這些數(shù)據(jù)庫(kù)的肽酶(uniprot:k6vm97，seqidno:9)被注釋與seqidno:5(對(duì)應(yīng)于本文的seqidno:2和4的成熟多肽)具有62.1％序列一致性。包含一種蛋白酶的并且銷售以用于在動(dòng)物飼料中使用的商業(yè)產(chǎn)品包括proact(dsmnp/諾維信公司)、(杜邦公司(dupont))、(杜邦公司)、(杜邦公司)、allzymetm(奧特奇公司(alltech))、(生物資源有限公司(bioresources,int.)、poultrygrowtm(杰夫公司(jefo))和(諾偉思公司(novus))。然而，仍然需要找到在動(dòng)物飼料領(lǐng)域內(nèi)表現(xiàn)出改進(jìn)的性質(zhì)的蛋白酶。發(fā)明概述本發(fā)明涉及包含一種或多種具有蛋白酶活性的多肽的動(dòng)物飼料或動(dòng)物飼料添加劑，其中該多肽選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：(a)一種多肽，該多肽與seqidno:5具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性；(b)一種多肽，該多肽與seqidno:14具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性；(c)一種多肽，該多肽與seqidno:20具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性；(d)一種多肽，該多肽由以下多核苷酸編碼，該多核苷酸在低嚴(yán)格條件、中嚴(yán)格條件、中-高嚴(yán)格條件、高嚴(yán)格條件、或非常高嚴(yán)格條件下與以下各項(xiàng)雜交：(i)seqidno:1的成熟多肽編碼序列；(ii)seqidno:10的成熟多肽編碼序列；(iii)seqidno:16的成熟多肽編碼序列；或者(iv)(i)、(ii)或(iii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)體；(e)一種多肽，該多肽由以下多核苷酸編碼，該多核苷酸與seqidno:1的成熟多肽編碼序列具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性；(f)一種多肽，該多肽由以下多核苷酸編碼，該多核苷酸與seqidno:10的成熟多肽編碼序列具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性；(g)一種多肽，該多肽由以下多核苷酸編碼，該多核苷酸與seqidno:16的成熟多肽編碼序列具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性；(h)seqidno:5、seqidno:14或seqidno:20的變體，其中該變體具有蛋白酶活性并且在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50位置中包括一個(gè)或多個(gè)取代、和/或一個(gè)或多個(gè)缺失、和/或一個(gè)或多個(gè)插入或其任何組合；以及(i)具有蛋白酶活性的(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)或(h)的多肽的片段，其中該片段包括至少170個(gè)氨基酸，例如至少175個(gè)氨基酸，至少177個(gè)氨基酸，至少180個(gè)氨基酸，至少185個(gè)氨基酸，至少190個(gè)氨基酸，至少195個(gè)氨基酸或至少200個(gè)氨基酸。本發(fā)明進(jìn)一步涉及本發(fā)明的蛋白酶在動(dòng)物飼料中的用途，用于制備動(dòng)物飼料的方法；改進(jìn)動(dòng)物飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的方法；用于處理蛋白的方法；用于提高蛋白質(zhì)的消化率和/或溶解度的方法；用于改進(jìn)動(dòng)物中的一個(gè)或多個(gè)性能參數(shù)的方法以及生產(chǎn)本發(fā)明的多肽的方法。序列表綜述seqidno:1是來自兩面神菌屬htcc2649的s1蛋白酶1的dna序列。seqidno:2是如從seqidno:1推導(dǎo)的氨基酸序列。seqidno:3是來自seqidno:1的重組體表達(dá)dna序列的dna序列。seqidno:4是如從seqidno:3推導(dǎo)的氨基酸序列。seqidno:5是來自兩面神菌屬htcc2649的成熟s1蛋白酶1的氨基酸序列。seqidno:6是克勞氏芽孢桿菌(bacillusclausii)分泌信號(hào)。seqidno:7是蛋白酶10r(wo05/035747，seqidno:1)的dna序列。seqidno:8是蛋白酶10r(wo05/035747，seqidno:2)的氨基酸序列。seqidno:9是來自austwickiachelonaenbrc105200(uniprot:k6vm97)的肽酶的氨基酸序列。seqidno:10是來自土壤球菌屬(terracoccussp.)的s1蛋白酶1的dna序列。seqidno:11是如從seqidno:10推導(dǎo)的氨基酸序列。seqidno:12是來自seqidno:10的重組體表達(dá)dna序列的dna序列。seqidno:13是如從seqidno:12推導(dǎo)的氨基酸序列。seqidno:14是來自土壤球菌屬(terracoccussp.)的成熟s1蛋白酶1的氨基酸序列。seqidno:15是保守基序vcg[e/q]kvgqp。seqidno:16是來自黃色諾爾氏菌(knoelliaflava)的s1蛋白酶1的dna序列。seqidno:17是如從seqidno:16(uniprot:a0a0a0jf07)推導(dǎo)的氨基酸序列。seqidno:18是seqidno:16的密碼子優(yōu)化的合成基因的dna序列。seqidno:19是如從seqidno:18推導(dǎo)的氨基酸序列。seqidno:20是來自黃色諾爾氏菌的成熟s1蛋白酶1的氨基酸序列。附圖簡(jiǎn)述圖1示出了在25℃下，與蛋白酶10r相比，來自兩面神菌屬htcc2649的s1蛋白酶1對(duì)suc-aapf-pna底物的ph-活性曲線。圖2示出了與蛋白酶10r相比，來自兩面神菌屬htcc2649的s1蛋白酶1的ph-穩(wěn)定性曲線(在37℃下2小時(shí)后的殘余活性)。圖3示出了與蛋白酶10r在ph6.5下相比，來自兩面神菌屬htcc2649的s1蛋白酶1在ph7.0下對(duì)普羅塔酶ak(protazymeak)的溫度活性曲線。圖4示出了與10r蛋白酶相比，來自兩面神菌屬htcc2649的s1蛋白酶1對(duì)大豆-玉米粉的活性(od340x稀釋因子)。誤差條顯示2倍標(biāo)準(zhǔn)差。圖5示出了與10r蛋白酶相比，來自兩面神菌屬htcc2649的s1蛋白酶1、兩面神菌變體s68n和t71n、以及來自土壤球菌屬(terracoccussp.)的s1蛋白酶1對(duì)大豆-玉米粉的活性(od340x稀釋因子)。定義多肽對(duì)大豆-玉米粉的活性：術(shù)語(yǔ)“多肽對(duì)大豆-玉米粉的活性”是指使用如本文所述的鄰苯二甲醛(opa)測(cè)定，確定酶對(duì)以30:70的比率混合的大豆粉-玉米粉的蛋白酶活性。ph值測(cè)定的實(shí)例是ph3.0、4.0、5.0、6.0和7.0。溫度測(cè)定的實(shí)例是30℃、35℃、40℃、45℃和50℃。時(shí)間測(cè)定的實(shí)例是2、3和4小時(shí)。酶濃度的實(shí)例是50、100、150、200、250和300mg酶蛋白/kg干物質(zhì)的底物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，通過以下來確定多肽對(duì)大豆-玉米粉的活性：將以30:70的比率混合的大豆粉-玉米粉(1g)添加到包含100mm琥珀酸、100mmhepes、100mmches、100mmcaps、1mmcacl2、150mmkcl、0.01％tritonx-100(10ml)的緩沖液中，這些緩沖液已被制備并且使用hcl或naoh調(diào)節(jié)至這樣的ph值，使得大豆-玉米粉底物已經(jīng)與測(cè)定緩沖液混合后，漿液的最終ph為ph3.0、4.0、5.0、6.0或7.0；然后將一個(gè)等分試樣的底物漿液(2ml)混合30min；添加溶解于100μl100mm乙酸鈉緩沖液(9.565g/lnaoac、1.75g/l乙酸、5mmcacl2、0.01％bsa、0.01％吐溫20，ph6.0)中的蛋白酶(200mg酶蛋白/kg干物質(zhì))；在40℃(500rpm)下孵育樣品3小時(shí)；離心樣品(10min，4000rpm，0℃)；并使用鄰苯二甲醛(opa)測(cè)定(本文稱為“大豆-玉米粉測(cè)定法”)收集上清液進(jìn)行分析。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，如本文實(shí)例4所描述的，確定多肽對(duì)大豆-玉米粉的活性。在一個(gè)實(shí)施例中，如seqidno:5的多肽，在ph4下，本發(fā)明的多肽對(duì)大豆-玉米粉具有至少30％，例如至少40％、至少65％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少100％的活性。在一個(gè)實(shí)施例中，如seqidno:5的多肽，在ph5下，本發(fā)明的多肽對(duì)大豆-玉米粉具有至少40％，例如至少65％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少100％的活性。等位基因變體：術(shù)語(yǔ)“等位基因變體”意指占用同一染色體基因座的一種基因的兩個(gè)或更多個(gè)替代形式中的任一者。等位基因變異由突變天然產(chǎn)生，并且可以導(dǎo)致群體內(nèi)多態(tài)性。基因突變可以是沉默的(在所編碼的多肽中沒有改變)或可編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因變體是由基因的等位基因變體編碼的多肽。動(dòng)物：術(shù)語(yǔ)“動(dòng)物飼料”是指除人類以外的所有動(dòng)物。動(dòng)物的實(shí)例為非反芻動(dòng)物和反芻動(dòng)物。反芻動(dòng)物包括例如，動(dòng)物，如綿羊、山羊、牛(例如，肉牛、奶牛和牛犢)、鹿、yank、駱駝、美洲駝和袋鼠。非反芻動(dòng)物包括單胃動(dòng)物，例如，豬(包括但不限于小豬、成長(zhǎng)豬、和母豬)；家禽，如火雞、鴨和雞(包括但不限于肉仔雞和蛋雞)；馬(包括但不限于熱血馬、冷血馬和溫血馬)、小牛；魚(包括但不限于琥珀魚、巨滑舌魚、魮魚、鱸魚、藍(lán)魚、bocachico、鯉科魚、鯰魚、cachama、鯉魚、鯰魚、卡特拉魚、遮目魚、嘉魚、麗魚科魚、軍曹魚、鱈魚、小翻車魚、金頭鯛、石首魚、鰻魚、蝦虎魚、金魚、絲足魚、石斑魚、guapote、大比目魚、爪哇魚(java)、野鯪屬魚、萊魚(lai)、泥鰍、鯖魚、牛奶魚、銀鱸、泥魚、鯔魚、帕高魚(paco)、pearlspot、pejerrey、河鱸魚、狗魚、鯧參魚、斜齒鳊、鮭魚、蝦米魚(sampa)、加拿大鰤鱸、黑鱸、海鯉、發(fā)光魚(shiner)、睡鯊(sleeper)、黑魚、鯛魚、鋸蓋魚、比目魚、刺足魚、鱘魚、翻車魚、香魚(sweetfish)、丁鯛、特羅爾魚(terror)、羅非魚、鱒魚、鮪魚、多寶魚、白鱒魚、白斑魚和白魚)；和甲殼動(dòng)物(包括但不限于蝦和對(duì)蝦)。動(dòng)物飼料：術(shù)語(yǔ)“動(dòng)物飼料”是指適合于、或打算用于由動(dòng)物攝入的任何化合物、制劑、或混合物。單胃動(dòng)物的動(dòng)物飼料通常包括濃縮物連同維生素、礦物質(zhì)、酶、直接飼養(yǎng)的微生物、氨基酸和/或其他飼料成分(例如在預(yù)混物中)，而反芻動(dòng)物的動(dòng)物飼料通常包括草料(包括粗糧和青貯)，并且可以進(jìn)一步包括濃縮物連同維生素、礦物質(zhì)、酶、直接飼養(yǎng)的微生物、氨基酸和/或其他飼料成分(例如在預(yù)混物中)。體重增加：術(shù)語(yǔ)“體重增加”是指在給定時(shí)間段期間動(dòng)物的活重增加，例如，從第1天到第21天的體重增加。cdna：術(shù)語(yǔ)“cdna”是指可以通過從得自真核或原核細(xì)胞的成熟的、剪接的mrna分子進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄而制備的dna分子。cdna缺少可以存在于相應(yīng)基因組dna中的內(nèi)含子序列。早先的初始rna轉(zhuǎn)錄本是mrna的前體，其在呈現(xiàn)為成熟的剪接的mrna之前要經(jīng)一系列的步驟進(jìn)行加工，包括剪接。編碼序列：術(shù)語(yǔ)“編碼序列”意指直接指定一個(gè)多肽的氨基酸序列的多核苷酸。編碼序列的邊界一般由開放閱讀框架決定，該開放閱讀框架從起始密碼子(如atg、gtg或ttg)開始并且以終止密碼子(如taa、tag或tga)結(jié)束。編碼序列可以是基因組dna、cdna、合成dna或其組合。組合物：術(shù)語(yǔ)“組合物”是指包括載體和本發(fā)明的至少一種酶的組合物?？梢詫⒃诖怂枋龅慕M合物與動(dòng)物飼料混合，并且可以將其稱為“粉狀飼料”。濃縮物：術(shù)語(yǔ)“濃縮物”意指具有高蛋白和能量濃度的飼料，例如魚粉、糖蜜、低聚糖、高粱、種子和谷物(例如來自玉米、燕麥、黑麥、大麥、小麥的整體或由破碎、碾磨等制備的)、油籽濾餅(例如從棉籽、紅花、向日葵、大豆、油菜籽/卡諾拉、花生或落花生)、棕櫚仁餅、酵母衍生材料和酒糟(例如濕酒糟(wds)和具有可溶物的干酒糟(ddgs))?？刂菩蛄校盒g(shù)語(yǔ)“控制序列”意指對(duì)于表達(dá)編碼本發(fā)明的成熟多肽的多核苷酸所必需的核酸序列。每個(gè)控制序列對(duì)于編碼該多肽的多核苷酸來說可以是天然的(即，來自相同基因)或外源的(即，來自不同基因)，或相對(duì)于彼此是天然的或外源的。此類控制序列包括但不限于前導(dǎo)子、多腺苷酸化序列、前肽序列、啟動(dòng)子、信號(hào)肽序列、以及轉(zhuǎn)錄終止子。至少，控制序列包括啟動(dòng)子，以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號(hào)。出于引入有利于將這些控制序列與編碼多肽的多核苷酸的編碼區(qū)連接的特異性限制酶切位點(diǎn)的目的，這些控制序列可以提供有多個(gè)接頭。歐洲生產(chǎn)效能因子(epef)：術(shù)語(yǔ)“歐洲生產(chǎn)效能因子”是決定生產(chǎn)效率并考慮到飼料轉(zhuǎn)化率、死亡率和日增重的一個(gè)術(shù)語(yǔ)。eef計(jì)算為[(存活率(％)×體重增加(kg))/(以天計(jì)的研究持續(xù)時(shí)間)×fcr)]×100。表達(dá)：術(shù)語(yǔ)“表達(dá)”包括涉及多肽產(chǎn)生的任何步驟，包括但不限于，轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾、以及分泌。表達(dá)載體：術(shù)語(yǔ)“表達(dá)載體”意直鏈性或環(huán)狀dna分子，該分子包含編碼多肽的多核苷酸并且該多核苷酸可操作地與提供用于其表達(dá)的控制序列連接。飼料轉(zhuǎn)化率：術(shù)語(yǔ)“飼料轉(zhuǎn)化率”是指用來增加動(dòng)物的體重一個(gè)指定量的喂給動(dòng)物的飼料量。改進(jìn)的飼料轉(zhuǎn)化率是指更低的飼料轉(zhuǎn)化率。通過“更低的飼料轉(zhuǎn)化率”或“改進(jìn)的飼料轉(zhuǎn)化率”，是指與當(dāng)飼料不包含所述飼料添加劑組合物時(shí)，將動(dòng)物體重增加相同量所需飼料量相比，飼料中飼料添加劑組合物的使用導(dǎo)致需要喂給動(dòng)物的更低量的飼料，來增加動(dòng)物體重一個(gè)指定量。飼料效率：術(shù)語(yǔ)“飼料效率”是指當(dāng)動(dòng)物在一段時(shí)間內(nèi)被任意喂養(yǎng)或喂養(yǎng)指定量的食物時(shí)每單位飼料的體重增加量。通過“增加的飼料效率”是指根據(jù)本發(fā)明的飼料添加劑組合物在飼料中的使用導(dǎo)致與不用所存在的所述飼料添加劑組合物喂養(yǎng)的動(dòng)物相比，每單位飼料攝入的增加的增重。草料：如本文定義的術(shù)語(yǔ)“草料”還包括粗糧。草料是新鮮的植物物料，例如來自草料植物(禾草)和其他草料植物(海草、發(fā)芽谷物和豆類植物)或其任何組合的干草和青貯。草料植物的實(shí)例是紫花苜蓿(alfalfa、lucerne)、百脈根、蕓苔屬植物(例如，羽衣甘藍(lán)、油菜籽(卡諾拉(canola))、蕪菁甘藍(lán)(瑞典蕪菁)、蘿卜)、三葉草(例如，雜三葉、紅三葉、地三葉、白三葉)、禾草(例如，百慕大草、雀麥、偽燕麥草、羊茅、石南草(heathgrass)、草地早熟禾、鴨茅(orchardgrass)、黑麥草、梯牧草(timothy-grass))、玉米(玉蜀黍)、小米、大麥、燕麥、黑麥、高粱、大豆和小麥和蔬菜(如甜菜)。草料進(jìn)一步包括來自谷物產(chǎn)物的作物殘余物(例如玉米秸稈，來自小麥、大麥、燕麥、黑麥和其他谷物的秸稈)，來自蔬菜像甜菜纓(beettop)的殘余，來自油籽產(chǎn)物像來自大豆、油菜籽和其他豆類植物的莖和葉子的殘余，以及來自用于動(dòng)物或人類消耗的谷物精致過程或來自燃料生產(chǎn)或其他行業(yè)的部分。片段：術(shù)語(yǔ)“片段”意指在成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一個(gè)或多個(gè)(例如，若干個(gè))氨基酸的多肽；其中該片段具有蛋白酶活性。在一方面中，片段包括至少173個(gè)氨基酸殘基(例如，seqidno:2、seqidno:4或seqidno:5的氨基酸16至188)、至少177個(gè)氨基酸殘基(例如，seqidno:2、seqidno:4或seqidno:5的氨基酸12至188)、至少181個(gè)氨基酸殘基(例如，seqidno:2、seqidno:4或seqidno:5的氨基酸10至190)、至少185個(gè)氨基酸殘基(例如，seqidno:2、seqidno:4或seqidno:5的氨基酸9至193)、至少190個(gè)氨基酸殘基(例如seqidno:2、seqidno:4或seqidno:5的氨基酸7至196)、或至少195個(gè)氨基酸殘基(例如，seqidno:2、seqidno:4或seqidno:5的氨基酸5至199)。在另一方面中，片段包括至少174個(gè)氨基酸殘基(例如，seqidno:11、seqidno:13或seqidno:14的氨基酸16至189)、至少178個(gè)氨基酸殘基(例如，seqidno:11、seqidno:13或seqidno:14的氨基酸12至189)、至少182個(gè)氨基酸殘基(例如，seqidno:11、seqidno:13或seqidno:14的氨基酸10至191)、至少186個(gè)氨基酸殘基(例如，seqidno:11、seqidno:13或seqidno:14的氨基酸9至194)、至少191個(gè)氨基酸殘基(例如seqidno:11、seqidno:13或seqidno:14的氨基酸7至197)、或至少196個(gè)氨基酸殘基(例如，seqidno:11、seqidno:13或seqidno:14的氨基酸5至200)。在另一方面中，片段包括至少174個(gè)氨基酸殘基(例如，seqidno:17、seqidno:19或seqidno:20的氨基酸16至189)、至少178個(gè)氨基酸殘基(例如，seqidno:17、seqidno:19或seqidno:20的氨基酸12至189)、至少182個(gè)氨基酸殘基(例如，seqidno:17、seqidno:19或seqidno:20的氨基酸10至191)、至少186個(gè)氨基酸殘基(例如，seqidno:17、seqidno:19或seqidno:20的氨基酸9至194)、至少191個(gè)氨基酸殘基(例如seqidno:17、seqidno:19或seqidno:20的氨基酸7至197)、或至少196個(gè)氨基酸殘基(例如，seqidno:17、seqidno:19或seqidno:20的氨基酸5至200)。宿主細(xì)胞：術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”意指易于用包含本發(fā)明的多核苷酸的核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等的任何細(xì)胞類型。該術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”涵蓋親本細(xì)胞的任何后代，由于復(fù)制期間發(fā)生的突變，該后代與其親本細(xì)胞不完全相同。分離的：術(shù)語(yǔ)“分離的”意指處于自然界中不存在的形式或環(huán)境中的物質(zhì)。分離的物質(zhì)的非限制性實(shí)例包括(1)任何非天然存在的物質(zhì)，(2)包括但不限于任何酶、變體、核酸、蛋白、肽或輔因子的任何物質(zhì)，該物質(zhì)至少部分地從與其本質(zhì)相關(guān)的一種或多種或所有天然存在的成分中去除；(3)相對(duì)于天然發(fā)現(xiàn)的物質(zhì)通過人工修飾的任何物質(zhì)；或(4)通過相對(duì)于與其天然相關(guān)的其他組分，增加物質(zhì)的量而修飾的任何物質(zhì)(例如宿主細(xì)胞中的重組產(chǎn)生；編碼該物質(zhì)的基因的多個(gè)拷貝；以及使用比與編碼該物質(zhì)的基因天然相關(guān)的啟動(dòng)子更強(qiáng)的啟動(dòng)子)。成熟多肽：術(shù)語(yǔ)“成熟多肽”意指在翻譯和任何翻譯后修飾如n-末端加工、c-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后處于其最終形式的多肽。在一方面中，基于signalp程序(尼耳森(nielsen)等人，1997，蛋白質(zhì)工程(proteinengineering)10:1-6)，該成熟多肽是seqidno:2的氨基酸1至203，并且seqidno:2的氨基酸-200至-171是信號(hào)肽。在另一方面中，該成熟多肽是基于edmann-末端測(cè)序數(shù)據(jù)和完整ms數(shù)據(jù)的seqidno:4的氨基酸1至203(本文定義為seqidno:5)，并且seqidno:4的氨基酸-197至-171是信號(hào)肽。在另一方面中，基于signalp程序(尼耳森(nielsen)等人，1997，蛋白質(zhì)工程(proteinengineering)10:1-6)，該成熟多肽是seqidno:11的氨基酸1至204，并且seqidno:11的氨基酸-196至-171是信號(hào)肽。在另一方面中，該成熟多肽是基于edmann-末端測(cè)序數(shù)據(jù)和完整ms數(shù)據(jù)的seqidno:13的氨基酸1至204(本文定義為seqidno:14)，并且seqidno:13的氨基酸-197至-171是信號(hào)肽。在另一方面中，基于signalp程序(尼耳森(nielsen)等人，1997，蛋白質(zhì)工程(proteinengineering)10:1-6)，該成熟多肽是seqidno:17的氨基酸1至204，并且seqidno:17的氨基酸-198至-170是信號(hào)肽。在另一方面中，該成熟多肽是基于edmann-末端測(cè)序數(shù)據(jù)和完整ms數(shù)據(jù)的seqidno:19的氨基酸1至204(本文定義為seqidno:20)，并且seqidno:19的氨基酸-198至-170是信號(hào)肽。本領(lǐng)域已知，宿主細(xì)胞可以產(chǎn)生由同一多核苷酸表達(dá)的兩種或更多種不同成熟多肽(即，具有不同c-末端和/或n-末端氨基酸)的混合物。本領(lǐng)域還已知，不同的宿主細(xì)胞不同地加工多肽，并且因此一個(gè)表達(dá)多核苷酸的宿主細(xì)胞當(dāng)與另一個(gè)表達(dá)相同多核苷酸的宿主細(xì)胞相比時(shí)可以產(chǎn)生不同的成熟多肽(例如，具有不同的c-末端和/或n-末端氨基酸)。成熟多肽編碼序列：術(shù)語(yǔ)“成熟多肽編碼序列”意指編碼具有蛋白酶活性的成熟多肽的一種多核苷酸。在一方面中，基于signalp程序(尼耳森(nielsen)等人，1997，見上文)，該成熟多肽編碼序列是seqidno:1的核苷酸601至1209，并且seqidno:1的核苷酸1至90編碼信號(hào)肽。在另一方面中，基于seqidno:4的多肽的edmann-末端測(cè)序數(shù)據(jù)和完整ms數(shù)據(jù)，該成熟多肽編碼序列是seqidno:3的核苷酸592至1200，并且seqidno:3的核苷酸1至81編碼信號(hào)肽。在另一方面中，基于signalp程序(尼耳森(nielsen)等人，1997，見上文)，該成熟多肽編碼序列是seqidno:10的核苷酸589至1200，并且seqidno:10的核苷酸1至78編碼信號(hào)肽。在另一方面中，基于seqidno:13的多肽的edmann-末端測(cè)序數(shù)據(jù)和完整ms數(shù)據(jù)，該成熟多肽編碼序列是seqidno:12的核苷酸592至1203，并且seqidno:12的核苷酸1至81編碼信號(hào)肽。在另一方面中，基于signalp程序(尼耳森(nielsen)等人，1997，見上文)，該成熟多肽編碼序列是seqidno:16的核苷酸595至1206，并且seqidno:16的核苷酸1至87編碼信號(hào)肽。在另一方面中，基于多肽的edmann-末端測(cè)序數(shù)據(jù)和完整ms數(shù)據(jù)，該成熟多肽編碼序列是seqidno:18的核苷酸589至1200，并且seqidno:18的核苷酸1至81編碼信號(hào)肽。核酸構(gòu)建體：術(shù)語(yǔ)“核酸構(gòu)建體”意指單-鏈或雙鏈的核酸分子，該核酸分子是從天然存在的基因中分離的，或以本來不存在于自然界中的方式被修飾成包含核酸的區(qū)段，或是合成的，該核酸分子包括一個(gè)或多個(gè)控制序列。獲得自或可獲得自：術(shù)語(yǔ)“獲得自或可獲得自”是指多肽可以在來自特定分類等級(jí)的生物中發(fā)現(xiàn)。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽獲得自或可獲得自微球菌(micrococcales)(以前稱為微球菌micrococcineae)目，其中術(shù)語(yǔ)目是分類等級(jí)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，該多肽獲得自或可獲得自間孢囊菌科(intrasporangiaceae)，其中術(shù)語(yǔ)科是分類等級(jí)。如果多肽的分類等級(jí)未知，則它可以容易地由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通過進(jìn)行多肽的blastp檢索(使用例如國(guó)家生物技術(shù)信息中心(ncib)網(wǎng)站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)并將其與最接近的同系物進(jìn)行比較來確定。作為已知多肽的片段的未知多肽被認(rèn)為是屬于相同的分類物種。包括在多達(dá)10個(gè)位置中的取代、缺失和/或插入的未知天然多肽或人工變體被認(rèn)為來自與已知多肽相同的分類物種?？刹僮鞯剡B接：術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”意指如下的構(gòu)造，其中，控制序列相對(duì)于多核苷酸的編碼序列安置在適當(dāng)位置，使得該控制序列指導(dǎo)該編碼序列的表達(dá)。小粒：術(shù)語(yǔ)“小?！焙?或“?；笔侵腹腆w圓形、球形和/或圓柱形片或小粒，以及用于形成此類固體形狀的過程，特別是飼料小粒和固體擠出的動(dòng)物飼料。如在此使用的，術(shù)語(yǔ)“擠出(extrusion或extruding)”是本領(lǐng)域眾所周知的術(shù)語(yǔ)，并且是指如此處所描述的，在壓力下使組合物通過一個(gè)孔口的過程。性能參數(shù)：術(shù)語(yǔ)“性能參數(shù)”是指選自以下列表的許多項(xiàng)中的一項(xiàng)，該列表由以下各項(xiàng)組成：體重增加、歐洲生產(chǎn)效率因子(epef)、歐洲生產(chǎn)效能因子(eff)以及fcr。術(shù)語(yǔ)“改進(jìn)一個(gè)或多個(gè)性能參數(shù)”意指在一種或多種動(dòng)物中體重增加的增加、歐洲生產(chǎn)效率因子(epef)的增加、歐洲生產(chǎn)效能因子(eff)的增加和/或fcr的降低。蛋白酶：術(shù)語(yǔ)“蛋白酶”在此被定義為水解肽鍵的酶。蛋白酶的定義也適用于如在此使用的術(shù)語(yǔ)“親本蛋白酶”和“蛋白酶變體”的蛋白酶部分。術(shù)語(yǔ)“蛋白酶”包括屬于ec3.4.21酶組(絲氨酸蛋白酶)的酶。ec編號(hào)參考加利福尼亞州(california)的圣迭戈(sandiego)的nc-iubmb學(xué)術(shù)出版社(academicpress)的1992年酶命名法，分別包括出版于1994，歐洲生物化學(xué)雜志(eur.j.biochem.)223:1-5；1995，歐洲生物化學(xué)雜志232:1-6；1996，歐洲生物化學(xué)雜志237:1-5；1997，歐洲生物化學(xué)雜志250:1-6；以及1999，歐洲生物化學(xué)雜志264:610-650的增刊1-5。命名會(huì)定期得以增補(bǔ)和更新；參見例如萬(wàn)維網(wǎng)(www)于http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html。本發(fā)明的蛋白酶和用于根據(jù)本發(fā)明的用途的蛋白酶選自肽酶家族s1的絲氨酸蛋白酶，如在1993，生物化學(xué)雜志(biochem.j.)290:205-218中和在merops蛋白酶數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)行9.9(2013年8月23日)(www.merops.ac.uk)中所描述的。該數(shù)據(jù)庫(kù)描述于羅林斯(rawlings)，n.d.，巴雷特(barrett)，a.j.和貝特曼(bateman)，a.，2010，“merops：肽酶數(shù)據(jù)庫(kù)(merops:thepeptidasedatabase)”，核酸研究(nucl.acidsres.)38:d227-d233中。為了測(cè)定給定蛋白酶是否為絲氨酸蛋白酶和s1家族的蛋白酶，可參考上述手冊(cè)和其中述及的原理?？梢詫?duì)所有類型的蛋白酶進(jìn)行這樣的測(cè)定，而不論其是天然存在的或野生型蛋白酶；還是基因工程化的或合成的蛋白酶。蛋白酶活性：術(shù)語(yǔ)“蛋白酶活性”意指蛋白水解活性(ec3.4)。具有蛋白酶活性的多肽或蛋白酶有時(shí)還被指定為肽酶、朊酶、肽水解酶或蛋白水解酶。蛋白酶可以是始于任一端的水解肽的外切型蛋白酶或在多肽鏈內(nèi)部發(fā)揮作用的內(nèi)切型蛋白酶(內(nèi)肽酶)。內(nèi)肽酶對(duì)n-和c-末端被封閉的肽底物顯示出活性，這些底物與所討論的蛋白酶的特異性有關(guān)。存在若干種蛋白酶活性類型，例如在arg和lys殘基的羧基末端側(cè)切割的胰蛋白酶樣蛋白酶以及在疏水性氨基酸殘基的羧基末端側(cè)切割的糜蛋白酶樣蛋白酶。本發(fā)明的蛋白酶是具有輕微堿性最適ph(最適ph8-9.5)的絲氨酸內(nèi)肽酶(ec3.4.21)?？梢允褂萌魏螠y(cè)定來測(cè)量蛋白酶活性，其中采用一種底物，該底物包括與所討論的蛋白酶的特異性相關(guān)的肽鍵。ph測(cè)定和溫度測(cè)定同樣適用于所討論的蛋白酶。ph值測(cè)定的實(shí)例是ph2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12。溫度測(cè)定的實(shí)例是15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、80℃、90℃、或95℃。普通蛋白酶底物的實(shí)例是酪蛋白、牛血清白蛋白以及血紅蛋白。在經(jīng)典的安森(anson)和米爾斯基(mirsky)方法中，將變性的血紅蛋白用作底物并且在用所討論的蛋白酶孵育測(cè)定后，確定三氯乙酸可溶的血紅蛋白的量用作蛋白酶活性的量度(安森(anson)，m.l.和米爾斯基(mirsky)，a.e.，1932，普通生理學(xué)雜志(j.gen.physiol.)16:59以及安森，m.l.，1938，普通生理學(xué)雜志22:79)。出于本發(fā)明的目的，使用描述于“材料與方法”中的測(cè)定來確定蛋白酶活性，如suc-aapf-pna測(cè)定和普羅塔酶ak(protazymeak)測(cè)定。對(duì)于普羅塔酶ak(protazymeak)測(cè)定，當(dāng)用該蛋白酶孵育時(shí)，不可溶普羅塔酶ak(protazymeak)(天青精-交聯(lián)的酪蛋白)底物釋放藍(lán)色并且確定該顏色作為蛋白酶活性的量度。對(duì)于suc-aapf-pna測(cè)定，當(dāng)用該蛋白酶孵育時(shí)，無色的suc-aapf-pna底物釋放黃色的對(duì)硝基苯胺并且確定該黃色作為蛋白酶活性的量度。本發(fā)明的這些多肽具有seqidno:5的多肽的至少20％，例如至少40％、至少65％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、以及至少100％的蛋白酶活性。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的這些多肽具有seqidno:14的多肽的至少20％，例如至少40％、至少65％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、以及至少100％的蛋白酶活性。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的這些多肽具有seqidno:20的多肽的至少20％，例如至少40％、至少65％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、以及至少100％的蛋白酶活性。粗糧：術(shù)語(yǔ)“粗糧”意指具有高水平纖維的干植物物料，例如來自種子和谷物以及作物殘余物(例如秸稈、干椰肉(copra)、稻草、谷殼、甜菜廢料)的纖維、麩、苞葉。序列一致性：兩個(gè)氨基酸序列之間或兩個(gè)核苷酸序列之間的相關(guān)性通過參數(shù)“序列一致性”來描述。出于本發(fā)明的目的，使用如在emboss包(emboss：歐洲分子生物學(xué)開放軟件套件，賴斯(rice)等人，2000，遺傳學(xué)趨勢(shì)(trendsgenet.)16:276-277)(優(yōu)選3.0.0版或更新版本)的尼德爾(needle)程序中所實(shí)施的尼德爾曼-翁施(needleman-wunsch)算法(尼德爾曼(needleman)和翁施(wunsch)，1970，分子生物學(xué)雜志(j.mol.biol.)48:443-453)來確定兩個(gè)氨基酸序列之間的序列一致性程度。使用版本6.1.0。所用的任選參數(shù)是空位開放罰分10、空位延伸罰分0.5，和eblosum62(blosum62的emboss版)替代矩陣。尼德爾標(biāo)注的“最長(zhǎng)的一致性”的輸出(使用-非簡(jiǎn)化選項(xiàng)獲得)被用作百分比一致性，并且如下計(jì)算：(相同殘基x100)/(比對(duì)的長(zhǎng)度-在比對(duì)中的空位總數(shù))出于本發(fā)明的目的，使用如在emboss包(emboss：歐洲分子生物學(xué)開放軟件套件，賴斯(rice)等人，2000，同上)(優(yōu)選3.0.0版或更新版本)的尼德爾程序中所實(shí)施的尼德爾曼-翁施算法(尼德爾曼(needleman)和翁施(wunsch)，1970，同上)來確定兩個(gè)脫氧核糖核苷酸序列之間的序列一致性程度。使用版本6.1.0。所用的任選參數(shù)是空位開放罰分10、空位延伸罰分0.5，和ednafull(ncbinuc4.4的emboss版)替代矩陣。尼德爾標(biāo)注的“最長(zhǎng)的一致性”的輸出(使用-非簡(jiǎn)化選項(xiàng)獲得)被用作百分比一致性，并且如下計(jì)算：(一致的脫氧核糖核苷酸x100)/(比對(duì)長(zhǎng)度-比對(duì)中的空位總數(shù))青貯：術(shù)語(yǔ)“青貯”是指可以飼喂反芻動(dòng)物(反芻-咀嚼(cud-chewing)動(dòng)物，如牛和綿羊)或用作厭氧消化器的生物燃料原料的發(fā)酵的、高水分儲(chǔ)存飼料。它被發(fā)酵并儲(chǔ)存在稱為青貯(ensilage、ensiling或silaging)的過程中，并且通常由草或谷類作物(例如玉米、高粱、燕麥、黑麥、梯牧草等飼草植物)或豆類作物(如三葉草(clovers/trefoils)、苜蓿、野豌豆)使用整個(gè)綠色植物(不僅是谷物)制成。青貯可以由許多大田作物制成，并且取決于類型可以使用特殊術(shù)語(yǔ)(針對(duì)燕麥的燕麥青貯(oatlage)、針對(duì)苜蓿的半干青貯(haylage))。通過將切割的綠色植被放在青貯窖中，通過將其堆積在用塑料片覆蓋的大堆中，抑或通過將大包包裹在塑料膜中來制造青貯。嚴(yán)格條件：不同的嚴(yán)格條件定義如下。術(shù)語(yǔ)“非常低嚴(yán)格條件”意指對(duì)于長(zhǎng)度為至少100個(gè)核苷酸的探針而言，遵循標(biāo)準(zhǔn)dna印跡程序，在42℃下在5xsspe、0.3％sds、200微克/ml剪切并變性的鮭魚精子dna和25％甲酰胺中預(yù)雜交和雜交12至24小時(shí)。載體材料最終使用1.2xssc、0.2％sds，在65℃下洗滌三次，每次15分鐘。術(shù)語(yǔ)“低嚴(yán)格條件”意指對(duì)于長(zhǎng)度為至少100個(gè)核苷酸的探針而言，遵循標(biāo)準(zhǔn)dna印跡程序，在42℃下在5xsspe、0.3％sds、200微克/ml剪切并變性的鮭魚精子dna和25％甲酰胺中預(yù)雜交和雜交12至24小時(shí)。載體材料最終使用1.2xssc、0.2％sds，在70℃下洗滌三次，每次15分鐘。術(shù)語(yǔ)“中嚴(yán)格條件”意指對(duì)于長(zhǎng)度為至少100個(gè)核苷酸的探針而言，遵循標(biāo)準(zhǔn)dna印跡程序，在42℃下在5xsspe、0.3％sds、200微克/ml剪切并變性的鮭魚精子dna和35％甲酰胺中預(yù)雜交和雜交12至24小時(shí)。載體材料最終使用0.6xssc、0.2％sds，在70℃下洗滌三次，每次15分鐘。術(shù)語(yǔ)“中-高嚴(yán)格條件”意指對(duì)于長(zhǎng)度為至少100個(gè)核苷酸的探針而言，遵循標(biāo)準(zhǔn)dna印跡程序，在42℃下在5xsspe、0.3％sds、200微克/ml剪切并變性的鮭魚精子dna和35％甲酰胺中預(yù)雜交和雜交12至24小時(shí)。載體材料最終使用0.6xssc、0.2％sds，在75℃下洗滌三次，每次15分鐘。術(shù)語(yǔ)“高嚴(yán)格條件”意指對(duì)于長(zhǎng)度為至少100個(gè)核苷酸的探針而言，遵循標(biāo)準(zhǔn)dna印跡程序，在42℃下在5xsspe、0.3％sds、200微克/ml剪切并變性的鮭魚精子dna和50％甲酰胺中預(yù)雜交和雜交12至24小時(shí)。載體材料最終使用0.3xssc、0.2％sds，在75℃下洗滌三次，每次15分鐘。術(shù)語(yǔ)“非常高嚴(yán)格條件”意指對(duì)于長(zhǎng)度為至少100個(gè)核苷酸的探針而言，遵循標(biāo)準(zhǔn)dna印跡程序，在42℃下在5xsspe、0.3％sds、200微克/ml剪切并變性的鮭魚精子dna和50％甲酰胺中預(yù)雜交和雜交12至24小時(shí)。載體材料最終使用0.15xssc、0.2％sds，在75℃下洗滌三次，每次15分鐘。子序列：術(shù)語(yǔ)“子序列”意指使一個(gè)或多個(gè)(例如，若干個(gè))核苷酸從成熟多肽編碼序列的5'端和/或3'端缺失的多核苷酸；其中該子序列編碼具有蛋白酶活性的片段。在一方面中，子序列包含至少519個(gè)核苷酸(例如，seqidno:1的核苷酸646至1164)、至少531個(gè)核苷酸(例如，seqidno:1的核苷酸634至1164)、至少543個(gè)核苷酸(例如，seqidno:1的核苷酸628至1170)、至少555個(gè)核苷酸(例如，seqidno:1的核苷酸625至1179)、至少570個(gè)核苷酸(例如，seqidno:1的核苷酸619至1188)、或至少585個(gè)核苷酸(例如，seqidno:1的核苷酸613至1197)。在另一方面中，子序列包含至少522個(gè)核苷酸(例如，seqidno:10的核苷酸634至1155)、至少534個(gè)核苷酸(例如，seqidno:10的核苷酸622至1155)、至少546個(gè)核苷酸(例如，seqidno:10的核苷酸614至1161)、至少558個(gè)核苷酸(例如，seqidno:10的核苷酸611至1170)、至少573個(gè)核苷酸(例如，seqidno:10的核苷酸605至1179)、或至少588個(gè)核苷酸(例如，seqidno:10的核苷酸599至1188)。在另一方面中，子序列包含至少522個(gè)核苷酸(例如，seqidno:16的核苷酸640至1161)、至少534個(gè)核苷酸(例如，seqidno:16的核苷酸628至1161)、至少546個(gè)核苷酸(例如，seqidno:16的核苷酸620至1167)、至少558個(gè)核苷酸(例如，seqidno:16的核苷酸617至1176)、至少573個(gè)核苷酸(例如，seqidno:16的核苷酸611至1185)、或至少588個(gè)核苷酸(例如，seqidno:16的核苷酸605至1194)?；旧霞兊亩嚯模盒g(shù)語(yǔ)“基本上純的多肽”意指這樣一種制劑，該制劑包含與其天然關(guān)聯(lián)或重組關(guān)聯(lián)的按重量計(jì)至多10％、至多8％、至多6％、至多5％、至多4％、至多3％、至多2％、至多1％、以及至多0.5％的其他多肽材料。優(yōu)選地，該多肽按存在于制劑中的總多肽材料的重量計(jì)是至少92％純的，例如至少94％純的、至少95％純的、至少96％純的、至少97％純的、至少98％純的、至少99％純的、至少99.5％純的、以及100％純的。本發(fā)明的多肽優(yōu)選處于基本上純的形式。例如，這可以通過采用熟知的重組方法或采用經(jīng)典的純化方法制備多肽來完成。變體：術(shù)語(yǔ)“變體”意指在一個(gè)或多個(gè)(若干個(gè))位置包含改變(即，一個(gè)或多個(gè)(若干個(gè))氨基酸殘基的取代、插入和/或缺失)的具有蛋白酶活性的多肽。取代意指用不同的氨基酸置換占據(jù)一個(gè)位置的氨基酸；缺失意指去除占據(jù)一個(gè)位置的氨基酸；并且插入意指鄰近占據(jù)一個(gè)位置的氨基酸添加1-3個(gè)氨基酸。本發(fā)明的這些變體具有seqidno:5、和/或seqidno:14和/或seqidno:20的至少20％，例如至少40％、至少65％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少100％的蛋白酶活性。命名法出于本發(fā)明的目的，命名法[e/q]是指在該位置的氨基酸可以是谷氨酸(glu，e)或谷氨酰胺(gln，q)。同樣，命名法[v/g/a/i]是指在該位置的氨基酸可以是纈氨酸(val，v)、甘氨酸(gly，g)、丙氨酸(ala，a)或異亮氨酸(ile，i)，依次類推如本文所述的其他組合。除非進(jìn)一步另有限制，氨基酸x被這樣定義，使得它可以是20種天然氨基酸中的任一種。發(fā)明詳述包含具有蛋白酶活性的多肽的動(dòng)物飼料或動(dòng)物飼料添加劑大豆和玉米是在農(nóng)業(yè)中兩種高度使用的蛋白質(zhì)來源，并且因此重要的是，蛋白酶對(duì)這類底物具有良好的活性。此外，在整個(gè)胃腸ph范圍內(nèi)(即在約ph3和ph7.5之間)表現(xiàn)出高活性的蛋白酶將具有重大意義，因?yàn)榭梢灶A(yù)期它們更好地在攝入后不久降解底物，并且貫穿大部分胃腸道。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，一些蛋白酶對(duì)商業(yè)相關(guān)的底物(大豆-玉米)具有令人驚訝的良好的ph-活性圖，并且在比蛋白酶10r(seqidno:8)更低的ph范圍(4-5)中是顯著更有活性的，同時(shí)在中性ph下也保持可比較的活性。因此，在第一方面中，本發(fā)明涉及包含一種或多種具有蛋白酶活性的多肽的動(dòng)物飼料或動(dòng)物飼料添加劑，其中：(a)該多肽是肽酶家族s1的絲氨酸蛋白酶；(b)該多肽在ph4下與同一ph下蛋白酶10r(seqidno:8)的活性相比，具有對(duì)大豆-玉米粉至少2倍更高的活性，例如至少2.25倍、至少2.5倍、至少2.75倍、至少3倍、至少3.25倍、至少3.5倍、至少3.75倍或至少4倍更高的活性；(c)該多肽在ph5下與同一ph下蛋白酶10r(seqidno:8)的活性相比，具有對(duì)大豆-玉米粉至少2倍更高的活性，例如至少2.25倍、至少2.5倍、至少2.75倍或至少3倍更高的活性；并且(d)與同一ph下蛋白酶10r(seqidno:8)相比，該多肽在ph7下對(duì)大豆-玉米粉具有至少50％的活性，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％(即，至少相同)、或至少105％的活性。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，該多肽包括一個(gè)或多個(gè)基序vcg[e/q]kvgqp(seqidno:15)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，使用如本文定義部分中所述的大豆-玉米粉測(cè)定法來確定該多肽對(duì)大豆-玉米粉的活性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽在ph4下對(duì)大豆-玉米粉具有少于20倍，例如少于15倍、少于10倍、少于9倍、少于8倍的蛋白酶10r(seqidno:8)的活性，并且在ph5下對(duì)大豆-玉米粉具有少于20倍，例如少于15倍、少于10倍、少于9倍、少于8倍的蛋白酶10r(seqidno:8)的活性。在一個(gè)實(shí)施例中，與同一ph下蛋白酶10r(seqidno:8)相比，該多肽在ph7下對(duì)大豆-玉米粉具有小于200％的活性，例如小于180％、小于170％、小于160％、小于150％、小于140％、小于130％或小于125％的活性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽在ph4下對(duì)大豆-玉米粉具有至少2倍更高的活性，在ph5下對(duì)大豆-玉米粉具有至少2倍更高的活性并且在ph7下具有蛋白酶10r(seqidno:8)的至少75％的活性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽在ph4下對(duì)大豆-玉米粉具有至少2倍更高的活性，在ph5下對(duì)大豆-玉米粉具有至少2倍更高的活性并且在ph7下具有蛋白酶10r(seqidno:8)的至少90％的活性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽在ph4下對(duì)大豆-玉米粉具有至少2.5倍更高的活性，在ph5下對(duì)大豆-玉米粉具有至少2.25倍更高的活性并且在ph7下具有蛋白酶10r(seqidno:8)的至少75％的活性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽在ph4下對(duì)大豆-玉米粉具有至少2.5倍更高的活性，在ph5下對(duì)大豆-玉米粉具有至少2.25倍更高的活性并且在ph7下具有蛋白酶10r(seqidno:8)的至少90％的活性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽在ph4下對(duì)大豆-玉米粉具有至少3倍更高的活性，在ph5下對(duì)大豆-玉米粉具有至少2.5倍更高的活性并且在ph7下具有蛋白酶10r(seqidno:8)的至少75％的活性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽在ph4下對(duì)大豆-玉米粉具有至少3倍更高的活性，在ph5下對(duì)大豆-玉米粉具有至少2.5倍更高的活性并且在ph7下具有蛋白酶10r(seqidno:8)的至少90％的活性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽在ph4下對(duì)大豆-玉米粉具有至少3.5倍更高的活性，在ph5下對(duì)大豆-玉米粉具有至少2.75倍更高的活性并且在ph7下具有蛋白酶10r(seqidno:8)的至少75％的活性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽在ph4下對(duì)大豆-玉米粉具有至少3.5倍更高的活性，在ph5下對(duì)大豆-玉米粉具有至少2.75倍更高的活性并且在ph7下具有蛋白酶10r(seqidno:8)的至少90％的活性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽在ph4下對(duì)大豆-玉米粉具有至少4倍更高的活性，在ph5下對(duì)大豆-玉米粉具有至少3倍更高的活性并且在ph7下具有蛋白酶10r(seqidno:8)的至少75％的活性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽在ph4下對(duì)大豆-玉米粉具有至少4倍更高的活性，在ph5下對(duì)大豆-玉米粉具有至少3倍更高的活性并且在ph7下具有蛋白酶10r(seqidno:8)的至少90％的活性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽在ph4下對(duì)大豆-玉米粉具有至少4.5倍更高的活性，在ph5下對(duì)大豆-玉米粉具有至少3倍更高的活性并且在ph7下具有蛋白酶10r(seqidno:8)的至少75％的活性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽在ph4下對(duì)大豆-玉米粉具有至少4.5倍更高的活性，在ph5下對(duì)大豆-玉米粉具有至少3倍更高的活性并且在ph7下具有蛋白酶10r(seqidno:8)的至少90％的活性。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，該多肽獲得自或可獲得自微球菌目。在一個(gè)甚至更優(yōu)選的實(shí)施例中，該多肽獲得自或可獲得自間孢囊菌科。在第二方面中，本發(fā)明涉及包含一種或多種具有蛋白酶活性的多肽的動(dòng)物飼料或動(dòng)物飼料添加劑，其中：(a)該多肽是肽酶家族s1的絲氨酸蛋白酶；(b)與在ph7下的活性相比，該多肽在ph4下對(duì)大豆-玉米粉具有至少25％的活性，例如至少30％、至少35％或至少40％的活性；(c)與在ph7下的活性相比，該多肽在ph5下對(duì)大豆-玉米粉具有至少45％的活性，例如至少50％、至少55％、至少60％、或至少65％的活性；并且(d)與同一ph下蛋白酶10r(seqidno:8)相比，該多肽在ph7下對(duì)大豆-玉米粉具有至少50％的活性，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％(即，至少相同)、或至少105％的活性。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，該多肽包括一個(gè)或多個(gè)基序vcg[e/q]kvgqp(seqidno:15)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，使用如本文定義部分中所述的大豆-玉米粉測(cè)定法來確定該多肽對(duì)大豆-玉米粉的活性。在一個(gè)實(shí)施例中，與在ph7下的活性相比，該多肽在ph4下對(duì)大豆-玉米粉具有小于100％的活性，例如小于90％、小于80％、小于75％或小于70％的活性，并且與在ph7下的活性相比，在ph5下對(duì)大豆-玉米粉具有小于95％，例如小于90％、小于85％或小于80％的活性。在一個(gè)實(shí)施例中，與同一ph下蛋白酶10r(seqidno:8)相比，該多肽在ph7下對(duì)大豆-玉米粉具有小于200％的活性，例如小于180％、小于170％、小于160％、小于150％、小于140％、小于130％或小于125％的活性。在一個(gè)實(shí)施例中，與在ph7下的活性相比，該多肽在ph4下具有至少25％的活性；與在ph7下的活性相比，該多肽在ph5下具有至少45％的活性；并且該多肽在ph7下具有蛋白酶10r(seqidno:8)的至少75％的活性。在一個(gè)實(shí)施例中，與在ph7下的活性相比，該多肽在ph4下具有至少25％的活性；與在ph7下的活性相比，該多肽在ph5下具有至少45％的活性；并且該多肽在ph7下具有蛋白酶10r(seqidno:8)的至少90％的活性。在一個(gè)實(shí)施例中，與在ph7下的活性相比，該多肽在ph4下具有至少30％的活性；與在ph7下的活性相比，該多肽在ph5下具有至少55％的活性；并且該多肽在ph7下具有蛋白酶10r(seqidno:8)的至少75％的活性。在一個(gè)實(shí)施例中，與在ph7下的活性相比，該多肽在ph4下具有至少30％的活性；與在ph7下的活性相比，該多肽在ph5下具有至少55％的活性；并且該多肽在ph7下具有蛋白酶10r(seqidno:8)的至少90％的活性。在一個(gè)實(shí)施例中，與在ph7下的活性相比，該多肽在ph4下具有至少35％的活性；與在ph7下的活性相比，該多肽在ph5下具有至少60％的活性；并且該多肽在ph7下具有蛋白酶10r(seqidno:8)的至少75％的活性。在一個(gè)實(shí)施例中，與在ph7下的活性相比，該多肽在ph4下具有至少35％的活性；與在ph7下的活性相比，該多肽在ph5下具有至少60％的活性；并且該多肽在ph7下具有蛋白酶10r(seqidno:8)的至少90％的活性。在一個(gè)實(shí)施例中，與在ph7下的活性相比，該多肽在ph4下具有至少40％的活性；與在ph7下的活性相比，該多肽在ph5下具有至少65％的活性；并且該多肽在ph7下具有蛋白酶10r(seqidno:8)的至少75％的活性。在一個(gè)實(shí)施例中，與在ph7下的活性相比，該多肽在ph4下具有至少40％的活性；與在ph7下的活性相比，該多肽在ph5下具有至少65％的活性；并且該多肽在ph7下具有蛋白酶10r(seqidno:8)的至少90％的活性。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，該多肽獲得自或可獲得自微球菌目。在一個(gè)甚至更優(yōu)選的實(shí)施例中，該多肽獲得自或可獲得自間孢囊菌科。在第三方面中，本發(fā)明涉及包含一種或多種具有蛋白酶活性的多肽的動(dòng)物飼料或動(dòng)物飼料添加劑，其中：(a)該多肽是肽酶家族s1的絲氨酸蛋白酶；并且(b)該多肽獲得自或可獲得自間孢囊菌科。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽包括一個(gè)或多個(gè)基序vcg[e/q]kvgqp(seqidno:15)。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽在ph4下與同一ph下蛋白酶10r(seqidno:8)的活性相比，具有對(duì)大豆-玉米粉至少2倍更高的活性，例如至少2.25倍、至少2.5倍、至少2.75倍、至少3倍、至少3.25倍、至少3.5倍、至少3.75倍或至少4倍更高的活性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽在ph5下與同一ph下蛋白酶10r(seqidno:8)的活性相比，具有對(duì)大豆-玉米粉至少2倍更高的活性，例如至少2.25倍、至少2.5倍、至少2.75倍或至少3倍更高的活性。在一個(gè)實(shí)施例中，與同一ph下蛋白酶10r(seqidno:8)相比，該多肽在ph7下對(duì)大豆-玉米粉具有至少50％的活性，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％(即，至少相同)、或至少105％的活性。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，該多肽：(a)在ph4下與同一ph下蛋白酶10r(seqidno:8)的活性相比，具有對(duì)大豆-玉米粉至少2倍更高的活性，例如至少2.25倍、至少2.5倍、至少2.75倍、至少3倍、至少3.25倍、至少3.5倍、至少3.75倍或至少4倍更高的活性；(b)在ph5下與同一ph下蛋白酶10r(seqidno:8)的活性相比，具有對(duì)大豆-玉米粉至少2倍更高的活性，例如至少2.25倍、至少2.5倍、至少2.75倍或至少3倍更高的活性；并且(c)與同一ph下蛋白酶10r(seqidno:8)相比，在ph7下對(duì)大豆-玉米粉具有至少50％的活性，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％(即，至少相同)、或至少105％的活性。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，該多肽：(a)該多肽包括一個(gè)或多個(gè)基序vcg[e/q]kvgqp(seqidno:15)；(b)在ph4下與同一ph下蛋白酶10r(seqidno:8)的活性相比，具有對(duì)大豆-玉米粉至少2倍更高的活性，例如至少2.25倍、至少2.5倍、至少2.75倍、至少3倍、至少3.25倍、至少3.5倍、至少3.75倍或至少4倍更高的活性；(c)在ph5下與同一ph下蛋白酶10r(seqidno:8)的活性相比，具有對(duì)大豆-玉米粉至少2倍更高的活性，例如至少2.25倍、至少2.5倍、至少2.75倍或至少3倍更高的活性；并且(d)與同一ph下蛋白酶10r(seqidno:8)相比，在ph7下對(duì)大豆-玉米粉具有至少50％的活性，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％(即，至少相同)、或至少105％的活性。在第四方面中，本發(fā)明涉及包含一種或多種具有蛋白酶活性的多肽的動(dòng)物飼料或動(dòng)物飼料添加劑，其中該多肽與seqidno:2的成熟多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，這些多肽與seqidno:2的成熟多肽相差多達(dá)50個(gè)氨基酸，例如1和50個(gè)氨基酸之間，例如1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10或1-5個(gè)氨基酸，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個(gè)氨基酸。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽包括一個(gè)或多個(gè)基序vcg[e/q]kvgqp(seqidno:15)。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽已經(jīng)被分離。動(dòng)物飼料或動(dòng)物飼料添加劑優(yōu)選地包括seqidno:2的氨基酸序列或其等位基因變體或由它們組成；是一個(gè)從n-末端或c-末端缺失例如30、26、22、18、13、11、8或5個(gè)氨基酸并且具有蛋白酶活性的片段，或者是一個(gè)具有蛋白酶活性的片段，其中該片段包括至少173個(gè)氨基酸，例如至少177個(gè)氨基酸、至少181個(gè)氨基酸、至少185個(gè)氨基酸、至少190個(gè)氨基酸、至少195個(gè)氨基酸或至少200個(gè)氨基酸。在另一個(gè)實(shí)施例中，該動(dòng)物飼料或動(dòng)物飼料添加劑包含seqidno:2的成熟多肽或由其組成。在另一個(gè)實(shí)施例中，該動(dòng)物飼料或動(dòng)物飼料添加劑包含seqidno:2的氨基酸1至203或由其組成。在第四方面的延續(xù)中，本發(fā)明涉及包含一種或多種具有蛋白酶活性的多肽的動(dòng)物飼料或動(dòng)物飼料添加劑，其中該多肽與seqidno:5具有至少65％序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽與seqidno:5具有至少70％序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽與seqidno:5具有至少75％序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽與seqidno:5具有至少80％序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽與seqidno:5具有至少81％序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽與seqidno:5具有至少82％序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽與seqidno:5具有至少83％序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽與seqidno:5具有至少84％序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽與seqidno:5具有至少85％序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽與seqidno:5具有至少86％序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽與seqidno:5具有至少87％序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽與seqidno:5具有至少88％序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽與seqidno:5具有至少89％序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽與seqidno:5具有至少90％序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽與seqidno:5具有至少91％序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽與seqidno:5具有至少92％序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽與seqidno:5具有至少93％序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽與seqidno:5具有至少94％序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽與seqidno:5具有至少95％序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽與seqidno:5具有至少96％序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽與seqidno:5具有至少97％序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽與seqidno:5具有至少98％序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽與seqidno:5具有至少99％序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽包括一個(gè)或多個(gè)基序vcg[e/q]kvgqp(seqidno:15)。在第四方面的延續(xù)中，這些多肽與seqidno:5相差多達(dá)50個(gè)氨基酸，例如1和50個(gè)氨基酸之間，例如1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10或1-5個(gè)氨基酸，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個(gè)氨基酸。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽包括一個(gè)或多個(gè)基序vcg[e/q]kvgqp(seqidno:15)。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽已經(jīng)被分離。動(dòng)物飼料或動(dòng)物飼料添加劑優(yōu)選地包括seqidno:5的氨基酸序列或其等位基因變體或由它們組成；是一個(gè)從n-末端或c-末端缺失例如30、26、22、18、13、11、8或5個(gè)氨基酸并且具有蛋白酶活性的片段，或者是一個(gè)具有蛋白酶活性的片段，其中該片段包括至少173個(gè)氨基酸，例如至少177個(gè)氨基酸、至少181個(gè)氨基酸、至少185個(gè)氨基酸、至少190個(gè)氨基酸、至少195個(gè)氨基酸或至少200個(gè)氨基酸。在另一個(gè)實(shí)施例中，該動(dòng)物飼料或動(dòng)物飼料添加劑包含seqidno:5的氨基酸1至203或由其組成。在第四方面的延續(xù)中，本發(fā)明涉及包含一種或多種具有蛋白酶活性的多肽的動(dòng)物飼料或動(dòng)物飼料添加劑，這些多肽由以下多核苷酸編碼，該多核苷酸在低嚴(yán)格條件、中嚴(yán)格條件、中-高嚴(yán)格條件、高嚴(yán)格條件、或非常高嚴(yán)格條件下與以下各項(xiàng)雜交：(i)seqidno:1的成熟多肽編碼序列，(ii)seqidno:3的成熟多肽編碼序列，或者(iii)(i)或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)體(薩姆布魯克(sambrook)等人，1989，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(molecularcloning,alaboratorymanual)，第2版，冷泉港，紐約)。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽已經(jīng)被分離。在第四方面的延續(xù)中，本發(fā)明涉及包含一種或多種具有蛋白酶活性的多肽的動(dòng)物飼料或動(dòng)物飼料添加劑，這些多肽由以下多核苷酸編碼，該多核苷酸與seqidno:1的成熟多肽編碼序列具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。在另外的實(shí)施例中，該多肽已經(jīng)被分離。在第四方面的延續(xù)中，本發(fā)明涉及包含一種或多種具有蛋白酶活性的多肽的動(dòng)物飼料或動(dòng)物飼料添加劑，這些多肽由以下多核苷酸編碼，該多核苷酸與seqidno:3的成熟多肽編碼序列具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。在另外的實(shí)施例中，該多肽已經(jīng)被分離。在第四方面的延續(xù)中，本發(fā)明涉及包含seqidno:5的一個(gè)或多個(gè)變體的動(dòng)物飼料或動(dòng)物飼料添加劑，其中該變體具有蛋白酶活性并且在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個(gè)位置中包括一個(gè)或多個(gè)取代、和/或缺失、和/或插入或其任何組合。在一個(gè)實(shí)施例中，包括在seqidno:5中的取代和/或缺失和/或插入或其任何組合的位置的數(shù)目在1和50之間，例如1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10或1-5個(gè)位置。在一個(gè)實(shí)施例中，包括在seqidno:5中的取代和/或缺失和/或插入或其任何組合的位置的數(shù)目不超過10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)。在另一個(gè)實(shí)施例中，在seqidno:5中的取代和/或缺失和/或插入的數(shù)目不超過10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)。在另一個(gè)實(shí)施例中，在seqidno:5中的取代的數(shù)目不超過10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽包括一個(gè)或多個(gè)基序vcg[e/q]kvgqp(seqidno:15)。氨基酸改變可以具有次要性質(zhì)，即不顯著影響蛋白質(zhì)的折疊和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地1-30個(gè)氨基酸的小缺失；小的氨基-或羧基末端延伸，如氨基末端蛋氨酸殘基；至多20-25個(gè)殘基的小接頭肽；或通過改變凈電荷或另一功能來促進(jìn)純化的小延伸，如多組氨酸序列、抗原性表位或結(jié)合結(jié)構(gòu)域。保守取代的實(shí)例是在下組的范圍內(nèi)：堿性氨基酸(精氨酸、賴氨酸及組氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸及纈氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸及甲硫氨酸)。一般不會(huì)改變比活性的氨基酸取代是本領(lǐng)域已知的并且例如由h.諾伊拉特(neurath)和r.l.希爾(hill)，1979，在蛋白質(zhì)(theproteins)，學(xué)術(shù)出版社(academicpress)，紐約中描述。常見的取代為ala/ser、val/ile、asp/glu、thr/ser、ala/gly、ala/thr、ser/asn、ala/val、ser/gly、tyr/phe、ala/pro、lys/arg、asp/asn、leu/ile、leu/val、ala/glu、和asp/gly?？商娲?，氨基酸改變具有這樣一種性質(zhì)：改變多肽的物理化學(xué)特性。例如，氨基酸改變可以改進(jìn)多肽的熱穩(wěn)定性、改變底物特異性、改變最適ph等?？梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域已知的方法，如定點(diǎn)誘變或丙氨酸掃描誘變鑒定多肽中的必需氨基酸(康寧漢(cunningham)和韋爾斯(wells)，1989，科學(xué)(science)244:1081-1085)。在后一項(xiàng)技術(shù)中，在該分子中的每個(gè)殘基處引入單個(gè)丙氨酸突變，并且對(duì)所得突變體分子的蛋白酶活性進(jìn)行測(cè)試以鑒定對(duì)于該分子的活性至關(guān)重要的氨基酸殘基。還參見希爾頓(hilton)等人，1996，生物化學(xué)雜志(j.biol.chem.)271:4699-4708。也可結(jié)合假定接觸位點(diǎn)氨基酸的突變，如通過以下技術(shù)例如核磁共振、結(jié)晶學(xué)、電子衍射、或光親和標(biāo)記進(jìn)行確定的對(duì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行物理學(xué)分析，從而確定酶的活性位點(diǎn)或其他生物學(xué)相互作用。參見，例如德沃斯(devos)等人，1992，科學(xué)(science)255:306-312；史密斯(smith)等人，1992，分子生物學(xué)雜志(j.mol.biol.)224:899-904；烏樂達(dá)維爾(wlodaver)等人，1992，歐洲生物化學(xué)學(xué)會(huì)聯(lián)盟通訊(febslett.)309:59-64。也可以從與相關(guān)多肽的比對(duì)推斷必需氨基酸的身份。s1家族的肽酶包含按his、asp、ser順序的催化三聯(lián)體。該催化三聯(lián)體的任意氨基酸的突變將導(dǎo)致酶活性或底物特異性的變化或損失。如從兩面神菌屬htcc2649(seqidno:5)分離的s1蛋白酶1的催化三聯(lián)體的氨基酸是位置his-35、asp-62和ser-148。如從土壤球菌屬(terracoccussp.)(seqidno:14)分離的s1蛋白酶1的催化三聯(lián)體的氨基酸是位置his-35、asp-62和ser-149。如從黃色諾爾氏菌(seqidno:20)分離的s1蛋白酶1的催化三聯(lián)體的氨基酸是位置his-35、asp-62和ser-149?？梢宰龀鰡蝹€(gè)或多個(gè)氨基酸取代、缺失和/或插入并且使用已知的誘變、重組和/或改組方法進(jìn)行測(cè)試，隨后進(jìn)行有關(guān)篩選程序，如由里德哈爾-奧爾森(reidhaar-olson)和薩奧爾(sauer)，1988，科學(xué)(science)241:53-57；博維(bowie)和薩奧爾，1989，美國(guó)科學(xué)院院刊(proc.natl.acad.sci.usa)86:2152-2156；wo95/17413；或wo95/22625所披露的那些?？梢允褂玫钠渌椒òㄒ族e(cuò)pcr、噬菌體展示(例如，羅曼(lowman)等人，1991，生物化學(xué)(biochemistry)30:10832-10837；美國(guó)專利號(hào)5,223,409；wo92/06204)和區(qū)域定向誘變(德比舍爾(derbyshire)等人，1986，基因(gene)46:145；ner等人，1988，dna7:127)。誘變/改組方法可以與高通量自動(dòng)化篩選方法組合以檢測(cè)由宿主細(xì)胞表達(dá)的克隆的誘變多肽的活性(奈斯(ness)等人，1999，自然生物技術(shù)(naturebiotechnology)17:893-896)?？梢詮乃拗骷?xì)胞回收編碼活性多肽的誘變的dna分子，并且使用本領(lǐng)域內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)方法快速測(cè)序。這些方法允許迅速確定多肽中單個(gè)氨基酸殘基的重要性。該多肽可以是雜合多肽，其中一種多肽的區(qū)域在另一種多肽的區(qū)域的n-末端或c-末端處融合。該多肽可以是融合多肽或可裂解的融合多肽，其中另一種多肽在本發(fā)明多肽的n-末端或c-末端處融合。通過將編碼另一種多肽的多核苷酸與本發(fā)明多核苷酸融合而產(chǎn)生融合多肽。用于產(chǎn)生融合多肽的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，并且包括連接編碼多肽的編碼序列，使得它們?cè)诳騼?nèi)，并且融合多肽的表達(dá)處于相同的啟動(dòng)子和終止子的控制之下。也可以使用內(nèi)含肽技術(shù)構(gòu)建融合多肽，其中以翻譯后方式產(chǎn)生融合多肽(庫(kù)珀(cooper)等人，1993，歐洲分子生物學(xué)學(xué)會(huì)雜志(emboj.)12:2575-2583；道森(dawson)等人，1994，科學(xué)(science)266:776-779)。融合多肽可以進(jìn)一步包括兩種多肽之間的切割位點(diǎn)。在融合蛋白分泌之時(shí)，該位點(diǎn)被切割，從而釋放出這兩種多肽。切割位點(diǎn)的實(shí)例包括但不局限于在以下文獻(xiàn)中披露的位點(diǎn)：馬丁(martin)等人，2003，工程微生物和生物技術(shù)雜志(j.ind.microbiol.biotechnol.)3:568-576；斯瓦蒂娜(svetina)等人，2000，生物技術(shù)雜志(j.biotechnol.)76:245-251；拉斯馬森-威爾遜(rasmussen-wilson)等人，1997，應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)(appl.environ.microbiol.)，63:3488-3493；沃德(ward)等人，1995，生物技術(shù)(biotechnology)13:498-503；以及孔特雷拉斯(contreras)等人，1991，生物技術(shù)(biotechnology)9:378-381；伊頓(eaton)等人，1986，生物化學(xué)(biochemistry)25:505-512；柯林斯-瑞思(collins-racie)等人，1995，生物技術(shù)13:982-987；卡特(carter)等人，1989，蛋白質(zhì)：結(jié)構(gòu)、功能以及遺傳學(xué)(proteins:structure,function,andgenetics)6:240-248；以及史蒂文斯(stevens)，2003，世界藥物發(fā)現(xiàn)(drugdiscoveryworld)4:35-48。碳水化合物分子通常在翻譯后修飾過程中附接至來自真菌來源的多肽。為了輔助質(zhì)譜分析，該多肽可以用內(nèi)切糖苷酶孵育以使各n-連接的位置去糖基化。對(duì)于每個(gè)去糖基化的n-連接位點(diǎn)，一個(gè)n-乙酰己糖胺仍然在該蛋白質(zhì)主鏈上。在第五方面中，本發(fā)明涉及包含一種或多種具有蛋白酶活性的多肽的動(dòng)物飼料或動(dòng)物飼料添加劑，其中該多肽與seqidno:11的成熟多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，這些多肽與seqidno:11的成熟多肽相差多達(dá)50個(gè)氨基酸，例如1和50個(gè)氨基酸之間，例如1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10或1-5個(gè)氨基酸，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個(gè)氨基酸。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽包括一個(gè)或多個(gè)基序vcg[e/q]kvgqp(seqidno:15)。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽已經(jīng)被分離。動(dòng)物飼料或動(dòng)物飼料添加劑優(yōu)選地包括seqidno:11的氨基酸序列或其等位基因變體或由它們組成；是一個(gè)從n-末端或c-末端缺失例如30、26、22、18、13、11、8或5個(gè)氨基酸并且具有蛋白酶活性的片段，或者是一個(gè)具有蛋白酶活性的片段，其中該片段包括至少174個(gè)氨基酸，例如至少178個(gè)氨基酸、至少182個(gè)氨基酸、至少186個(gè)氨基酸、至少191個(gè)氨基酸、至少196個(gè)氨基酸或至少201個(gè)氨基酸。在另一個(gè)實(shí)施例中，該動(dòng)物飼料或動(dòng)物飼料添加劑包含seqidno:11的成熟多肽或由其組成。在另一個(gè)實(shí)施例中，該動(dòng)物飼料或動(dòng)物飼料添加劑包含seqidno:11的氨基酸1至204或由其組成。在第五方面的延續(xù)中，本發(fā)明涉及包含一種或多種具有蛋白酶活性的多肽的動(dòng)物飼料或動(dòng)物飼料添加劑，其中該多肽與seqidno:14具有至少65％序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽與seqidno:14具有至少70％序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽與seqidno:14具有至少75％序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽與seqidno:14具有至少80％序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽與seqidno:14具有至少81％序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽與seqidno:14具有至少82％序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽與seqidno:14具有至少83％序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽與seqidno:14具有至少84％序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽與seqidno:14具有至少85％序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽與seqidno:14具有至少86％序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽與seqidno:14具有至少87％序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽與seqidno:14具有至少88％序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽與seqidno:14具有至少89％序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽與seqidno:14具有至少90％序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽與seqidno:14具有至少91％序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽與seqidno:14具有至少92％序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽與seqidno:14具有至少93％序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽與seqidno:14具有至少94％序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽與seqidno:14具有至少95％序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽與seqidno:14具有至少96％序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽與seqidno:14具有至少97％序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽與seqidno:14具有至少98％序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽與seqidno:14具有至少99％序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽包括一個(gè)或多個(gè)基序vcg[e/q]kvgqp(seqidno:15)。在第五方面的延續(xù)中，這些多肽與seqidno:14相差多達(dá)50個(gè)氨基酸，例如1和50個(gè)氨基酸之間，例如1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10或1-5個(gè)氨基酸，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個(gè)氨基酸。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽包括一個(gè)或多個(gè)基序vcg[e/q]kvgqp(seqidno:15)。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽已經(jīng)被分離。動(dòng)物飼料或動(dòng)物飼料添加劑優(yōu)選地包括seqidno:14的氨基酸序列或其等位基因變體或由它們組成；是一個(gè)從n-末端或c-末端缺失例如30、26、22、18、13、11、8或5個(gè)氨基酸并且具有蛋白酶活性的片段，或者是一個(gè)具有蛋白酶活性的片段，其中該片段包括至少174個(gè)氨基酸，例如至少178個(gè)氨基酸、至少182個(gè)氨基酸、至少186個(gè)氨基酸、至少191個(gè)氨基酸、至少196個(gè)氨基酸或至少201個(gè)氨基酸。在另一個(gè)實(shí)施例中，該動(dòng)物飼料或動(dòng)物飼料添加劑包含seqidno:14或由其組成。在另一個(gè)實(shí)施例中，該動(dòng)物飼料或動(dòng)物飼料添加劑包含seqidno:14的氨基酸1至204或由其組成。在第五方面的延續(xù)中，本發(fā)明涉及包含一種或多種具有蛋白酶活性的多肽的動(dòng)物飼料或動(dòng)物飼料添加劑，這些多肽由以下多核苷酸編碼，該多核苷酸在低嚴(yán)格條件、中嚴(yán)格條件、中-高嚴(yán)格條件、高嚴(yán)格條件、或非常高嚴(yán)格條件下與以下各項(xiàng)雜交：(i)seqidno:10的成熟多肽編碼序列，(ii)seqidno:12的成熟多肽編碼序列，或者(iii)(i)或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)體(薩姆布魯克(sambrook)等人，1989，見上文)。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽已經(jīng)被分離。在第五方面的延續(xù)中，本發(fā)明涉及包含一種或多種具有蛋白酶活性的多肽的動(dòng)物飼料或動(dòng)物飼料添加劑，這些多肽由以下多核苷酸編碼，該多核苷酸與seqidno:10的成熟多肽編碼序列具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。在另外的實(shí)施例中，該多肽已經(jīng)被分離。在第五方面的延續(xù)中，本發(fā)明涉及包含一種或多種具有蛋白酶活性的多肽的動(dòng)物飼料或動(dòng)物飼料添加劑，這些多肽由以下多核苷酸編碼，該多核苷酸與seqidno:12的成熟多肽編碼序列具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。在另外的實(shí)施例中，該多肽已經(jīng)被分離。在第五方面的延續(xù)中，本發(fā)明涉及包含seqidno:14的一個(gè)或多個(gè)變體的動(dòng)物飼料或動(dòng)物飼料添加劑，其中該變體具有蛋白酶活性并且在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個(gè)位置中包含一個(gè)或多個(gè)取代、和/或缺失、和/或插入或其任何組合。在一個(gè)實(shí)施例中，包括在seqidno:14中的取代和/或缺失和/或插入或其任何組合的位置的數(shù)目在1和50之間，例如1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10或1-5個(gè)位置。在一個(gè)實(shí)施例中，包括在seqidno:14中的取代和/或缺失和/或插入或其任何組合的位置的數(shù)目不超過10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)。在另一個(gè)實(shí)施例中，在seqidno:14中的取代和/或缺失和/或插入的數(shù)目不超過10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)。在另一個(gè)實(shí)施例中，在seqidno:14中的取代的數(shù)目不超過10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽包括一個(gè)或多個(gè)基序vcg[e/q]kvgqp(seqidno:15)。在本發(fā)明的第四方面中描述了氨基酸變化、保守取代和融合肽的實(shí)例。在第六方面中，本發(fā)明涉及包含一種或多種具有蛋白酶活性的多肽的動(dòng)物飼料或動(dòng)物飼料添加劑，其中該多肽與seqidno:17的成熟多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99、％或100％序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，這些多肽與seqidno:17的成熟多肽相差多達(dá)50個(gè)氨基酸，例如1和50個(gè)氨基酸之間，例如1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10或1-5個(gè)氨基酸，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個(gè)氨基酸。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽包括一個(gè)或多個(gè)基序vcg[e/q]kvgqp(seqidno:15)。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽已經(jīng)被分離。動(dòng)物飼料或動(dòng)物飼料添加劑優(yōu)選地包括seqidno:17的氨基酸序列或其等位基因變體或由它們組成；是一個(gè)從n-末端或c-末端缺失例如30、26、22、18、13、11、8或5個(gè)氨基酸并且具有蛋白酶活性的片段，或者是一個(gè)具有蛋白酶活性的片段，其中該片段包括至少174個(gè)氨基酸，例如至少178個(gè)氨基酸、至少182個(gè)氨基酸、至少186個(gè)氨基酸、至少191個(gè)氨基酸、至少196個(gè)氨基酸或至少201個(gè)氨基酸。在另一個(gè)實(shí)施例中，該動(dòng)物飼料或動(dòng)物飼料添加劑包含seqidno:17的成熟多肽或由其組成。在另一個(gè)實(shí)施例中，該動(dòng)物飼料或動(dòng)物飼料添加劑包含seqidno:17的氨基酸1至204或由其組成。在第六方面的延續(xù)中，本發(fā)明涉及包含一種或多種具有蛋白酶活性的多肽的動(dòng)物飼料或動(dòng)物飼料添加劑，其中該多肽與seqidno:20具有至少65％序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽與seqidno:20具有至少70％序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽與seqidno:20具有至少75％序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽與seqidno:20具有至少80％序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽與seqidno:20具有至少81％序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽與seqidno:20具有至少82％序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽與seqidno:20具有至少83％序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽與seqidno:20具有至少84％序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽與seqidno:20具有至少85％序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽與seqidno:20具有至少86％序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽與seqidno:20具有至少87％序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽與seqidno:20具有至少88％序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽與seqidno:20具有至少89％序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽與seqidno:20具有至少90％序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽與seqidno:20具有至少91％序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽與seqidno:20具有至少92％序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽與seqidno:20具有至少93％序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽與seqidno:20具有至少94％序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽與seqidno:20具有至少95％序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽與seqidno:20具有至少96％序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽與seqidno:20具有至少97％序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽與seqidno:20具有至少98％序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽與seqidno:20具有至少99％序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽包括一個(gè)或多個(gè)基序vcg[e/q]kvgqp(seqidno:15)。在第六方面的延續(xù)中，這些多肽與seqidno:20相差多達(dá)50個(gè)氨基酸，例如1和50個(gè)氨基酸之間，例如1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10或1-5個(gè)氨基酸，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個(gè)氨基酸。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽包括一個(gè)或多個(gè)基序vcg[e/q]kvgqp(seqidno:15)。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽已經(jīng)被分離。動(dòng)物飼料或動(dòng)物飼料添加劑優(yōu)選地包括seqidno:20的氨基酸序列或其等位基因變體或由它們組成；是一個(gè)從n-末端或c-末端缺失例如30、26、22、18、13、11、8或5個(gè)氨基酸并且具有蛋白酶活性的片段，或者是一個(gè)具有蛋白酶活性的片段，其中該片段包括至少174個(gè)氨基酸，例如至少178個(gè)氨基酸、至少182個(gè)氨基酸、至少186個(gè)氨基酸、至少191個(gè)氨基酸、至少196個(gè)氨基酸或至少201個(gè)氨基酸。在另一個(gè)實(shí)施例中，該動(dòng)物飼料或動(dòng)物飼料添加劑包含seqidno:20或由其組成。在另一個(gè)實(shí)施例中，該動(dòng)物飼料或動(dòng)物飼料添加劑包含seqidno:20的氨基酸1至204或由其組成。在第六方面的延續(xù)中，本發(fā)明涉及包含一種或多種具有蛋白酶活性的多肽的動(dòng)物飼料或動(dòng)物飼料添加劑，這些多肽由以下多核苷酸編碼，該多核苷酸在低嚴(yán)格條件、中嚴(yán)格條件、中-高嚴(yán)格條件、高嚴(yán)格條件、或非常高嚴(yán)格條件下與以下各項(xiàng)雜交：(i)seqidno:16的成熟多肽編碼序列，或(ii)(i)的全長(zhǎng)互補(bǔ)體(薩姆布魯克(sambrook)等人，1989，見上文)。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽已經(jīng)被分離。在第六方面的延續(xù)中，本發(fā)明涉及包含一種或多種具有蛋白酶活性的多肽的動(dòng)物飼料或動(dòng)物飼料添加劑，這些多肽由以下多核苷酸編碼，該多核苷酸與seqidno:16的成熟多肽編碼序列具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。在另外的實(shí)施例中，該多肽已經(jīng)被分離。在第六方面的延續(xù)中，本發(fā)明涉及包含seqidno:20的一個(gè)或多個(gè)變體的動(dòng)物飼料或動(dòng)物飼料添加劑，其中該變體具有蛋白酶活性并且在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個(gè)位置中包含一個(gè)或多個(gè)取代、和/或缺失、和/或插入或其任何組合。在一個(gè)實(shí)施例中，包括在seqidno:20中的取代和/或缺失和/或插入或其任何組合的位置的數(shù)目在1和50之間，例如1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10或1-5個(gè)位置。在一個(gè)實(shí)施例中，包括在seqidno:20中的取代和/或缺失和/或插入或其任何組合的位置的數(shù)目不超過10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)。在另一個(gè)實(shí)施例中，在seqidno:20中的取代和/或缺失和/或插入的數(shù)目不超過10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)。在另一個(gè)實(shí)施例中，在seqidno:20中的取代的數(shù)目不超過10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)。在一個(gè)實(shí)施例中，該多肽包括一個(gè)或多個(gè)基序vcg[e/q]kvgqp(seqidno:15)。在本發(fā)明的第四方面中描述了氨基酸變化、保守取代和融合肽的實(shí)例。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，本發(fā)明的第四、第五和第六方面的多肽還包括本發(fā)明的第一方面的特性。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，本發(fā)明的第四、第五和第六方面的多肽還包括本發(fā)明的第二方面的特性。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，本發(fā)明的第四、第五和第六方面的多肽還包括本發(fā)明的第三方面的特性。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，本發(fā)明的第四、第五和第六方面的多肽還包括本發(fā)明的第一和第二方面的特性。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，本發(fā)明的第四、第五和第六方面的多肽還包括本發(fā)明的第一和第三方面的特性。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，本發(fā)明的第四、第五和第六方面的多肽還包括本發(fā)明的第二和第三方面的特性。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，本發(fā)明的第四、第五和第六方面的多肽還包括本發(fā)明的第一、第二和第三方面的特性。特性酸度/堿度特性在本發(fā)明的某些實(shí)施例中，就ph而言，本發(fā)明的蛋白酶展現(xiàn)了有益的特性，例如酸穩(wěn)定性和最適ph。廣泛的生理ph(例如，從4-7)上的活性覆蓋上胃腸道(嗉囊ph4-6；豬體內(nèi)的胃ph有時(shí)高達(dá)ph5-6)連同小腸(ph6-7)兩者。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例是與蛋白酶10r相比，在40℃下在ph3與7之間，例如在ph3.0、ph4.0、ph5.0、ph6.0和/或ph7.0下具有改進(jìn)的蛋白酶活性的分離的多肽。溫度-活性可如在實(shí)例3中所述的確定該蛋白酶的溫度-活性曲線。在低溫度(37℃-50℃)下的活性對(duì)于在動(dòng)物中蛋白的消化可以是有利的。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明包含一種蛋白酶，當(dāng)與在60℃下的蛋白酶的活性(比較實(shí)例3)相比時(shí)，該蛋白酶具有在37℃下0.10或更高的相對(duì)活性、在50℃下0.40或更高的相對(duì)活性、或在60℃下0.80或更高的相對(duì)活性的ph7.0下的溫度活性曲線。本發(fā)明的一個(gè)另外的實(shí)施例是與ph6.5下的蛋白酶10r相比，在ph7.0，例如60℃或以下，如50℃或以下、37℃或以下、或37℃與60℃之間、或50℃與60℃之間或在37℃下、或在50℃下或在60℃下具有改進(jìn)的蛋白酶活性的分離的多肽。熱穩(wěn)定性可如在實(shí)例5中所述的確定熱穩(wěn)定性，即使用dsc測(cè)量來確定經(jīng)純化的蛋白酶蛋白的變性溫度(td)。td指示了該蛋白的熱穩(wěn)定性：td越高，熱穩(wěn)定性越高。因此，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，本發(fā)明的蛋白酶具有一個(gè)td，該td高于參照蛋白酶的td，其中td是對(duì)經(jīng)純化的蛋白酶樣品(優(yōu)選地具有至少90％或95％的純度，如通過sds-page確定的)確定的。在優(yōu)選的實(shí)施例中，如通過殘余活性、變性溫度td所提供的這些熱特性(例如加熱穩(wěn)定性、溫度穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性、蒸汽穩(wěn)定性、和/或造粒穩(wěn)定性)或本發(fā)明的蛋白酶的其他參數(shù)高于相應(yīng)的值(如seqidno:5和/或seqidno:14的蛋白酶的殘余活性或td)，更優(yōu)選地是它的至少101％，或者它的至少102％、103％、104％、105％、106％、107％、108％、109％、或者至少110％。甚至更優(yōu)選地，本發(fā)明的蛋白酶的參數(shù)(如殘余活性或td)的值是seqidno:5和/或seqidno:14和/或seqidno:20的蛋白酶的值的至少120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、或至少190％。在仍另外的具體實(shí)施例中，本發(fā)明的熱穩(wěn)定的蛋白酶具有至少50℃的熔化溫度tm(或變性溫度td)，如通過在實(shí)例5(即在20mm乙酸鈉，ph值4.0)中所述的差示掃描量熱法(dsc)所確定的。在仍另外的具體實(shí)施例中，該tm是至少51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃或至少100℃。蒸汽穩(wěn)定性蒸汽穩(wěn)定性可以如在實(shí)例6中所述的，通過確定在85℃或90℃下蒸汽處理一個(gè)短的時(shí)間之后蛋白酶分子的殘余活性來確定。造粒穩(wěn)定性造粒穩(wěn)定性可如在實(shí)例7中所述的，通過使用與飼料預(yù)混合的酶顆粒來確定。由該混合器用蒸汽將該飼料調(diào)節(jié)至95℃。在調(diào)節(jié)之后，將該飼料加壓成丸并確定殘余活性。具有蛋白酶活性的多肽的來源可以從任何屬的微生物獲得根據(jù)本發(fā)明的具有蛋白酶活性的多肽。出于本發(fā)明的目的，如在此與給出的來源結(jié)合使用，術(shù)語(yǔ)“從…獲得”應(yīng)當(dāng)意指由多核苷酸編碼的多肽是由該來源或由其中已經(jīng)插入來自該來源的多核苷酸的菌株產(chǎn)生的。在一方面中，從給定來源獲得的多肽分泌至細(xì)胞外。該多肽可以是細(xì)菌多肽。例如，該多肽可以是具有蛋白酶活性的、來自如放線菌門內(nèi)的一種革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌或來自如變形菌門內(nèi)的一種革蘭氏陰性細(xì)菌的多肽。在一方面中，該多肽是來自放線菌綱的細(xì)菌的蛋白酶，例如來自微球菌目，或來自間孢囊菌科，或來自兩面神菌、土壤球菌屬(terracoccus)或諾爾氏菌屬(knoellia)。這些分類單位的菌株在許多培養(yǎng)物保藏中心對(duì)于公眾來說是容易獲得的，這些保藏中心如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(atcc)、德意志微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(dsm)、真菌菌種保藏中心(cbs)、以及農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)專利培養(yǎng)物保藏中心北區(qū)研究中心(nrrl)?？梢允褂蒙鲜鎏结?，從其他來源包括從自然界(例如，土壤、堆肥、水，等等)分離的微生物鑒定并獲得該多肽。用于從天然生境(habitat)分離微生物的技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)公知的。隨后可以通過類似地篩選另一種微生物的基因組或cdna文庫(kù)或混合dna樣品獲得編碼該多肽的多核苷酸。一旦用這種或這些探針檢測(cè)到編碼一種多肽的多核苷酸，就可以通過使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員眾所周知的的技術(shù)分離或克隆該多核苷酸(參見，例如，薩姆布魯克(sambrook)等人，1989，見上文)。多核苷酸本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸，如在此所述。在一個(gè)實(shí)施例中，編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸已經(jīng)被分離。用于分離或克隆多核苷酸的技術(shù)是本領(lǐng)域中已知的并且包括從基因組dna或cdna、或其組合進(jìn)行分離?？梢岳缤ㄟ^使用熟知的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)或表達(dá)文庫(kù)的抗體篩選來檢測(cè)具有共有結(jié)構(gòu)特征的克隆dna片段，實(shí)現(xiàn)從基因組dna克隆多核苷酸。參見例如，伊尼斯(innis)等人，1990，pcr：方法和應(yīng)用指南(pcr:aguidetomethodsandapplication)，學(xué)術(shù)出版社(academicpress)，紐約?？梢允褂闷渌怂釘U(kuò)增程序例如連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(lcr)、連接激活轉(zhuǎn)錄(lat)和基于多核苷酸的擴(kuò)增(nasba)?？梢詮膬擅嫔窬?、土壤球菌屬(terracoccus)或諾爾氏菌屬(knoellia)的菌株或來自微球菌屬的相關(guān)生物中克隆多核苷酸，并且因此，例如可以是多核苷酸的多肽編碼區(qū)的等位基因變體或物種變體。核酸構(gòu)建體本發(fā)明還涉及包含與一個(gè)或多個(gè)控制序列可操作地連接的本發(fā)明多核苷酸的核酸構(gòu)建體，其中所述控制序列指導(dǎo)編碼序列在適合的宿主細(xì)胞中在與所述控制序列相容的條件下的表達(dá)?？梢杂迷S多方式操作所述多核苷酸以便于多肽的表達(dá)。取決于表達(dá)載體，在多核苷酸插入載體之前對(duì)其進(jìn)行操縱可以是令人希望的或必需的。用于利用重組dna方法修飾多核苷酸的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。該控制序列可以是啟動(dòng)子，即，被宿主細(xì)胞識(shí)別以對(duì)編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸進(jìn)行表達(dá)的多核苷酸。啟動(dòng)子包含介導(dǎo)多肽表達(dá)的轉(zhuǎn)錄控制序列。啟動(dòng)子可以是在宿主細(xì)胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何多核苷酸，包括突變、截短和雜合啟動(dòng)子，并且可以從編碼與宿主細(xì)胞同源或異源的胞外或胞內(nèi)多肽的基因中獲得。用于在細(xì)菌宿主細(xì)胞中指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄的適合啟動(dòng)子的實(shí)例是從以下基因中獲得的啟動(dòng)子：解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyq)、地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyl)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(penp)、嗜熱脂肪芽孢桿菌產(chǎn)麥芽糖淀粉酶基因(amym)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因(sacb)、枯草芽孢桿菌xyla和xylb基因、蘇云金芽孢桿菌cryiiia基因(阿蓋塞(agaisse)和勒爾克呂(lereclus)，1994，分子微生物學(xué)(molecularmicrobiology)13:97-107)、大腸桿菌lac操縱子、大腸桿菌trc啟動(dòng)子(埃貢(egon)等人，1988，基因(gene)69:301-315)、天藍(lán)鏈霉菌瓊脂水解酶基因(daga)、以及原核β-內(nèi)酰胺酶基因(維拉-卡馬洛夫(villa-kamaroff)等人，1978，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(proc.natl.acad.sci.usa)75:3727-3731)以及tac啟動(dòng)子(德波爾(deboer)等人，1983，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊80:21-25)。其他啟動(dòng)子描述在吉爾伯特(gilbert)等人，1980，科學(xué)美國(guó)人(scientificamerican)242:74-94的“來自重組細(xì)菌的有用蛋白質(zhì)(usefulproteinsfromrecombinantbacteria)”；以及在薩姆布魯克(sambrook)等人，1989，同上。串聯(lián)啟動(dòng)子的實(shí)例披露在wo99/43835中。在絲狀真菌宿主細(xì)胞中，用于指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄的合適啟動(dòng)子的實(shí)例是獲得自以下各項(xiàng)的基因的啟動(dòng)子：構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡萄糖淀粉酶(glaa)、米曲霉taka淀粉酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶、尖鐮孢胰蛋白酶–樣蛋白酶(wo96/00787)、鑲片鐮孢菌淀粉葡糖苷酶(wo00/56900)、鑲片鐮孢菌daria(達(dá)莉亞)(wo00/56900)、鑲片鐮孢菌quinn(奎恩)(wo00/56900)、米黑根毛霉脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纖維二糖水解酶i、里氏木霉纖維二糖水解酶ii、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶i、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶ii、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶iii、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶v、里氏木霉木聚糖酶i、里氏木霉木聚糖酶ii、里氏木霉木聚糖酶iii、里氏木霉β-木糖苷酶，以及里氏木霉翻譯延伸因子，連同na2-tpi啟動(dòng)子(來自編碼中性α-淀粉酶的曲霉屬基因的修飾的啟動(dòng)子，其中已經(jīng)用來自編碼丙糖磷酸異構(gòu)酶的曲霉屬基因的未翻譯的前導(dǎo)子替換未翻譯的前導(dǎo)子；非限制性實(shí)例包括來自編碼中性α-淀粉酶的黑曲霉基因的修飾的啟動(dòng)子，其中已經(jīng)用來自編碼丙糖磷酸異構(gòu)酶的構(gòu)巢曲霉或米曲霉基因的未翻譯的前導(dǎo)子替換未翻譯的前導(dǎo)子)；及其突變型、截短型及雜合型啟動(dòng)子。其他啟動(dòng)子在美國(guó)專利號(hào)6,011,147中描述。在酵母宿主中，從針對(duì)以下各項(xiàng)的基因獲得有用的啟動(dòng)子：釀酒酵母烯醇酶(eno-1)、釀酒酵母半乳糖激酶(gal1)、釀酒酵母乙醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(adh1，adh2/gap)、釀酒酵母磷酸丙糖異構(gòu)酶(tpi)、釀酒酵母金屬硫蛋白(cup1)、和釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。在羅馬諾斯(romanos)等人，1992，酵母(yeast)8:423-488中描述了酵母宿主細(xì)胞的其他有用啟動(dòng)子。控制序列也可以是由宿主細(xì)胞識(shí)別以終止轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄終止子。終止子與編碼該多肽的多核苷酸的3’-末端可操作地連接。在宿主細(xì)胞中有功能的任何終止子可以用于本發(fā)明中。細(xì)菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選終止子從針對(duì)以下各項(xiàng)的基因獲得：克勞氏芽孢桿菌堿性蛋白酶(aprh)、地衣芽孢桿菌α-淀粉酶(amyl)、和大腸桿菌核糖體rna(rrnb)。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選終止子是從以下各項(xiàng)的基因獲得：構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉taka淀粉酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纖維二糖水解酶i、里氏木霉纖維二糖水解酶ii、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶i、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶ii、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶iii、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶v、里氏木霉木聚糖酶i、里氏木霉木聚糖酶ii、里氏木霉木聚糖酶iii、里氏木霉β-木糖苷酶以及里氏木霉翻譯延長(zhǎng)因子。用于酵母宿主細(xì)胞的優(yōu)選終止子從以下各項(xiàng)的基因獲得：釀酒酵母烯醇酶、釀酒酵母細(xì)胞色素c(cyc1)、以及釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶。在羅馬諾斯(romanos)等人，1992，上文中描述了酵母宿主細(xì)胞的其他有用終止子。該控制序列還可以是在啟動(dòng)子下游并且在基因編碼序列上游的mrna穩(wěn)定子區(qū)域，它增加該基因的表達(dá)。適合的mrna穩(wěn)定子區(qū)的實(shí)例是從以下獲得的：蘇云金桿菌cryiiia基因(wo94/25612)和枯草芽孢桿菌sp82基因(化(hue)等人，1995，細(xì)菌學(xué)雜志(journalofbacteriology)177:3465-3471)。該控制序列也可以是前導(dǎo)子，該前導(dǎo)子是對(duì)宿主細(xì)胞翻譯重要的mrna的非翻譯區(qū)。該前導(dǎo)子與編碼該多肽的多核苷酸的5’-末端可操作地連接。可以使用在宿主細(xì)胞中有功能的任何前導(dǎo)子。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選前導(dǎo)子是從米曲霉taka淀粉酶和構(gòu)巢曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶的基因獲得。從釀酒酵母烯醇化酶(eno-1)、釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、釀酒酵母醹-因子和釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(adh2/gap)的基因獲得用于酵母宿主細(xì)胞的合適的前導(dǎo)子?？刂菩蛄幸部梢允嵌嗑巯佘栈蛄?，一種與多核苷酸3’-末端可操作地連接并在轉(zhuǎn)錄時(shí)由宿主細(xì)胞識(shí)別為向轉(zhuǎn)錄的mrna添加聚腺苷酸殘基的信號(hào)序列?？梢允褂迷谒拗骷?xì)胞中起作用的任何聚腺苷酸化序列。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選聚腺苷酸化序列是從以下各項(xiàng)的基因中獲得的：構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合成酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉taka淀粉酶以及尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶。對(duì)于酵母宿主細(xì)胞有用的聚腺苷酸化序列在郭(guo)和謝爾曼(sherman)，1995，分子細(xì)胞生物學(xué)(mol.cellularbiol.)15:5983-5990中得以描述?？刂菩蛄幸部梢允蔷幋a與多肽的n-末端連接并指導(dǎo)多肽進(jìn)入細(xì)胞的分泌通路的信號(hào)肽的信號(hào)肽編碼區(qū)。多核苷酸的編碼序列的5’-端可以固有地包含在翻譯閱讀框中與編碼多肽的編碼序列的區(qū)段天然地連接的信號(hào)肽編碼序列?？商娲兀幋a序列的5’-末端可以包含相對(duì)于編碼序列為外來的信號(hào)肽編碼序列。在編碼序列不天然地包含信號(hào)肽編碼序列的情況下，可能需要外來信號(hào)肽編碼序列?？商娲?，外來信號(hào)肽編碼序列可以單純地替代天然信號(hào)肽編碼序列以便增強(qiáng)多肽的分泌。然而，可以使用指導(dǎo)已表達(dá)多肽進(jìn)入宿主細(xì)胞的分泌途徑的任何信號(hào)肽編碼序列。用于細(xì)菌宿主細(xì)胞的有效信號(hào)肽編碼序列是從芽孢桿菌ncib11837生麥芽糖淀粉酶、地衣芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶、地衣芽孢桿菌鈣-內(nèi)酰胺酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌醹-淀粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶(nprt、nprs、nprm)和枯草芽孢桿菌prsa的基因獲得的信號(hào)肽編碼序列。其他信號(hào)序列由西莫寧(simonen)和帕爾瓦(palva)，1993，微生物評(píng)論(microbiologicalreviews)57:109-137描述。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的有效信號(hào)肽編碼序列是從黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉taka淀粉酶、特異腐質(zhì)霉纖維素酶、特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶v、柔毛腐質(zhì)霉脂肪酶和米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶的基因獲得的信號(hào)肽編碼序列。從釀酒酵母α-因子和釀酒酵母轉(zhuǎn)化酶的基因獲得用于酵母宿主細(xì)胞的有用信號(hào)肽。其他的有用的信號(hào)肽編碼序列由羅曼諾斯(romanos)等人(1992，上文)描述。控制序列也可以是編碼位于多肽n-末端處的前肽的前肽編碼序列。生成的多肽被稱為前體酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情況下被稱為酶原(zymogen))。多肽原通常是無活性的并且可以通過催化切割或自身催化切割來自多肽原的前肽而轉(zhuǎn)化為活性多肽。前肽編碼序列可以從以下各項(xiàng)的基因獲得：枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶(apre)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(nprt)、嗜熱毀絲霉漆酶(wo95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及釀酒酵母α-因子。在信號(hào)肽序列和前肽序列二者都存在的情況下，該前肽序列定位成緊鄰多肽的n-末端并且該信號(hào)肽序列定位成緊鄰該前肽序列的n-末端。也可能令人希望的是添加調(diào)節(jié)序列，所述調(diào)節(jié)序列調(diào)節(jié)相對(duì)于宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)的多肽的表達(dá)。調(diào)節(jié)序列的實(shí)例是使得基因的表達(dá)響應(yīng)于化學(xué)或物理刺激(包括調(diào)節(jié)化合物的存在)而開啟或關(guān)閉的那些。原核系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)序列包括lac、tac以及trp操縱子系統(tǒng)。在酵母中，可以使用adh2系統(tǒng)或gal1系統(tǒng)。在絲狀真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶啟動(dòng)子、米曲霉takaα-淀粉酶啟動(dòng)子和米曲霉葡糖淀粉酶啟動(dòng)子、里氏木霉纖維二糖水解酶i啟動(dòng)子以及里氏木霉纖維二糖水解酶ii啟動(dòng)子。調(diào)節(jié)序列的其他實(shí)例是那些允許基因擴(kuò)增的序列。在真核系統(tǒng)中，這些調(diào)控序列包括在甲氨蝶呤存在下被擴(kuò)增的二氫葉酸還原酶基因以及用重金屬擴(kuò)增的金屬硫蛋白基因。在這些情況中，編碼多肽的多核苷酸將與調(diào)控序列可操作地連接。表達(dá)載體本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的多核苷酸、啟動(dòng)子、以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號(hào)的重組表達(dá)載體。不同的核苷酸和控制序列可以連接在一起以產(chǎn)生重組表達(dá)載體，該重組表達(dá)載體可以包括一個(gè)或多個(gè)便利的限制酶切位點(diǎn)以允許在這些位點(diǎn)處插入或取代編碼該多肽的多核苷酸?？商娲?，該多核苷酸可以通過將該多核苷酸或包括該多核苷酸的核酸構(gòu)建體插入用于表達(dá)的適當(dāng)載體中來表達(dá)。在產(chǎn)生該表達(dá)載體時(shí)，該編碼序列位于該載體中，這樣使得該編碼序列與該供表達(dá)的適當(dāng)控制序列可操作地連接。重組表達(dá)載體可以是可便利地經(jīng)受重組dna程序并且可引起多核苷酸表達(dá)的任何載體(例如，質(zhì)?；虿《?。載體的選擇將典型地取決于該載體與有待引入該載體的宿主細(xì)胞的相容性。該載體可以是線性的或閉合的環(huán)狀質(zhì)粒。該載體可以是自主復(fù)制載體，即，作為染色體外實(shí)體存在的載體，其復(fù)制獨(dú)立于染色體復(fù)制，例如，質(zhì)粒、染色體外元件、微染色體或人工染色體。該載體可包含任何用以保證自我復(fù)制的要素。可替代地，該載體可以是這樣載體，當(dāng)它被引入該宿主細(xì)胞中時(shí)，被整合到基因組中并且與其中已整合了它的一個(gè)或多個(gè)染色體一起復(fù)制。此外，可以使用單一載體或質(zhì)粒或兩個(gè)或更多個(gè)載體或質(zhì)粒(這些載體或質(zhì)粒共同包包含待引入到宿主細(xì)胞的基因組中的總dna)或轉(zhuǎn)座子。該載體優(yōu)選包含一個(gè)或多個(gè)允許方便地選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞、轉(zhuǎn)染細(xì)胞、轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞等細(xì)胞的選擇性標(biāo)記。選擇性標(biāo)記是這樣一種基因，該基因的產(chǎn)物提供了殺生物劑抗性或病毒抗性、重金屬抗性、營(yíng)養(yǎng)缺陷型的原養(yǎng)型等。細(xì)菌性選擇性標(biāo)記的實(shí)例是地衣芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌dal基因，或賦予抗生素抗性(如氨比西林、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大觀霉素或四環(huán)素抗性)的標(biāo)記。用于酵母宿主細(xì)胞的適合的標(biāo)記包括但不局限于ade2、his3、leu2、lys2、met3、trp1、以及ura3。用于在絲狀真菌宿主細(xì)胞中使用的選擇性標(biāo)記包括但不限于，adea(磷酸核糖酰氨基咪唑-琥珀羧胺合酶)、adeb(磷酸核糖酰-氨基咪唑合酶)、amds(乙酰胺酶)、argb(鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶)、bar(草丁膦乙酰轉(zhuǎn)移酶)、hph(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)、niad(硝酸還原酶)、pyrg(乳清酸核苷-5’-磷酸脫羧酶)、sc(硫酸腺苷基轉(zhuǎn)移酶)、以及trpc(鄰氨基苯甲酸合酶)、連同其等效物。優(yōu)選地用于曲霉細(xì)胞中的是構(gòu)巢曲霉或米曲霉amds和pyrg基因以及吸水鏈霉菌bar基因。在木霉屬細(xì)胞中優(yōu)選使用的是adea、adeb、amds、hph以及pyrg基因。選擇性標(biāo)記可以是如在wo2010/039889中描述的雙選擇性標(biāo)記系統(tǒng)。在一方面中，雙選擇性標(biāo)記是hph-tk雙選擇性標(biāo)記系統(tǒng)。載體優(yōu)選包含允許載體整合到宿主細(xì)胞的基因組中或載體在細(xì)胞中獨(dú)立于基因組自主復(fù)制的一個(gè)或多個(gè)元件。對(duì)于整合到該宿主細(xì)胞基因組中，該載體可以依靠編碼該多肽的多核苷酸序列或者用于通過同源或非同源重組整合到該基因組中的該載體的任何其他元件。可替代地，該載體可以包含用于指導(dǎo)通過同源重組而整合到宿主細(xì)胞基因組中的一個(gè)或多個(gè)染色體中的一個(gè)或多個(gè)精確位置的另外的多核苷酸。為了增加在精確位置整合的可能性，這些整合元件應(yīng)包含足夠數(shù)量的核酸，例如100至10,000個(gè)堿基對(duì)、400至10,000個(gè)堿基對(duì)、以及800至10,000個(gè)堿基對(duì)，這些堿基對(duì)與對(duì)應(yīng)的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重組的可能性。這些整合元件可以是與宿主細(xì)胞的基因組中的靶序列同源的任何序列。此外，這些整合元件可以是非編碼多核苷酸或編碼多核苷酸。在另一方面，該載體可以通過非同源重組整合到宿主細(xì)胞的基因組中。對(duì)于自主復(fù)制，該載體可以進(jìn)一步包括使該載體能夠在所討論的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制的復(fù)制起點(diǎn)。復(fù)制起點(diǎn)可以是在細(xì)胞中起作用的介導(dǎo)自主復(fù)制的任何質(zhì)粒復(fù)制子。術(shù)語(yǔ)“復(fù)制起點(diǎn)”或“質(zhì)粒復(fù)制子”意指使質(zhì)粒或載體能夠在體內(nèi)復(fù)制的多核苷酸。細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是允許在大腸桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒pbr322、puc19、pacyc177、以及pacyc184的復(fù)制起點(diǎn)，以及允許在芽孢桿菌屬中復(fù)制的質(zhì)粒pub110、pe194、pta1060、以及pamβ1的復(fù)制起點(diǎn)。用于酵母宿主細(xì)胞中的復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是2微米復(fù)制起點(diǎn)、ars1、ars4、ars1和cen3的組合、以及ars4和cen6的組合。在絲狀真菌細(xì)胞中有用的復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是ama1和ans1(格姆斯(gems)等人，1991，基因(gene)98:61-67；卡倫(cullen)等人，1987，核酸研究(nucleicacidsres.)15:9163-9175；wo00/24883)?？梢愿鶕?jù)wo00/24883中披露的方法完成ama1基因的分離和包含該基因的質(zhì)?；蜉d體的構(gòu)建?？梢詫⒈景l(fā)明多核苷酸的一個(gè)以上的拷貝插入宿主細(xì)胞以增加多肽的產(chǎn)生。通過將序列的至少一個(gè)另外的拷貝整合到宿主細(xì)胞基因組中或者通過包含與該多核苷酸一起的可擴(kuò)增的選擇性標(biāo)記基因可以獲得多核苷酸的增加的拷貝數(shù)目，其中通過在適當(dāng)?shù)倪x擇性試劑的存在下培養(yǎng)細(xì)胞可以選擇包含選擇性標(biāo)記基因的經(jīng)擴(kuò)增的拷貝的細(xì)胞、以及由此該多核苷酸的另外的拷貝。用于連接以上所描述的元件以構(gòu)建本發(fā)明的重組表達(dá)載體的程序是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員熟知的(參見，例如，薩姆布魯克(sambrook)等人，1989，同上)。宿主細(xì)胞本發(fā)明還涉及重組宿主細(xì)胞，這些宿主細(xì)胞包含可操作地連接到一個(gè)或多個(gè)控制序列的本發(fā)明的多核苷酸，這些控制序列指導(dǎo)本發(fā)明的多肽的產(chǎn)生。將包括多核苷酸的構(gòu)建體或載體引入宿主細(xì)胞中，這樣使得該構(gòu)建體或載體被維持作為染色體整合體或作為自主復(fù)制的染色體外載體，如早前所述。術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”涵蓋由于復(fù)制過程中發(fā)生的突變與親本細(xì)胞不同的親本細(xì)胞的任何后代。宿主細(xì)胞的選擇在很大程度上取決于編碼該多肽的基因及其來源。該宿主細(xì)胞可以是有用于重組產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的任何細(xì)胞，例如原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。原核宿主細(xì)胞可以是任何革蘭氏陽(yáng)性或革蘭氏陰性細(xì)菌。革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌包括但不限于：芽孢桿菌屬、梭菌屬、腸球菌屬、土芽孢桿菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、海洋芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬、以及鏈霉菌屬。革蘭氏陰性細(xì)菌包括但不限于：彎曲桿菌屬、大腸桿菌、黃桿菌屬、梭桿菌屬、螺桿菌屬、泥桿菌屬、奈瑟氏菌屬、假單胞菌屬、沙門氏菌屬、以及脲原體屬。細(xì)菌宿主細(xì)胞可以是任何芽孢桿菌屬細(xì)胞，包括但不限于：嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、堅(jiān)硬芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌以及蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞。細(xì)菌宿主細(xì)胞還可以是任何鏈球菌屬細(xì)胞，包括但不限于：似馬鏈球菌、釀膿鏈球菌、乳房鏈球菌以及馬鏈球菌獸瘟亞種細(xì)胞。細(xì)菌宿主細(xì)胞還可以是任何鏈霉菌屬細(xì)胞，包括但不限于：不產(chǎn)色鏈霉菌、除蟲鏈霉菌、天藍(lán)鏈霉菌、灰色鏈霉菌以及淺青紫鏈霉菌細(xì)胞。將dna引入芽孢桿菌屬細(xì)胞中可通過以下來實(shí)現(xiàn)：原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見例如，張(chang)和科恩(cohen)，1979，分子遺傳學(xué)與基因組學(xué)(mol.gen.genet.)168:111-115)、感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(參見例如，楊格(young)和斯皮宰曾(spizizen)，1961，細(xì)菌學(xué)雜志(j.bacteriol.)81:823-829；或杜拜努(dubnau)以及大衛(wèi)杜夫-阿貝爾森(davidoff-abelson)，1971，分子生物學(xué)雜志(j.mol.biol.)56:209-221)、電穿孔(參見例如，茂川(shigekawa)和道爾(dower)，1988，生物技術(shù)(biotechniques)6:742-751)、或者接合(參見例如，克勒(koehler)和索恩(thorne)，1987，細(xì)菌學(xué)雜志169:5271-5278)。將dna引入大腸桿菌細(xì)胞中可通過以下來實(shí)現(xiàn)：原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，哈納汗(hanahan)，1983，分子生物學(xué)雜志(j.mol.biol.)166:557-580)或電穿孔(參見，例如，道爾(dower)等人，1988，核酸研究(nucleicacidsres.)16:6127-6145)。將dna引入鏈霉菌屬細(xì)胞中可通過以下來實(shí)現(xiàn)：原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、電穿孔(參見例如，貢(gong)等人，2004，葉線形微生物學(xué)(foliamicrobiol.)(praha(布拉格))49:399-405)、接合(參見例如，馬佐迪耶(mazodier)等人，1989，細(xì)菌學(xué)雜志(j.bacteriol.)171:3583-3585)、或轉(zhuǎn)導(dǎo)(參見例如，伯克(burke)等人，2001，美國(guó)科學(xué)院院刊(proc.natl.acad.sci.usa)98:6289-6294)。將dna引入假單孢菌屬細(xì)胞中可通過以下來實(shí)現(xiàn)：電穿孔(參見，例如，蔡(choi)等人，2006，微生物學(xué)方法雜志(j.microbiol.methods)64:391-397)或接合(參見，例如，皮內(nèi)多(pinedo)和斯梅茨(smets)，2005，應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)(appl.environ.microbiol.)71:51-57)。將dna引入鏈球菌屬細(xì)胞中可通過以下來實(shí)現(xiàn)：天然感受態(tài)(參見，例如，佩里(perry)和藏滿(kuramitsu)，1981，感染與免疫(infect.immun.)32:1295-1297)、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，卡特(catt)和卓林克(jollick)，1991，微生物(microbios)68:189-207)、電穿孔(參見，例如，巴克利(buckley)等人，1999，應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)65:3800-3804)或者共軛(參見，例如，克利威爾(clewell)，1981，微生物學(xué)評(píng)論(microbiol.rev.)45:409-436)。然而，可以使用本領(lǐng)域已知的用于將dna引入宿主細(xì)胞中的任何方法。宿主細(xì)胞也可以是真核生物，如哺乳動(dòng)物、昆蟲、植物或真菌細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是真菌細(xì)胞。如在此使用的“真菌”包括子囊菌門(ascomycota)、擔(dān)子菌門(basidiomycota)、壺菌門(chytridiomycota)和接合菌門(zygomycota)以及卵菌門(oomycota)和所有有絲分裂孢子真菌(如霍克斯沃思(hawksworth)等人定義，引自：安斯沃斯(ainsworth)和比斯比(bisby)的真菌大詞典(dictionaryofthefungi)，第8版，1995，國(guó)際cab，大學(xué)出版社(universitypress)，劍橋(cambridge)，英國(guó))。真菌宿主細(xì)胞可以是酵母細(xì)胞。如在此所用的“酵母”包括產(chǎn)子囊酵母(ascosporogenousyeast)(內(nèi)孢霉目(endomycetales))、產(chǎn)擔(dān)子酵母(basidiosporogenousyeast)和屬于半知菌類(fungiimperfecti)(芽孢綱(blastomycetes))的酵母。由于酵母的分類可能在將來變化，為了本發(fā)明的目的，酵母應(yīng)當(dāng)如酵母的生物學(xué)與活性(biologyandactivitiesofyeast)(斯金納(skinner)，帕斯莫爾(passmore)和達(dá)文波特(davenport)編著，應(yīng)用細(xì)菌學(xué)學(xué)會(huì)專題論文集系列9(soc.app.bacteriol.symposiumseriesno.9)，1980)所描述那樣定義。酵母宿主細(xì)胞可以是假絲酵母屬、漢遜酵母屬、克魯弗酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬、或耶氏酵母屬細(xì)胞，如乳酸克魯維酵母(kluyveromyceslactis)、卡爾酵母、釀酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克魯弗酵母、諾地酵母、卵形酵母或解脂耶氏酵母(yarrowialipolytica)細(xì)胞。該真菌宿主細(xì)胞可以是絲狀真菌細(xì)胞。“絲狀真菌”包括真菌門(eumycota)和卵菌門(oomycota)亞類的所有絲狀形式(如霍克斯沃思等人，1995，上文定義)。絲狀真菌通常的特征在于由幾丁質(zhì)、纖維素、葡聚糖、殼聚糖、甘露聚糖、以及其他復(fù)雜多糖構(gòu)成的菌絲體壁。營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)是通過菌絲延伸，而碳分解代謝是專性需氧的。相反，酵母(如釀酒酵母)的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)是通過單細(xì)胞菌體的出芽(budding)，而碳分解代謝可以是發(fā)酵的。絲狀真菌宿主細(xì)胞可以是枝頂孢霉屬、曲霉屬、短梗霉屬、煙管霉屬(bjerkandera)、擬臘菌屬、金孢子菌屬、鬼傘屬、革蓋菌屬(coriolus)、隱球菌屬、線黑粉菌科(filibasidium)、鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬、梨孢菌屬、毛霉屬、毀絲霉屬、新美鞭菌屬、鏈孢菌屬、擬青霉屬、青霉屬、平革菌屬、射脈菌屬(phlebia)、瘤胃壺菌屬、側(cè)耳屬(pleurotus)、裂褶菌屬、籃狀菌屬、嗜熱子囊菌屬、梭孢殼屬、彎頸霉屬、栓菌屬(trametes)或木霉屬細(xì)胞。例如，絲狀真菌宿主細(xì)胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、煙曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺煙管菌(bjerkanderaadusta)、干擬蠟菌(ceriporiopsisaneirina)、卡內(nèi)基擬蠟菌(ceriporiopsiscaregiea)、淺黃擬蠟孔菌(ceriporiopsisgilvescens)、潘諾希塔擬蠟菌(ceriporiopsispannocinta)、環(huán)帶擬蠟菌(ceriporiopsisrivulosa)、微紅擬蠟菌(ceriporiopsissubrufa)、蟲擬蠟菌(ceriporiopsissubvermispora)、狹邊金孢子菌(chrysosporiuminops)、嗜角質(zhì)金孢子菌、盧克諾文思金孢子菌(chrysosporiumlucknowense)、糞狀金孢子菌(chrysosporiummerdarium)、租金孢子菌、昆士蘭金孢子菌(chrysosporiumqueenslandicum)、熱帶金孢子菌、褐薄金孢子菌(chrysosporiumzonatum)、灰蓋鬼傘(coprinuscinereus)、毛革蓋菌(coriolushirsutus)、桿孢狀鐮孢、谷類鐮孢、庫(kù)威鐮孢、大刀鐮孢、禾谷鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢、鑲片鐮孢、特異腐質(zhì)霉、柔毛腐質(zhì)霉、米黑毛霉、嗜熱毀絲霉、粗糙鏈孢菌、產(chǎn)紫青霉、黃孢平革菌(phanerochaetechrysosporium)、射脈菌(phlebiaradiata)、刺芹側(cè)耳(pleurotuseryngii)、土生梭孢殼霉、長(zhǎng)域毛栓菌(trametesvillosa)、變色栓菌(trametesversicolor)、哈茨木霉、康寧木霉、長(zhǎng)枝木霉、里氏木霉、或綠色木霉細(xì)胞。真菌細(xì)胞可以通過下述過程轉(zhuǎn)化，所述過程涉及原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化、以及以本身已知的方式的細(xì)胞壁的再生。用于轉(zhuǎn)化曲霉屬和木霉屬宿主細(xì)胞的適合程序在ep238023和約爾頓(yelton)等人，1984，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(proc.natl.acad.sci.usa)81:1470-1474以及科里蒂森(christensen)等人，1988，生物/技術(shù)(bio/technology)6:1419-1422中描述。用于轉(zhuǎn)化鐮刀菌屬物種的適合方法在馬拉迪耶(malardier)等人，1989，基因(gene)78:147-156和wo96/00787中描述?？梢允褂糜扇缫韵挛墨I(xiàn)描述的程序轉(zhuǎn)化酵母：貝克爾(becker)和瓜倫特(guarente)，在阿貝爾森(abelson)，j.n.和西蒙(simon)，m.i.編，酵母遺傳學(xué)與分子生物學(xué)指南(guidetoyeastgeneticsandmolecularbiology)，酶學(xué)方法(guidetoyeastgeneticsandmolecularbiology,methodsinenzymology)，第194卷，第182-187頁(yè)，學(xué)術(shù)出版社有限公司(academicpress,inc.)，紐約；伊藤(ito)等人，1983，細(xì)菌學(xué)雜志(j.bacteriol.)153:163；以及亨內(nèi)恩(hinnen)等人，1978，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(proc.natl.acad.sci.usa)75:1920。產(chǎn)生的方法本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法，包括(a)在有益于產(chǎn)生該多肽的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，該細(xì)胞以其野生型形式產(chǎn)生該多肽；(b)任選地分離該多肽；以及(c)回收該多肽。在一方面中，該細(xì)胞是兩面神菌細(xì)胞。在另一方面中，該細(xì)胞是兩面神菌htcc2649細(xì)胞。在另一方面中，該細(xì)胞是土壤球菌屬(terracoccus)細(xì)胞。在另一方面中，該細(xì)胞是土壤球菌屬(terracoccussp.)273mftsu3.1細(xì)胞。在另一方面中，該細(xì)胞是諾爾氏菌屬(knoellia)細(xì)胞。在另一方面中，該細(xì)胞是黃色諾爾氏菌細(xì)胞。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法，該方法包括(a)培養(yǎng)重組芽孢桿菌屬表達(dá)宿主細(xì)胞，其包含編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸，該多核苷酸可操作地連接一個(gè)或多個(gè)控制序列，這些控制序列在有益于產(chǎn)生該多肽的條件下指導(dǎo)該多肽的產(chǎn)生；(b)任選地分離該多肽；以及(c)回收該多肽。在一個(gè)實(shí)施例中，該芽孢桿菌屬表達(dá)宿主細(xì)胞選自以下列表，該列表由以下各項(xiàng)組成：嗜堿芽孢桿菌(bacillusalkalophilus)、解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)、短芽孢桿菌(bacillusbrevis)、環(huán)狀芽孢桿菌(bacilluscirculans)、克勞氏芽孢桿菌(bacillusclausii)、凝結(jié)芽孢桿菌(bacilluscoagulans)、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌(bacillusfirmus)、嗜熱脂肪土芽孢桿菌(geobacillusstearothermophilus)、燦爛芽孢桿菌(bacilluslautus)、遲緩芽孢桿菌(bacilluslentus)、地衣芽孢桿菌(bacilluslicheniformis)、巨大芽孢桿菌(bacillusmegaterium)、短小芽孢桿菌(bacilluspumilus)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)、以及蘇云金桿菌(bacillusthuringiensis)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，該芽孢桿菌屬表達(dá)宿主細(xì)胞選自以下列表，該列表由以下各項(xiàng)組成：地衣芽孢桿菌，解淀粉芽孢桿菌、和枯草芽孢桿菌。這些宿主細(xì)胞是在適合于使用本領(lǐng)域中已知的方法產(chǎn)生該多肽的一種營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的。例如，可以通過搖瓶培養(yǎng)、或在實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)發(fā)酵罐中小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、補(bǔ)料分批或固態(tài)發(fā)酵)培養(yǎng)細(xì)胞，所述培養(yǎng)在適合的培養(yǎng)基中并且在允許表達(dá)和/或分離多肽的條件下進(jìn)行。該培養(yǎng)是使用本領(lǐng)域中已知的程序，在一種適合營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中發(fā)生，該培養(yǎng)基包括碳和氮來源及無機(jī)鹽。適合的培養(yǎng)基可從商業(yè)供應(yīng)商獲得或可以根據(jù)公開的組成(例如，在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中)制備。如果多肽分泌到該營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，那么可直接從培養(yǎng)基中回收多肽。如果多肽不被分泌，那么其可從細(xì)胞裂解液中進(jìn)行回收。可以使用特異性針對(duì)這些多肽的本領(lǐng)域已知的方法來檢測(cè)該多肽。這些檢測(cè)方法包括但不限于，特異性抗體的使用、酶產(chǎn)物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶測(cè)定來確定該多肽的活性?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的方法來回收多肽。例如，該多肽可以通過常規(guī)程序，包括但不限于，收集、離心、過濾、提取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀，從該營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基回收。在一方面中，回收包含該多肽的發(fā)酵液?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的多種方法純化多肽，所述方法包括但不限于色譜(例如，離子交換色譜法、親和色譜法、疏水色譜法、聚焦色譜法和大小排阻色譜法)、電泳方法(例如，制備性等電聚焦)、差異性溶解(例如，硫酸銨沉淀)、sds-page或提取(參見，例如，蛋白質(zhì)純化(proteinpurification)，編者詹森(janson)和賴登(ryden)，vch出版公司，紐約，1989)，以便獲得基本上純的多肽。在替代性方面，不回收多肽，而是使用表達(dá)該多肽的本發(fā)明宿主細(xì)胞作為多肽的來源。植物本發(fā)明還涉及分離的植物，例如轉(zhuǎn)基因植物、植物部分或植物細(xì)胞，這些植物包括本發(fā)明的多肽，從而表達(dá)并且產(chǎn)生可回收的量的多肽或結(jié)構(gòu)域。可從植物或植物部分回收多肽或結(jié)構(gòu)域。作為替代方案，包括該多肽或結(jié)構(gòu)域的植物或植物部分可以按原樣用于改進(jìn)食品或飼料的質(zhì)量，例如改進(jìn)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、可口性及流變學(xué)特性，或破壞抗?fàn)I養(yǎng)因素。轉(zhuǎn)基因植物可以是雙子葉的(雙子葉植物)或單子葉的(單子葉植物)。單子葉植物的實(shí)例是草，如草甸草(藍(lán)草，早熟禾屬)；飼草，如羊茅屬(festuca)、黑麥草屬(lolium)；溫帶草，如翦股穎屬(agrostis)；以及谷類，例如小麥、燕麥、黑麥、大麥、稻、高粱、以及玉蜀黍(玉米)。雙子葉植物的實(shí)例是煙草、豆類(如羽扇豆(lupins)、馬鈴薯、糖甜菜(sugarbeet)、豌豆、豆(bean)和大豆(soybean))、以及十字花科植物(十字花科(familybrassicaceae))(如花椰菜、油菜籽、以及緊密相關(guān)的模式生物擬南芥)。植物部分的實(shí)例是莖、愈傷組織、葉、根、果實(shí)、種子、以及塊莖、以及包括這些部分的獨(dú)立組織，例如，表皮、葉肉、薄壁組織(parenchyme)、維管組織、分生組織。植物細(xì)胞和具體的植物細(xì)胞區(qū)室(如葉綠體、質(zhì)外體、線粒體、液泡、過氧化物酶體和細(xì)胞質(zhì))也被認(rèn)為是植物部分。同樣包含于本發(fā)明范圍內(nèi)的是這類植物、植物部分以及植物細(xì)胞的子代。可以根據(jù)本領(lǐng)域已知方法構(gòu)建表達(dá)該多肽或結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明的多肽或結(jié)構(gòu)域的方法，該方法包括：(a)在有益于產(chǎn)生該多肽或結(jié)構(gòu)域的條件下，培養(yǎng)包括編碼該多肽或結(jié)構(gòu)域的多核苷酸的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞，以及(b)回收該多肽或結(jié)構(gòu)域。發(fā)酵液配制品或細(xì)胞組合物本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的多肽的發(fā)酵液配制品或細(xì)胞組合物。發(fā)酵液產(chǎn)物進(jìn)一步包括在發(fā)酵過程中使用的另外的成分，例如像，細(xì)胞(包括包含編碼本發(fā)明的多肽的基因的宿主細(xì)胞，這些宿主細(xì)胞被用于產(chǎn)生感興趣的多肽)、細(xì)胞碎片、生物質(zhì)、發(fā)酵介質(zhì)和/或發(fā)酵產(chǎn)物。在一些實(shí)施例中，該組合物是包含一種或多種有機(jī)酸、殺滅的細(xì)胞和/或細(xì)胞碎片以及培養(yǎng)基的細(xì)胞殺滅的全培養(yǎng)液。如在此使用的術(shù)語(yǔ)“發(fā)酵液”是指由細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)生、不經(jīng)歷或經(jīng)歷最低限的回收和/或純化的制劑。例如，當(dāng)微生物培養(yǎng)株在允許蛋白質(zhì)合成(例如，由宿主細(xì)胞的酶表達(dá))并且將蛋白質(zhì)分泌到細(xì)胞培養(yǎng)基中的碳受限的條件下孵育生長(zhǎng)到飽和時(shí)，產(chǎn)生發(fā)酵液。發(fā)酵液可以包含在發(fā)酵結(jié)束時(shí)得到的發(fā)酵材料的未分級(jí)的或分級(jí)的內(nèi)容物。典型地，發(fā)酵液是未分級(jí)的并且包括用過的培養(yǎng)基以及例如通過離心去除微生物細(xì)胞(例如，絲狀真菌細(xì)胞)之后存在的細(xì)胞碎片。在一些實(shí)施例中，發(fā)酵液包含用過的細(xì)胞培養(yǎng)基、胞外酶以及有活力的和/或無活力的微生物細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，該發(fā)酵液配制品和細(xì)胞組合物包括第一有機(jī)酸組分(包括至少一種1-5碳的有機(jī)酸和/或其鹽)以及第二有機(jī)酸組分(包括至少一種6碳或更多碳的有機(jī)酸和/或其鹽)。在具體實(shí)施例中，該第一有機(jī)酸組分是乙酸、甲酸、丙酸、其鹽，或前述兩種或更多種的混合物；并且該第二有機(jī)酸組分是苯甲酸、環(huán)己烷羧酸、4-甲基戊酸、苯乙酸、其鹽，或前述兩種或更多種的混合物。在一方面中，該組合物包括一種或多種有機(jī)酸，并且任選地進(jìn)一步包含殺滅的細(xì)胞和/或細(xì)胞碎片。在一個(gè)實(shí)施例中，從細(xì)胞殺滅的全培養(yǎng)液中去除這些殺滅的細(xì)胞和/或細(xì)胞碎片，以提供不含這些組分的組合物。這些發(fā)酵液配制品或細(xì)胞組合物可以進(jìn)一步包括防腐劑和/或抗微生物(例如，抑菌)劑，包括但不限于山梨醇、氯化鈉、山梨酸鉀、以及本領(lǐng)域中已知的其他試劑。該細(xì)胞殺滅的全培養(yǎng)液或組合物可以包含在發(fā)酵結(jié)束時(shí)得到的發(fā)酵材料的未分級(jí)的內(nèi)容物。典型地，該細(xì)胞殺滅的全培養(yǎng)液或組合物包括用過的培養(yǎng)基以及在微生物細(xì)胞(例如，絲狀真菌細(xì)胞)生長(zhǎng)至飽和、在碳限制條件下孵育以允許蛋白合成之后存在的細(xì)胞碎片。在一些實(shí)施例中，該細(xì)胞殺滅的全培養(yǎng)液或組合物包括用過的細(xì)胞培養(yǎng)基、胞外酶和殺滅的絲狀真菌細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，可以使用本領(lǐng)域已知的方法來使細(xì)胞殺滅的全培養(yǎng)液或組合物中存在的微生物細(xì)胞透性化和/或裂解。如在此描述的全培養(yǎng)液或細(xì)胞組合物典型地是液體，但是可以包含不溶性組分，例如殺滅的細(xì)胞、細(xì)胞碎片、培養(yǎng)基組分和/或一種或多種不溶性酶。在一些實(shí)施例中，可以去除不溶性組分以提供澄清的液體組合物。本發(fā)明的全液配制品和細(xì)胞組合物可以通過wo90/15861或wo2010/096673中所描述的方法來產(chǎn)生。組合物本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的蛋白酶的組合物。優(yōu)選地，這些組合物富集了這樣一種蛋白酶。術(shù)語(yǔ)“富集”表示組合物的蛋白酶活性已增加，例如富集因子為至少1.1，例如至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少2.0、至少3.0、至少4.0、至少5.0、至少10。這些組合物可以包含本發(fā)明的多肽作為主要酶組分，例如單組分組合物。此類組合物可以進(jìn)一步包括如下所述的調(diào)配劑?？商娲?，這些組合物可以包括多于一種本發(fā)明的多肽(例如單一活性型組合物)和/或多種酶活性，例如一種或多種(例如，若干種)選自下組的酶，該組由以下各項(xiàng)組成：植酸酶、木聚糖酶、半乳聚糖酶、α-半乳糖苷酶，另外的蛋白酶，磷脂酶a1、磷脂酶a2、溶血磷脂酶、磷脂酶c、磷脂酶d、淀粉酶、溶菌酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、β-木糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、纖維素酶、纖維二糖水解酶、β-葡糖苷酶、支鏈淀粉酶、和β-葡聚糖酶或其任何組合。在一個(gè)實(shí)施例中，該組合物包括本發(fā)明第三方面的多肽和任選地一種調(diào)配劑。在一個(gè)實(shí)施例中，該組合物包括本發(fā)明第四方面的多肽和任選地一種調(diào)配劑。在一個(gè)實(shí)施例中，該組合物包括本發(fā)明第五方面的多肽和任選地一種調(diào)配劑。在一個(gè)實(shí)施例中，該組合物包括本發(fā)明第六方面的多肽和任選地一種調(diào)配劑。調(diào)配劑本發(fā)明的酶可以配制為液體或固體。針對(duì)液體配制品，該配制劑可以包括多元醇(如，例如，甘油、乙二醇或丙二醇)、鹽(如，例如，氯化鈉、苯甲酸鈉、山梨酸鉀)或糖或糖衍生物(如，例如，糊精、葡萄糖、蔗糖、和山梨醇)。因此，在一個(gè)實(shí)施例中，該組合物是一種液體組合物，該液體組合物包括本發(fā)明的多肽和一種或多種選自以下列表的調(diào)配劑，該列表由以下各項(xiàng)組成：甘油、乙二醇、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、氯化鈉、苯甲酸鈉、山梨酸鉀、糊精、葡萄糖、蔗糖、和山梨醇。針對(duì)固體配制品，該配制品可以是例如作為顆粒、噴霧干粉或聚結(jié)物。調(diào)配劑可以包括鹽(有機(jī)的或無機(jī)的鋅、鈉、鉀或鈣鹽，例如，如乙酸鈣、苯甲酸鈣、碳酸鈣、氯化鈣、檸檬酸鈣、山梨酸鈣、硫酸鈣、乙酸鉀、苯甲酸鉀、碳酸鉀、氯化鉀、檸檬酸鉀、山梨酸鉀、硫酸鉀、乙酸鈉、苯甲酸鈉、碳酸鈉、氯化鈉、檸檬酸鈉、硫酸鈉、乙酸鋅、苯甲酸鋅、碳酸鋅、氯化鋅、檸檬酸鋅、山梨酸鋅、硫酸鋅)、淀粉或糖或糖衍生物(像例如，蔗糖、糊精、葡萄糖、乳糖、山梨醇)。在一個(gè)實(shí)施例中，該固體組合物是處于顆粒形式。該顆?？梢跃哂谢w結(jié)構(gòu)(matrixstructure)，其中組分是均勻混合的。然而，該顆粒典型地包括核心顆粒和一種或多種包衣，該包衣典型地是鹽的和/或蠟質(zhì)的包衣。該核心顆粒可以是任選地與一種或多種另外的酶組合的本發(fā)明的蛋白酶并且任選地連同一種或多種鹽的均勻共混物，抑或是惰性顆粒(具有本發(fā)明的蛋白酶，該蛋白酶任選地與施加到其上的一種或多種另外的酶組合)。在一個(gè)實(shí)施例中，核心顆粒的材料選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：無機(jī)鹽(如乙酸鈣、苯甲酸鈣、碳酸鈣、氯化鈣、檸檬酸鈣、山梨酸鈣、硫酸鈣、乙酸鉀、苯甲酸鉀、碳酸鉀、氯化鉀、檸檬酸鉀、山梨酸鉀、硫酸鉀、乙酸鈉、苯甲酸鈉、碳酸鈉、氯化鈉、檸檬酸鈉、硫酸鈉、乙酸鋅、苯甲酸鋅、碳酸鋅、氯化鋅、檸檬酸鋅、山梨酸鋅、硫酸鋅)、淀粉或糖或糖衍生物(像例如，蔗糖、糊精、葡萄糖、乳糖、山梨醇)、糖或糖衍生物(像例如，蔗糖、糊精、葡萄糖、乳糖、山梨醇)、有機(jī)小分子、淀粉、面粉、纖維素和礦物質(zhì)。鹽包衣典型地至少是1μm厚并且可以是一種具體的鹽或多種鹽的混合物，例如na2so4、k2so4、mgso4和/或檸檬酸鈉。其他實(shí)例是在例如wo2008/017659、wo2006/034710、wo1997/05245、wo1998/54980、wo1998/55599、wo2000/70034中描述的那些，或是例如在wo2001/00042中描述的聚合物包衣。在另一個(gè)實(shí)施例中，該組合物是一種固體組合物，該固體組合物包括本發(fā)明的蛋白酶和一種或多種選自以下列表的一種或多種調(diào)配劑，該列表由以下各項(xiàng)組成：氯化鈉、苯甲酸鈉、山梨酸鉀、硫酸鈉、硫酸鉀、硫酸鎂、硫代硫酸鈉、碳酸鈣、檸檬酸鈉、糊精、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、乳糖、淀粉和纖維素。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，該調(diào)配劑選自以下化合物中的一種或多種：硫酸鈉、糊精、纖維素、硫代硫酸鈉和碳酸鈣。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，該固體組合物是處于顆粒形式。在一個(gè)實(shí)施例中，該固體組合物是處于顆粒形式，并且包括核心顆粒、包含本發(fā)明的蛋白酶的酶層以及鹽包衣。在另外的實(shí)施例中，該調(diào)配劑選自以下化合物中的一種或多種：甘油、乙二醇、1,2-丙二醇或1,3-丙二醇、氯化鈉、苯甲酸鈉、山梨酸鉀、硫酸鈉、硫酸鉀、硫酸鎂、硫代硫酸鈉、碳酸鈣、檸檬酸鈉、糊精、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、乳糖、淀粉和纖維素。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，該調(diào)配劑選自以下化合物中的一種或多種：1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、硫酸鈉、糊精、纖維素、硫代硫酸鈉和碳酸鈣。動(dòng)物飼料和動(dòng)物飼料添加劑本發(fā)明還涉及動(dòng)物飼料組合物和動(dòng)物飼料添加劑。動(dòng)物飼料組合物或飲食具有相對(duì)高的蛋白含量。家禽和豬飲食的特征如wo01/58275，表b第2-3欄所示。魚飲食可被表征為該表b第4欄中所示的。此外，這類魚食通常具有200-310g/kg的粗脂肪含量。根據(jù)本發(fā)明的動(dòng)物飼料組合物具有的粗蛋白含量為50-800g/kg，并且此外還包含至少一種如本文所述的蛋白酶或多于一種如本文所述的蛋白酶。此外，或可替代地(對(duì)于以上指出的粗蛋白含量)，本發(fā)明的動(dòng)物飼料組合物具有10-30mj/kg的可代謝能量的含量；和/或0.1-200g/kg的鈣含量；和/或0.1-200g/kg的有效磷含量；和/或0.1-100g/kg的甲硫氨酸含量；和/或0.1-150g/kg的甲硫氨酸加半胱氨酸含量；和/或0.5-50g/kg的賴氨酸含量。在具體實(shí)施例中，可代謝能量、粗蛋白、鈣、磷、甲硫氨酸、甲硫氨酸加半胱氨酸、和/或賴氨酸的含量落入wo01/58275，表b，范圍2、3、4或5(r.2-5)中的任何一個(gè)中。粗蛋白以氮(n)乘以系數(shù)6.25計(jì)算，即粗蛋白(g/kg)＝n(g/kg)x6.25。通過凱氏定氮法(kjeldahlmethod)測(cè)定氮含量(a.o.a.c.,1984，官方分析方法(officialmethodsofanalysis)第14版，官方分析化學(xué)家集(associationofofficialanalyticalchemists)，華盛頓特區(qū))。可代謝能量可根據(jù)nrc出版物豬的營(yíng)養(yǎng)需求(nutrientrequirementsinswine)，第九次再版1988，國(guó)家研究委員會(huì)農(nóng)業(yè)部動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)協(xié)會(huì)豬營(yíng)養(yǎng)分會(huì)。美國(guó)國(guó)家科學(xué)院出版社，華盛頓特區(qū)，第2-6頁(yè)和歐洲家禽飼養(yǎng)材料能量值表(europeantableofenergyvaluesforpoultryfeed-stuffs)，斯克得霍特(spelderholt)家禽研究與推廣中心，7361da貝克貝亨，荷蘭，grafischbedrijfponsen&looijen公司，瓦赫寧恩.isbn90-71463-12-5計(jì)算。完整的動(dòng)物飲食中鈣、有效磷和氨基酸的飲食含量是在飼料表(如飼料表(veevoedertabel)1997，化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)(gegevensoverchemischesamenstelling)，飼料的消化率和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值(verteerbaarheidenvoederwaardevanvoedermiddelen)，中央飼料局(centralveevoederbureau)，runderweg6,8219pk萊利斯塔德，isbn90-72839-13-7)的基礎(chǔ)上計(jì)算。在具體實(shí)施例中，本發(fā)明的動(dòng)物飼料組合物包含如上定義的至少一種植物性蛋白。本發(fā)明的動(dòng)物飼料組合物還可以包含動(dòng)物性蛋白，如肉和骨粉、羽毛粉、和/或魚粉，通常量為0-25％。本發(fā)明的動(dòng)物飼料組合物還可以包含具有可溶物的干酒糟(drieddistillersgrains)，通常量為0-30％。在再進(jìn)一步具體的實(shí)施例中，本發(fā)明的動(dòng)物飼料組合物包含0-80％玉蜀黍；和/或0-80％高粱；和/或0-70％小麥；和/或0-70％大麥；和/或0-30％燕麥；和/或0-40％大豆粉；和/或0-25％魚粉；和/或0-25％肉和骨粉；和/或0-20％乳清。該動(dòng)物飼料可以包括植物性蛋白。在具體實(shí)施例中，這些植物性蛋白的蛋白含量至少為10、20、30、40、50、60、70、80、或90％(w/w)。植物性蛋白可以衍生自植物性蛋白來源，如豆類和谷類，例如得自蝶形花科(豆科)、十字花科、藜科和早熟禾科植物的材料，如大豆粉餅、羽扇豆粉餅、油菜籽粉餅、及其組合。在一個(gè)具體實(shí)施例中，植物性蛋白來源是來自豆科(fabaceae)的一種或多種植物的材料，如大豆、羽扇豆、豌豆、豆。在另一個(gè)具體實(shí)施例中，植物性蛋白來源是得自藜科的一種或多種植物，如甜菜，糖甜菜，菠菜或奎奴亞藜的材料。植物性蛋白來源的其他實(shí)例是油菜和卷心菜。在另一個(gè)具體實(shí)施例中，大豆是一種優(yōu)選的植物性蛋白來源。植物性蛋白來源的其他實(shí)例是谷物，例如大麥、小麥、黑麥、燕麥、玉蜀黍(玉米)、水稻、和高粱。可將動(dòng)物飲食制成例如糊狀飼料(非丸狀)或丸狀飼料。通常，混合碾磨的飼料并根據(jù)所討論的這些種類的說明添加充足量的必需維生素和礦物質(zhì)。以固體或液體酶配制品的形式添加酶。例如，對(duì)于糊狀飼料，在成分混合步驟前或期間可添加固體或液體酶配制品。對(duì)于丸狀飼料，在飼料成分步驟前或期間還可加入該(固體或液體)蛋白酶/酶制劑。典型地，液體蛋白酶/酶制劑包括本發(fā)明的蛋白酶，任選地伴隨著多元醇(例如甘油、乙二醇或丙二醇)，并且是在壓丸步驟后添加，例如通過將該液體配制品噴涂至丸粒上。也可以將酶摻入飼料添加劑或預(yù)混物?？商娲兀梢酝ㄟ^冷凍液體酶溶液與膨脹劑(例如研磨的大豆粉)的混合物，并且然后凍干該混合物，來制備蛋白酶。在一個(gè)實(shí)施例中，該組合物包括一種或多種另外的酶。在一個(gè)實(shí)施例中，該組合物包括一種或多種微生物。在一個(gè)實(shí)施例中，該組合物包括一種或多種維生素。在一個(gè)實(shí)施例中，該組合物包括一種或多種礦物質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施例中，該組合物包括一種或多種氨基酸。在一個(gè)實(shí)施例中，該組合物包括一種或多種其他飼料成分。在另一個(gè)實(shí)施例中，該組合物包括一種或多種本發(fā)明的多肽、一種或多種調(diào)配劑和一種或多種另外的酶。在一個(gè)實(shí)施例中，該組合物包括一種或多種本發(fā)明的多肽、一種或多種調(diào)配劑和一種或多種微生物。在一個(gè)實(shí)施例中，該組合物包括一種或多種本發(fā)明的多肽、一種或多種調(diào)配劑和一種或多種維生素。在一個(gè)實(shí)施例中，該組合物包括一種或多種本發(fā)明的多肽和一種或多種礦物質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施例中，該組合物包括本發(fā)明的多肽、一種或多種調(diào)配劑和一種或多種氨基酸。在一個(gè)實(shí)施例中，該組合物包括一種或多種本發(fā)明的多肽、一種或多種調(diào)配劑和一種或多種其他飼料成分。在另一個(gè)實(shí)施例中，該組合物包括一種或多種本發(fā)明的多肽、一種或多種調(diào)配劑和一種或多種選自以下列表的組分，該列表由以下各項(xiàng)組成：一種或多種另外的酶；一種或多種微生物；一種或多種維生素；一種或多種礦物質(zhì)；一種或多種氨基酸；和一種或多種其他飼料成分。飲食中的最終蛋白酶濃度在0.01-200mg蛋白酶蛋白/kg飲食的范圍內(nèi)，優(yōu)選地在0.5-100mg/kg飲食之間，更優(yōu)選地2-50mg，甚至更優(yōu)選地5-25mg蛋白酶蛋白/kg動(dòng)物飲食。目前考慮，按以下量(劑量范圍)中的一個(gè)或多個(gè)給予蛋白酶：0.01-200；0.01-100；0.5-100；1-50；5-100；5-50；10-100；0.05-50；5-25；或0.10-10-所有這些范圍都是每kg飼料中蛋白酶蛋白的mg數(shù)(ppm)。為了確定每kg飼料中蛋白酶蛋白的mg數(shù)，從飼料組合物中純化蛋白酶，并且使用相關(guān)試驗(yàn)(參見蛋白酶活性)確定經(jīng)純化的蛋白酶的比活性。使用相同試驗(yàn)測(cè)定該飼料組合物的蛋白酶活性，并且在這兩次測(cè)定的基礎(chǔ)上計(jì)算出以每kg飼料中蛋白酶蛋白的mg數(shù)計(jì)的劑量。在一個(gè)具體實(shí)施例中，本發(fā)明的動(dòng)物飼料添加劑意欲以0.01％至10.0％，更具體0.05％至5.0％或0.2％至1.0％(％指g添加劑/100g飼料)的水平包含(或規(guī)定為必須包含)在動(dòng)物飲食或飼料中。具體地說，對(duì)預(yù)混物也是如此。使用相同的原理測(cè)定飼料添加劑中的蛋白酶蛋白mg數(shù)。當(dāng)然，如果可獲得制備飼料添加劑或飼料所用蛋白酶的樣品，可由該樣品測(cè)定比活性(無需從飼料組合物或添加劑中純化蛋白酶)。另外的酶在另一個(gè)實(shí)施例中，本文所描述的這些組合物任選地包括一種或多種酶。酶可在來自nc-iubmb，1992的手冊(cè)酶命名法(enzymenomenclature)的基礎(chǔ)上分類，還可以在以下網(wǎng)址參見enzyme網(wǎng)站：http://www.expasy.ch/enzyme/。enzyme是相對(duì)于酶命名法的信息倉(cāng)庫(kù)。它主要基于國(guó)際生物化學(xué)和分子生物學(xué)聯(lián)合會(huì)命名委員會(huì)(iub-mb)，學(xué)術(shù)出版社公司(academicpress，inc.)，1992的推薦并且描述了所表征的酶的每種類型，為所述酶提供ec(酶委員會(huì))編號(hào)(bairocha.theenzymedatabase，2000，nucleicacidsres28:304-305)。該iub-mb酶命名法是基于它們的底物特異性并且偶爾也會(huì)基于他們的分子機(jī)制；此種分類并不反映這些酶的結(jié)構(gòu)特征。亨利薩特(henrissat)等人在“2013年的碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫(kù)(thecarbohydrate-activeenzymesdatabase)(cazy)”，核酸研究(nucl.acidsres.)(2014年1月1日)42(d1):d490-d495中描述了某些糖苷水解酶(例如內(nèi)切葡聚糖酶、木聚糖酶、半乳聚糖酶、甘露聚糖酶、葡聚糖酶、溶菌酶和半乳糖苷酶)的另一種分類；還參見www.cazy.org。因此，本發(fā)明的組合物還可以包括選自下組的至少一種其他的酶，該組由以下各項(xiàng)組成：植酸酶(ec3.1.3.8或3.1.3.26)；木聚糖酶(ec3.2.1.8)；半乳聚糖酶(ec3.2.1.89)；α-半乳糖苷酶(ec3.2.1.22)；蛋白酶(ec3.4)，磷脂酶a1(ec3.1.1.32)；磷脂酶a2(ec3.1.1.4)；溶血磷脂酶(ec3.1.1.5)；磷脂酶c(3.1.4.3)；磷脂酶d(ec3.1.4.4)；淀粉酶，如，例如α-淀粉酶(ec3.2.1.1)；溶菌酶(ec3.2.1.17)；阿拉伯呋喃糖苷酶(ec3.2.1.55)；β-木糖苷酶(ec3.2.1.37)；乙酰木聚糖酯酶(ec3.1.1.72)；阿魏酸酯酶(ec3.1.1.73)；纖維素酶(e.c.3.2.1.4)；纖維二糖水解酶(ec3.2.1.91)；β-葡糖苷酶(ec3.2.1.21)；支鏈淀粉酶(ec3.2.1.41)和β-葡聚糖酶(ec3.2.1.4或ec3.2.1.6)，或其任何組合。在一個(gè)具體實(shí)施例中，本發(fā)明的組合物包括植酸酶(ec3.1.3.8或3.1.3.26)?？缮藤?gòu)的植酸酶的實(shí)例包括bio-feedtm植酸酶(諾維信(novozymes))、p、np和hiphos(帝斯曼營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)品公司(dsmnutritionalproducts))、natuphostm(巴斯夫(basf))、和blue(ab酶公司(abenzymes))、(huvepharma)、xp(范恩尼姆/杜邦公司(verenium/dupont))和phy(杜邦公司(dupont))。其他優(yōu)選的植酸酶包括描述于，例如，wo98/28408、wo00/43503、和wo03/066847中的那些。在一個(gè)具體實(shí)施例中，本發(fā)明的組合物包括木聚糖酶(ec3.2.1.8)?？缮藤?gòu)的木聚糖酶的實(shí)例包括wx和g2(帝斯曼營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)品公司(dsmnutritionalproducts))、xt和barley(ab維斯塔公司(abvista))、(范恩尼姆公司(verenium))、x(huvepharma)和xb(木聚糖酶/β-葡聚糖酶，杜邦公司(dupont))。在一個(gè)具體實(shí)施例中，本發(fā)明的組合物包括蛋白酶(ec3.4)。可商購(gòu)的蛋白酶的實(shí)例包括proact(帝斯曼營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)品公司(dsmnutritionalproducts))。微生物在一個(gè)實(shí)施例中，該動(dòng)物飼料組合物進(jìn)一步包含一種或多種另外的微生物。在一個(gè)具體實(shí)施例中，該動(dòng)物飼料組合物進(jìn)一步包括來自以下屬中的一個(gè)或多個(gè)屬的細(xì)菌：乳桿菌屬、乳球菌屬、鏈球菌屬、芽孢桿菌屬、片球菌屬、腸球菌屬、明串珠菌屬、carnobacterium、桿菌屬、丙酸桿菌屬、雙歧桿菌屬、梭菌屬和巨型球菌屬(megasphaera)或其任何組合。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，該動(dòng)物飼料組合物進(jìn)一步包括來自以下菌株中的一個(gè)或多個(gè)菌株的細(xì)菌：枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、多粘菌芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、屎腸球菌、腸球菌屬和片球菌屬、乳酸桿菌屬、雙歧桿菌屬、嗜酸乳桿菌、乳酸片球菌(pediococcusacidilactici)、乳酸乳球菌、兩歧雙歧桿菌、特氏丙酸桿菌(propionibacteriumthoenii)、香腸乳桿菌(lactobacillusfarciminus)、鼠李糖乳桿菌、丁酸梭菌、動(dòng)物雙歧桿菌動(dòng)物?；?bifidobacteriumanimalisssp.animalis)、羅伊氏乳桿菌、唾液乳酸桿菌唾液?；?lactobacillussalivariusssp.salivarius)、埃氏巨型球菌(megasphaeraelsdenii)、丙酸桿菌屬。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施例中，該動(dòng)物飼料組合物進(jìn)一步包括來自枯草芽孢桿菌的以下菌株中的一個(gè)或多個(gè)菌株的細(xì)菌：3a-p4(pta-6506)；15a-p4(pta-6507)；22c-p1(pta-6508)；2084(nrrlb-500130)；lssa01(nrrl-b-50104)；bs27(nrrlb-50105)；bs18(nrrlb-50633)；和bs278(nrrlb-50634)。該動(dòng)物飼料組合物中的每種細(xì)菌菌株的細(xì)菌計(jì)數(shù)為1x104和1x1014cfu/kg的干物質(zhì)之間，優(yōu)選地1x106和1x1012cfu/kg的干物質(zhì)之間，并且更優(yōu)選地1x107至1x1011cfu/kg的干物質(zhì)之間。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施例中，該動(dòng)物飼料組合物中的每種細(xì)菌菌株的細(xì)菌計(jì)數(shù)為1x108和1x1010cfu/kg的干物質(zhì)之間。該動(dòng)物飼料組合物中的每種細(xì)菌菌株的細(xì)菌計(jì)數(shù)為1x105和1x1015cfu/動(dòng)物/天之間，優(yōu)選地1x107和1x1013cfu/動(dòng)物/天之間，并且更優(yōu)選地1x108和1x1012cfu/動(dòng)物/天之間。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施例中，該動(dòng)物飼料組合物中的每種細(xì)菌菌株的細(xì)菌計(jì)數(shù)為1x109和1x1011cfu/動(dòng)物/天之間。在另一個(gè)實(shí)施例中，該一種或多種細(xì)菌菌株以穩(wěn)定的孢子形式存在。預(yù)混物在一個(gè)實(shí)施例中，該動(dòng)物飼料可以包括預(yù)混物，該預(yù)混物例如包括混合到動(dòng)物飼料中的維生素、礦物質(zhì)、酶、氨基酸、防腐劑、抗生素、其他飼料成分或其任何組合。維生素和礦物質(zhì)在另一個(gè)實(shí)施例中，該動(dòng)物飼料可以包括一種或多種維生素，例如一種或多種脂溶性維生素和/或一種或多種水溶性維生素。在另一個(gè)實(shí)施例中，該動(dòng)物飼料可任選地包括一種或多種礦物質(zhì)，例如一種或多種痕量礦物質(zhì)和/或一種或多種巨量礦物質(zhì)。通常，脂溶性維生素-和水溶-性維生素、以及痕量礦物質(zhì)形成了一種所謂的旨在添加到飼料中的預(yù)混料的部分，而大量礦物質(zhì)通常被分開地添加到飼料中。脂-溶性維生素的非限制性實(shí)例包括維生素a、維生素d3、維生素e、以及維生素k，例如維生素k3。水-溶性維生素的非限制性實(shí)例包括維生素b12、生物素和膽堿、維生素b1、維生素b2、維生素b6、煙酸、葉酸和泛酸鹽，例如ca-d-泛酸鹽。痕量礦物質(zhì)的非限制性實(shí)例包括硼、鈷、氯化物、鉻、銅、氟化物、碘、鐵、錳、鉬、硒和鋅。巨量礦物質(zhì)的非限制性實(shí)例包括鈣、鎂、鉀和鈉。在wo01/58275的表a中，列出了這些組分的營(yíng)養(yǎng)需求(以家禽和仔豬/豬為例)。營(yíng)養(yǎng)需求指的是應(yīng)在飲食中提供指定濃度的這些組分。在可替代的實(shí)施例中，本發(fā)明的動(dòng)物飼料添加劑包含wo01/58275的表a中指定的單獨(dú)組分中的至少一種。至少一種指的是一種或兩種或三種或四種等直至所有十三種、或直至所有15種單獨(dú)組分中的任一種，一種或多種。更具體地，該至少一種單獨(dú)組分以提供在表a的第四欄或第五欄或第六欄說明的范圍內(nèi)的飼料中濃度(in-feed-concentration)的量包括在本發(fā)明的添加劑內(nèi)。在仍另外的實(shí)施例中，本發(fā)明的動(dòng)物飼料添加劑包含以下維生素中的至少一種，優(yōu)選使得其飼料內(nèi)濃度落入下表1中所限定的范圍之內(nèi)(分別對(duì)于小豬飲食和肉仔雞飲食)。表1：一般性維生素建議維生素小豬飲食肉仔雞飲食維生素a10,000-15,000iu/kg飼料8-12,500iu/kg飼料維生素d31800-2000iu/kg飼料3000-5000iu/kg飼料維生素e60-100mg/kg飼料150-240mg/kg飼料維生素k32-4mg/kg飼料2-4mg/kg飼料維生素b12-4mg/kg飼料2-3mg/kg飼料維生素b26-10mg/kg飼料7-9mg/kg飼料維生素b64-8mg/kg飼料3-6mg/kg飼料維生素b120.03-0.05mg/kg飼料0.015-0.04mg/kg飼料煙酸(維生素b3)30-50mg/kg飼料50-80mg/kg飼料泛酸20-40mg/kg飼料10-18mg/kg飼料葉酸1-2mg/kg飼料1-2mg/kg飼料生物素0.15-0.4mg/kg飼料0.15-0.3mg/kg飼料氯化膽堿200-400mg/kg飼料300-600mg/kg飼料氨基酸本發(fā)明的組合物還可包括一種或多種氨基酸。用于動(dòng)物飼料的氨基酸的實(shí)例是賴氨酸、丙氨酸、β-丙氨酸、蘇氨酸、甲硫氨酸和色氨酸。其他飼料成分本發(fā)明的組合物可以進(jìn)一步包括著色劑、穩(wěn)定劑、生長(zhǎng)改進(jìn)添加劑和香料化合物/調(diào)味品、多不飽和脂肪酸(pufa)；活性氧產(chǎn)生物質(zhì)、抗微生物肽和抗真菌多肽。著色劑的實(shí)例是類葫蘿卜素，例如β-胡蘿卜素、蝦青素、和葉黃素。香料化合物/調(diào)味料的實(shí)例是甲氧甲酚，茴香醚，十、十一和/或十二內(nèi)酯、紫羅酮、鳶尾酮、姜辣素、哌啶、亞丙基苯酞(propylidenephatalide)、亞丁基苯酞(butylidenephatalide)、辣椒素和鞣質(zhì)?？刮⑸镫?amp)的實(shí)例是cap18、林可霉素(leucocin)a、三色肽(tritrpticin)、protegrin-1、死亡素(thanatin)、防衛(wèi)素(defensin)、乳鐵蛋白、乳鐵蛋白肽、和奧維司匹林(ovispirin)如諾維司匹林(novispirin)(羅伯特萊勒(robertlehrer)，2000)、菌絲霉素(plectasins)以及他汀類，包含在wo03/044049和wo03/048148中所披露的化合物和多肽，以及以上的保留了抗微生物活性的變體或片段?？拐婢嚯?afp)的實(shí)例是巨大曲霉(aspergillusgiganteus)和黑曲霉的肽，連同其保留了抗真菌活性的變體和片段，如在wo94/01459和wo02/090384中披露的。多不飽和脂肪酸的實(shí)例為c18、c20和c22多不飽和脂肪酸，如花生四烯酸、二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸和γ-亞油酸。產(chǎn)生活性氧的種類的實(shí)例為化學(xué)品，如過硼酸鹽、過硫酸鹽或過碳酸鹽；和酶，如氧化酶、加氧酶或合成酶。本發(fā)明的組合物可以進(jìn)一步包括至少一種氨基酸。用于動(dòng)物飼料的氨基酸的實(shí)例是賴氨酸、丙氨酸、β-丙氨酸、蘇氨酸、甲硫氨酸和色氨酸。用途本發(fā)明還針對(duì)用于使用具有蛋白酶活性的多肽或其組合物(用于例如動(dòng)物飼料)的方法。在動(dòng)物飼料中的用途本發(fā)明的蛋白酶還可以在動(dòng)物飼料中使用。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種用于制備動(dòng)物飼料組合物的方法，該方法包括將本發(fā)明的一種或多種蛋白酶添加至一種或多種動(dòng)物飼料成分中。根據(jù)wo00/21381和wo04/026334，還可以將本發(fā)明的一種或多種蛋白酶在動(dòng)物飼料中用作改進(jìn)飼料可消化性以增加其利用效率的飼料增強(qiáng)酶。在一個(gè)另外的實(shí)施例中，可以將本發(fā)明的蛋白酶用于動(dòng)物飼料中或用作飼料添加劑，其中它對(duì)動(dòng)物消化道可以提供積極作用并且以此方式根據(jù)體重增加、飼料轉(zhuǎn)化率(fcr)、歐洲生產(chǎn)效率因子(epef)、歐洲生產(chǎn)效能因子(eff)改進(jìn)動(dòng)物生產(chǎn)性能，或改進(jìn)動(dòng)物健康，例如降低的死亡率。將fcr計(jì)算為相對(duì)于以g/動(dòng)物計(jì)的的體重增加的以g/動(dòng)物計(jì)的飼料攝入。在根據(jù)本發(fā)明的用途中，可在飲食之前、之后或同時(shí)給動(dòng)物飼喂蛋白酶。優(yōu)選后者。在一個(gè)具體實(shí)施例中，明確限定了將蛋白酶添加至飼料中時(shí)或?qū)⑵浒ㄔ陲暳咸砑觿┲袝r(shí)蛋白酶的形式。明確限定指的是如經(jīng)大小排阻色譜法(參見wo01/58275的實(shí)例12)測(cè)定的，蛋白酶制劑至少為50％純。在其他具體實(shí)施例中，如經(jīng)此方法測(cè)定的，蛋白酶制劑至少為60％、70％、80％、85％、88％、90％、92％、94％、或至少為95％純。明確限定的蛋白酶制劑是有利的。例如，對(duì)于實(shí)質(zhì)上不受其他蛋白酶干擾或污染的蛋白酶而言，更容易確定它在飼料中的正確劑量。術(shù)語(yǔ)正確配量具體指得到一致和恒定的結(jié)果的目標(biāo)，和基于所希望的效果優(yōu)化劑量的能力。然而，為了在動(dòng)物飼料中使用，蛋白酶不必是純的；可以例如包括其他酶，此時(shí)可將其稱為蛋白酶制品。該蛋白酶制劑可以(a)直接加入飼料，或者(b)它可以用于隨后加入飼料(或者用于處理過程中)的一種或多種中間組合物，如飼料添加劑或者預(yù)混物的生產(chǎn)。不論是否根據(jù)上述(a)或(b)來使用，上文所述的純度指的都是原始蛋白酶制劑的純度。具體地說，使用重組生產(chǎn)方法即可獲得純度為上述數(shù)量級(jí)的蛋白酶制劑，然而，當(dāng)通過傳統(tǒng)的發(fā)酵方法生產(chǎn)蛋白酶時(shí)，要想獲得這些蛋白酶制劑卻并非易事，而且，批次與批次之間會(huì)有較高的差異。這類蛋白酶制品當(dāng)然可以與其他酶混合。該蛋白可以是一種動(dòng)物性蛋白，如肉和骨粉、羽毛粉、和/或魚粉；或者其可以是一種植物性蛋白。如本文所使用的術(shù)語(yǔ)植物性蛋白指包括至少一種得自或來源自植物的蛋白的任何化合物、組合物、制劑或混合物，其中所述蛋白包括經(jīng)修飾蛋白或蛋白衍生物。在具體實(shí)施例中，這些植物性蛋白的蛋白含量至少為10％、20％、30％、40％、50％或60％(w/w)。植物性蛋白可以衍生自植物性蛋白來源，如豆類和谷類，例如得自蝶形花科(豆科)、十字花科、藜科和早熟禾科植物的材料，如大豆粉、羽扇豆粉和油菜籽粉。在一個(gè)具體實(shí)施例中，植物性蛋白來源是來自蝶形花科的一種或多種植物(例如大豆、羽扇豆、豌豆或蠶豆)的材料。在另一個(gè)具體實(shí)施例中，植物性蛋白來源是得自藜科的一種或多種植物，如甜菜，糖甜菜，菠菜或奎奴亞藜的材料。植物性蛋白來源的其他實(shí)例為油菜籽、向日蔡籽、棉籽和卷心菜。大豆為優(yōu)選的植物性蛋白來源。植物性蛋白來源的其他實(shí)例為谷類，如大麥、小麥、黑麥、燕麥、玉蜀黍(玉米)、稻、黑小麥和高粱。在處理過程的具體實(shí)施例中，所討論的這種或這些種蛋白酶影響這些蛋白如植物性蛋白或蛋白來源(或?qū)ζ浒l(fā)揮作用或施加水解或降解影響)。為了達(dá)到此目的，一般將蛋白或蛋白來源懸浮于溶劑，例如含水溶劑，如水中，并適當(dāng)關(guān)注所討論的酶的特征，以調(diào)節(jié)ph和溫度值。例如，可在能使實(shí)際蛋白酶的活性至少為5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或至少為90％的ph值下進(jìn)行處理。類似地，例如，可在能使實(shí)際蛋白酶的活性至少為5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或至少為90％的溫度下進(jìn)行處理。上述活性百分比指示是相對(duì)于最大活性而言的。持續(xù)進(jìn)行酶解反應(yīng)直至獲得所需結(jié)果，然后可以通過例如熱-處理步驟滅活酶來終止反應(yīng)，或者也可以不終止反應(yīng)。在本發(fā)明處理過程的另一個(gè)具體實(shí)施例中，蛋白酶作用被維持，這意味著例如將蛋白酶加入這些蛋白，但其水解影響可以說尚未開啟，直到后來當(dāng)有此需求時(shí)，一旦建立了適當(dāng)?shù)乃鈼l件，或一旦滅活了任何酶抑制劑，或不論使用何種其他方式延遲了酶的作用，才會(huì)開啟其水解影響。在一個(gè)實(shí)施例中，處理是預(yù)-處理動(dòng)物飼料或用于動(dòng)物飼料的蛋白，即這些蛋白是在攝入之前被水解的。術(shù)語(yǔ)改進(jìn)動(dòng)物飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值指的是提高飼料中的營(yíng)養(yǎng)的可利用性。在本發(fā)明中，改進(jìn)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值具體指的是改進(jìn)飼料的蛋白部分的可利用性，從而導(dǎo)致蛋白提取的增加，較高的蛋白產(chǎn)量，和/或蛋白利用的改進(jìn)。當(dāng)飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值增加時(shí)，蛋白和/或氨基酸消化率增加，并且該動(dòng)物的生長(zhǎng)速率和/或體重增加量和/或飼料轉(zhuǎn)化(即相對(duì)于體重增加的飼料攝取量)可被改進(jìn)。能以任何形式將蛋白酶添加至飼料中，如它是相對(duì)純的蛋白酶，或與欲添加至動(dòng)物飼料的其他組分的混合物，即以動(dòng)物飼料添加劑的形式，例如所謂的動(dòng)物飼料預(yù)混物。制備方法在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明還涉及用于制備動(dòng)物飼料或飼料添加劑的方法，該方法包括制備包含動(dòng)物飼料和本發(fā)明第一方面的蛋白酶的動(dòng)物飼料或飼料添加劑。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明還涉及用于制備動(dòng)物飼料或飼料添加劑的方法，該方法包括制備包含動(dòng)物飼料和本發(fā)明第二方面的蛋白酶的動(dòng)物飼料或飼料添加劑。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明還涉及用于制備動(dòng)物飼料或飼料添加劑的方法，該方法包括制備包含動(dòng)物飼料和本發(fā)明第三方面的蛋白酶的動(dòng)物飼料或飼料添加劑。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明還涉及用于制備動(dòng)物飼料或飼料添加劑的方法，該方法包括制備包含動(dòng)物飼料和本發(fā)明第四方面的蛋白酶的動(dòng)物飼料或飼料添加劑。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明還涉及用于制備動(dòng)物飼料或飼料添加劑的方法，該方法包括制備包含動(dòng)物飼料和本發(fā)明第五方面的蛋白酶的動(dòng)物飼料或飼料添加劑。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明還涉及用于制備動(dòng)物飼料或飼料添加劑的方法，該方法包括制備包含動(dòng)物飼料和本發(fā)明第六方面的蛋白酶的動(dòng)物飼料或飼料添加劑。核酸構(gòu)建體、表達(dá)載體、重組宿主細(xì)胞和用于生產(chǎn)蛋白酶的方法本發(fā)明還涉及包含編碼本發(fā)明的蛋白酶的這類多核苷酸的核酸構(gòu)建體、表達(dá)載體及重組宿主細(xì)胞。本發(fā)明還涉及生產(chǎn)蛋白酶的方法，包括(a)對(duì)包含這種多核苷酸的重組宿主細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)；以及(b)回收該蛋白。該蛋白對(duì)于宿主細(xì)胞而言可以是天然的或異源的。術(shù)語(yǔ)“蛋白”在此并不是指特定長(zhǎng)度的編碼產(chǎn)物并且，因此，涵蓋肽、寡肽和蛋白。術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”還涵蓋了組合形成編碼的產(chǎn)物的兩個(gè)或更多個(gè)多肽。這些蛋白還包括雜合多肽和融合多肽。優(yōu)選地，該蛋白是一種蛋白酶。該基因可以從任何原核、真核或其他來源獲得。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例在下面的一組項(xiàng)目中描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例。1.包含一種或多種具有蛋白酶活性的多肽的動(dòng)物飼料或動(dòng)物飼料添加劑，其中該多肽選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：(a)一種多肽，該多肽與seqidno:2的成熟多肽具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性；(b)一種多肽，該多肽與seqidno:5具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性；(c)一種多肽，該多肽與seqidno:11的成熟多肽具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性；(d)一種多肽，該多肽與seqidno:14具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性；(e)一種多肽，該多肽與seqidno:17的成熟多肽具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性；(f)一種多肽，該多肽與seqidno:20具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性；(g)一種多肽，該多肽由以下多核苷酸編碼，該多核苷酸在低嚴(yán)格條件、中嚴(yán)格條件、中-高嚴(yán)格條件、高嚴(yán)格條件、或非常高嚴(yán)格條件下與以下各項(xiàng)雜交：(i)seqidno:1的成熟多肽編碼序列；(ii)seqidno:3的成熟多肽編碼序列；(iii)seqidno:10的成熟多肽編碼序列；(iv)seqidno:12的成熟多肽編碼序列；(v)seqidno:16的成熟多肽編碼序列；或者(vi)(i)、(ii)、(iii)、(iv)、或(v)的全長(zhǎng)互補(bǔ)體；(h)一種多肽，該多肽由以下多核苷酸編碼，該多核苷酸與seqidno:1的成熟多肽編碼序列具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性；(i)一種多肽，該多肽由以下多核苷酸編碼，該多核苷酸與seqidno:3的成熟多肽編碼序列具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性；(j)一種多肽，該多肽由以下多核苷酸編碼，該多核苷酸與seqidno:10的成熟多肽編碼序列具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性；(k)一種多肽，該多肽由以下多核苷酸編碼，該多核苷酸與seqidno:12的成熟多肽編碼序列具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性；(l)一種多肽，該多肽由以下多核苷酸編碼，該多核苷酸與seqidno:16的成熟多肽編碼序列具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性；(m)seqidno:5、seqidno:14或seqidno:20的變體或seqidno:2、seqidno:11或seqidno:17的成熟多肽，其中該變體具有蛋白酶活性并且在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個(gè)位置中包含一個(gè)或多個(gè)取代、和/或一個(gè)或多個(gè)缺失、和/或一個(gè)或多個(gè)插入或其任何組合；以及(n)具有蛋白酶活性的(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)或(m)多肽的片段，其中該片段包括至少170個(gè)氨基酸，例如至少175個(gè)氨基酸、至少177個(gè)氨基酸、至少180個(gè)氨基酸、至少185個(gè)氨基酸、至少190個(gè)氨基酸、至少195個(gè)氨基酸或至少200個(gè)氨基酸。2.如項(xiàng)目1所述的動(dòng)物飼料或動(dòng)物飼料添加劑，其中該多肽獲得自或可獲得自微球菌目。3.如項(xiàng)目1至2中任一項(xiàng)所述的動(dòng)物飼料或動(dòng)物飼料添加劑，其中該多肽獲得自或可獲得自間孢囊菌科。4.如項(xiàng)目1至3中任一項(xiàng)所述的動(dòng)物飼料或動(dòng)物飼料添加劑，其中：(a)該多肽在ph4下與同一ph下蛋白酶10r(seqidno:8)的活性相比，具有對(duì)大豆-玉米粉至少2倍更高的活性，例如至少2.25倍、至少2.5倍、至少2.75倍、至少3倍、至少3.25倍、至少3.5倍、至少3.75倍或至少4倍更高的活性；(b)該多肽在ph5下與同一ph下蛋白酶10r(seqidno:8)的活性相比，具有對(duì)大豆-玉米粉至少2倍更高的活性，例如至少2.25倍、至少2.5倍、至少2.75倍或至少3倍更高的活性；并且(c)與同一ph下蛋白酶10r(seqidno:8)相比，該多肽在ph7下對(duì)大豆-玉米粉具有至少50％的活性，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％(即，至少相同)、或至少105％的活性。5.如項(xiàng)目1至4中任一項(xiàng)所述的動(dòng)物飼料或動(dòng)物飼料添加劑，其中：(a)與在ph7下的活性相比，該多肽在ph4下對(duì)大豆-玉米粉具有至少25％的活性，例如至少30％、至少35％或至少40％的活性；(b)與在ph7下的活性相比，該多肽在ph5下對(duì)大豆-玉米粉具有至少45％的活性，例如至少50％、至少55％、至少60％、或至少65％的活性；并且(c)與同一ph下蛋白酶10r(seqidno:8)相比，該多肽在ph7下對(duì)大豆-玉米粉具有至少50％的活性，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％(即，至少相同)、或至少105％的活性。6.如項(xiàng)目1至5中任一項(xiàng)所述的動(dòng)物飼料或動(dòng)物飼料添加劑，其中該多肽包括seqidno:5、seqidno:14或seqidno:20，seqidno:2、seqidno:4、seqidno:11、seqidno:13、seqidno:17或seqidno:19的成熟多肽，或seqidno:2的氨基酸1至203、seqidno:4的氨基酸1至203、seqidno:5的氨基酸1至203、seqidno:11的氨基酸1至204、seqidno:13的氨基酸1至204、seqidno:14的氨基酸1至204、seqidno:17的氨基酸1至204、seqidno:19的氨基酸1至204或seqidno:20的氨基酸1至204，或由它們組成。7.包含一種或多種具有蛋白酶活性的多肽的動(dòng)物飼料或動(dòng)物飼料添加劑，其中：(a)該多肽是肽酶家族s1的絲氨酸蛋白酶；(b)該多肽在ph4下與同一ph下蛋白酶10r(seqidno:8)的活性相比，具有對(duì)大豆-玉米粉至少2倍更高的活性，例如至少2.25倍、至少2.5倍、至少2.75倍、至少3倍、至少3.25倍、至少3.5倍、至少3.75倍或至少4倍更高的活性；(c)該多肽在ph5下與同一ph下蛋白酶10r(seqidno:8)的活性相比，具有對(duì)大豆-玉米粉至少2倍更高的活性，例如至少2.25倍、至少2.5倍、至少2.75倍或至少3倍更高的活性；并且(d)與同一ph下蛋白酶10r(seqidno:8)相比，該多肽在ph7下對(duì)大豆-玉米粉具有至少50％的活性，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％(即，至少相同)、或至少105％的活性。8.如項(xiàng)目7所述的動(dòng)物飼料或動(dòng)物飼料添加劑，其中該多肽在ph4下對(duì)大豆-玉米粉具有少于20倍，例如少于15倍、少于10倍、少于9倍、少于8倍的蛋白酶10r(seqidno:8)的活性，并且在ph5下對(duì)大豆-玉米粉具有少于20倍，例如少于15倍、少于10倍、少于9倍、少于8倍的蛋白酶10r(seqidno:8)的活性。9.如項(xiàng)目7或8中任一項(xiàng)所述的動(dòng)物飼料或動(dòng)物飼料添加劑，其中與同一ph下蛋白酶10r(seqidno:8)相比，該多肽在ph7下對(duì)大豆-玉米粉具有小于200％的活性，例如小于180％、小于170％、小于160％、小于150％、小于140％、小于130％或小于125％的活性。10.包含一種或多種具有蛋白酶活性的多肽的動(dòng)物飼料或動(dòng)物飼料添加劑，其中：(a)該多肽是肽酶家族s1的絲氨酸蛋白酶；(b)與在ph7下的活性相比，該多肽在ph4下對(duì)大豆-玉米粉具有至少25％的活性，例如至少30％、至少35％或至少40％的活性；(c)與在ph7下的活性相比，該多肽在ph5下對(duì)大豆-玉米粉具有至少45％的活性，例如至少50％、至少55％、至少60％、或至少65％的活性；并且(d)與同一ph下蛋白酶10r(seqidno:8)相比，該多肽在ph7下對(duì)大豆-玉米粉具有至少50％的活性，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％(即，至少相同)、或至少105％的活性。11.如項(xiàng)目10所述的動(dòng)物飼料或動(dòng)物飼料添加劑，其中與在ph7下的活性相比，該多肽在ph4下對(duì)大豆-玉米粉具有小于100％的活性，例如小于90％、小于80％、小于75％或小于70％的活性，并且與在ph7下的活性相比，在ph5下對(duì)大豆-玉米粉具有小于95％，例如小于90％、小于85％或小于80％的活性。12.如項(xiàng)目10或11中任一項(xiàng)所述的動(dòng)物飼料或動(dòng)物飼料添加劑，其中與同一ph下蛋白酶10r(seqidno:8)相比，該多肽在ph7下對(duì)大豆-玉米粉具有小于200％的活性，例如小于180％、小于170％、小于160％、小于150％、小于140％、小于130％或小于125％的活性。13.如項(xiàng)目7至12中任一項(xiàng)所述的動(dòng)物飼料或動(dòng)物飼料添加劑，其中該多肽獲得自或可獲得自微球菌目。14.如項(xiàng)目7至12中任一項(xiàng)所述的動(dòng)物飼料或動(dòng)物飼料添加劑，其中該多肽獲得自或可獲得自間孢囊菌科。15.包含一種或多種具有蛋白酶活性的多肽的動(dòng)物飼料或動(dòng)物飼料添加劑，其中：(a)該多肽是肽酶家族s1的絲氨酸蛋白酶；并且(b)該多肽獲得自或可獲得自間孢囊菌科。16.如項(xiàng)目1至15中任一項(xiàng)所述的動(dòng)物飼料或動(dòng)物飼料添加劑，其中該多肽包括一個(gè)或多個(gè)基序vcg[e/q]kvgqp(seqidno:15)。17.如項(xiàng)目1至16中任一項(xiàng)所述的動(dòng)物飼料或動(dòng)物飼料添加劑，具有50至800g/kg的粗蛋白質(zhì)含量。18.如項(xiàng)目1至17中任一項(xiàng)所述的動(dòng)物飼料或動(dòng)物飼料添加劑，進(jìn)一步包含選自以下列表的一種或多種組分，該列表由以下各項(xiàng)組成：一種或多種另外的酶；一種或多種微生物；一種或多種維生素；一種或多種礦物質(zhì)；一種或多種氨基酸；以及一種或多種其他飼料成分。19.如項(xiàng)目18所述的動(dòng)物飼料或動(dòng)物飼料添加劑，其中這些另外的酶選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：植酸酶、木聚糖酶、半乳聚糖酶、α-半乳糖苷酶，另外的蛋白酶，磷脂酶a1、磷脂酶a2、溶血磷脂酶、磷脂酶c、磷脂酶d、淀粉酶、溶菌酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、β-木糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、纖維素酶、纖維二糖水解酶、β-葡糖苷酶、支鏈淀粉酶、和β-葡聚糖酶或其任何組合。20.如項(xiàng)目18所述的動(dòng)物飼料或動(dòng)物飼料添加劑，其中該一種或多種微生物選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、多粘菌芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、兩歧雙歧桿菌、動(dòng)物雙歧桿菌、肉食桿菌屬(carnobacteriumsp.)、丁酸梭菌、梭菌屬、屎腸球菌、腸球菌屬、乳酸桿菌屬、嗜酸乳桿菌、香腸乳桿菌(lactobacillusfarciminus)、鼠李糖乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、唾液乳酸桿菌、乳酸乳球菌、乳球菌屬、明串珠菌屬、埃氏巨型球菌(megasphaeraelsdenii)、巨型球菌屬(megasphaerasp.)、乳酸片球菌(pediococcusacidilactici)、片球菌屬、特氏丙酸桿菌(propionibacteriumthoenii)、丙酸桿菌屬、以及鏈球菌屬或其任何組合。21.如項(xiàng)目1至20中任一項(xiàng)所述的動(dòng)物飼料或動(dòng)物飼料添加劑的用途：在用于在動(dòng)物飼料中使用的組合物的制備中；用于改進(jìn)動(dòng)物飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值；用于增加動(dòng)物飼料中的可消化和/或可溶性蛋白；用于增加動(dòng)物飲食中的蛋白的水解程度；用于改進(jìn)動(dòng)物中的一個(gè)或多個(gè)性能參數(shù)；和/或用于處理蛋白。22.一種用于制備動(dòng)物飼料的方法，包括將如項(xiàng)目1至20中任一項(xiàng)所述的動(dòng)物飼料添加劑與至少一種蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)源進(jìn)行混合。23.一種用于改進(jìn)動(dòng)物飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的方法，其中將如項(xiàng)目1至20中任一項(xiàng)所述的動(dòng)物飼料或動(dòng)物飼料添加劑添加至飼料中。24.一種用于處理蛋白的方法，包括以下步驟：將如項(xiàng)目1至20中任一項(xiàng)所述的動(dòng)物飼料或動(dòng)物飼料添加劑添加到至少一種蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)源中。25.一種用于增加蛋白質(zhì)的消化率和/或溶解度的方法，包括將如權(quán)利要求1至20中任一項(xiàng)所述的動(dòng)物飼料添加劑與至少一種蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)源進(jìn)行混合。26.一種用于改進(jìn)動(dòng)物中的一種或多種性能參數(shù)的方法，包括將如項(xiàng)目1至20中任一項(xiàng)所述的動(dòng)物飼料或動(dòng)物飼料添加劑給予一種或多種動(dòng)物。27.如項(xiàng)目21所述的用途或如項(xiàng)目26所述的方法，其中性能參數(shù)選自以下列表，該列表由以下各項(xiàng)組成：體重增加(bwg)、歐洲生產(chǎn)效率因子(epef)以及飼料轉(zhuǎn)化率(fcr)。28.一種產(chǎn)生多肽的方法，該方法包括：(a)培養(yǎng)重組芽孢桿菌表達(dá)宿主細(xì)胞，其包含編碼項(xiàng)目1中所示的多肽的多核苷酸，該多核苷酸可操作地連接一個(gè)或多個(gè)控制序列，這些控制序列在有益于產(chǎn)生該多肽的條件下指導(dǎo)該多肽的產(chǎn)生；以及(b)回收該多肽。實(shí)例菌株在兩面神菌屬菌株htcc2649的公開基因組序列中鑒定了來自兩面神菌屬的s1蛋白酶1，如在思拉什(thrash)，j.c.、卓(cho)，j.c.、bertagnolli,a.d.、ferriera,s.、約翰遜(johnson)，j.、韋爾然(vergin)，k.l.以及焦萬(wàn)諾尼(giovannoni)，s.j.，“海上的兩面神菌屬菌株htcc2649的基因組序列(genomesequenceofthemarinejanibactersp.strainhtcc2649)”，2011，細(xì)菌學(xué)雜志(j.bacteriol.)193:584-585中所描述的。本文使用的dna如實(shí)例1所述合成獲得。根據(jù)該文章，該菌株從在百慕大(bermuda)的東南部12英里的水電站s處、從10米深處收集的水中分離出來。在土壤球菌屬(terracoccussp.)273mftsu3.1的基因組序列中鑒定了來自土壤球菌屬(terracoccussp.)的s1蛋白酶1(來自jgihttp://genome.jgi.doe.gov/(分類單元id2522125155，jgi工程id1000316))。本文使用的dna如實(shí)例10所述合成獲得。在黃色諾爾氏菌的基因組序列(由朱(w.zhu)和王(g.wang)于2013年8月提交給embl/genbank/ddbj數(shù)據(jù)庫(kù))中鑒定了來自黃色諾爾氏菌tl1的s1蛋白酶1。根據(jù)向宇(xiangyu)、閆篤(yandu)和王歌嬌(gejiaowang)，國(guó)際系統(tǒng)與進(jìn)化微生物學(xué)雜志(internationaljournalofsystematicandevolutionarymicrobiology)(2012),62,384-389，從中華人民共和國(guó)中心的武漢的華中農(nóng)業(yè)大學(xué)的養(yǎng)豬場(chǎng)的豬糞中分離出了黃色諾爾氏菌tl1。本文使用的dna如實(shí)例14所述合成獲得。蛋白質(zhì)測(cè)定1)suc-aapf-pna測(cè)定：pna底物：suc-aapf-pna(巴亨(bachem)l-1400)。溫度：室溫(25℃)測(cè)定緩沖液：100mm琥珀酸，100mmhepes，100mmches，100mmcabs，1mmcacl2，150mmkcl，0.01％tritonx-100，用hcl或naoh調(diào)節(jié)至ph值2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、及11.0。將20μl蛋白酶(稀釋于0.01％tritonx-100中)與100μl測(cè)定緩沖液混合。通過添加100μlpna底物(50mg，溶解在1.0mldmso中，并進(jìn)一步地用0.01％tritonx-100稀釋45倍)開始進(jìn)行測(cè)定。監(jiān)測(cè)od405的增加作為蛋白酶活性的量度。2)普羅塔酶ak(protazymeak)測(cè)定：底物：普羅塔酶ak(protazymeak)片劑(交聯(lián)和染色的酪蛋白；來自麥格酶公司(megazyme))溫度：受控的(測(cè)定溫度)。測(cè)定緩沖液：100mm琥珀酸，100mmhepes，100mmches，100mmcabs，1mmcacl2，150mmkcl，0.01％tritonx-100，用hcl或naoh調(diào)節(jié)至ph值2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、8.0、9.0、10.0、及11.0。通過溫和攪拌，將普羅塔酶ak(protazymeak)片劑懸浮于2.0ml0.01％tritonx-100中。將500μl的這種懸浮液和500μl的測(cè)定緩沖液分散在艾本德管中并置于冰上。添加20μl蛋白酶樣品(稀釋在0.01％tritonx-100中)。通過將艾本德(eppendorf)管轉(zhuǎn)移至設(shè)定為測(cè)定溫度的艾本德恒溫混勻儀來啟動(dòng)測(cè)定。將管在艾本德恒溫混勻儀上在最高振搖速率(1400rpm.)下孵育15分鐘。通過轉(zhuǎn)移該管返回至冰浴停止孵育。隨后將管在冰冷的離心機(jī)中離心數(shù)分鐘并將200μl上清液轉(zhuǎn)移至微量滴定板。讀取od650作為蛋白酶活性的量度。在測(cè)定法中包含空白緩沖液(bufferblind)(代替酶)。3)鄰苯二甲醛(opa)測(cè)定：這一測(cè)定檢測(cè)伯胺并且因此可以將肽鍵由一種蛋白酶的切割測(cè)量為蛋白酶處理的樣品與對(duì)照樣品之間的吸光度的差異?；旧细鶕?jù)尼爾森(nielsen)等人(尼爾森(nielsen)，p.m.、彼得森(petersen)，d、達(dá)姆麥妮(dampmann)，c.，用于確定食物蛋白水解程度的改進(jìn)方法(improvedmethodfordeterminingfoodproteindegreeofhydrolysis)，食品科學(xué)雜志(jfoodsci)，2001,66:642-646)進(jìn)行該測(cè)定。將0.5ml樣品通過100kda微量濃縮(microcon)離心過濾器(60min，11,000rpm，5℃)過濾。將這些樣品在去離子水中稀釋大約(例如10倍、50倍或100倍)，并將25μl的每份樣品裝載到96孔微量滴定板中(5個(gè)重復(fù))。將200μlopa試劑(100mm四硼酸二鈉十水合物、3.5mm十二烷基硫酸鈉(sds)、5.7mm二硫蘇糖醇(ddt)、6mm鄰苯二甲醛)分配在所有孔中，振蕩該板(10sec，750rpm)并且在340nm下測(cè)量吸光度。實(shí)例1：來自兩面神菌屬菌株htcc2649的s1蛋白酶1的表達(dá)基于被鑒定為seqidno:1的公開的核苷酸序列，由基因技術(shù)(geneart)(基因技術(shù)生物公司(geneartagbiopark)，約瑟夫-恩格特大街(josef-engert-str.)11號(hào)，93053，雷根斯堡，德國(guó))合成具有seqidno:3的經(jīng)密碼子優(yōu)化的合成基因。如在wo2012/025577中所述，使用clai和mlui限制酶切位點(diǎn)將該合成基因亞克隆進(jìn)芽孢桿菌屬表達(dá)載體中。用克勞氏芽孢桿菌分泌信號(hào)(具有以下氨基酸序列：mkkplgkivastallisvafsssiasa，seqidno:6)代替天然的分泌信號(hào)來表達(dá)該s1蛋白酶1。將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌中。將表達(dá)盒通過同源重組進(jìn)果膠裂解酶基因座中來整合。在每ml補(bǔ)充有6μg氯霉素的lb板上選擇轉(zhuǎn)化體。選擇包含整合的表達(dá)構(gòu)建體的重組體枯草芽孢桿菌克隆并且將其指定為來自兩面神菌屬htcc2649的s1蛋白酶1。將其在500ml帶擋板的錐形瓶(erlenmeyerflask)中的旋轉(zhuǎn)搖床上培養(yǎng)，每個(gè)錐形瓶包含100ml基于酵母提取物的培養(yǎng)基。將該克隆在30℃下培養(yǎng)3天。收獲包含上清液的酶并如實(shí)施例2中所述的將該酶進(jìn)行純化。實(shí)例2：來自兩面神菌屬htcc2649的s1蛋白酶1的純化將培養(yǎng)液離心(20000xg，20min)并且將上清液小心地與沉淀物潷析分開。將上清液通過nalgene0.2μm過濾單元進(jìn)行過濾，以便去除其余的芽孢桿菌宿主細(xì)胞。將0.2μm濾液轉(zhuǎn)移至在g25葡聚糖凝膠柱(來自ge醫(yī)療集團(tuán))上的10mmmes/naoh、100mmh3bo3、2mmcacl2(ph5.5)。將g25葡聚糖凝膠轉(zhuǎn)移的酶施加至在20mmmes/naoh(ph5.5)中平衡的sp-瓊脂糖凝膠ff柱(來自ge醫(yī)療集團(tuán))上。在將柱用平衡緩沖液充分地洗滌之后，將蛋白酶用在平衡緩沖液與20mmmes/naoh、0.5mmcacl2、0.5mnacl(ph5.5)之間的線性梯度洗脫超過五個(gè)柱體積。合并來自sp-瓊脂糖凝膠ff柱(該柱包含來自兩面神菌的s1蛋白酶1)的主峰，并添加固體硫酸銨至最終硫酸銨濃度為1.6m(nh4)2so4。將經(jīng)硫酸銨調(diào)節(jié)的合并物施加到苯基-瓊脂糖凝膠ff高取代柱(來自ge醫(yī)療集團(tuán))上，該柱在10mmmes/naoh、100mmh3bo3、2mmcacl2、1.6m(nh4)2so4(ph6.0)中平衡。在用平衡緩沖液充分地洗滌柱之后，將蛋白酶用在平衡緩沖液與10mmmes/naoh、100mmh3bo3、10mmmes、2mmcacl2(ph6.0)+25％2-丙醇之間的線性梯度洗脫超過五個(gè)柱體積。合并來自苯基-瓊脂糖凝膠ff柱(該柱包含來自兩面神菌的s1蛋白酶1)的的主峰，并轉(zhuǎn)移到g25葡聚糖凝膠柱(來自ge醫(yī)療集團(tuán))上的20mmch3cooh/naoh，1mmcacl2(ph4.5)。將g25葡聚糖凝膠轉(zhuǎn)移的酶施加至在20mmmes/naoh、1mmcacl2(ph4.5)中平衡的sp-瓊脂糖凝膠ff柱(來自ge醫(yī)療集團(tuán))上。在將柱用平衡緩沖液充分地洗滌之后，將蛋白酶用在相同的緩沖液中的線性nacl梯度(0-->0.5m)洗脫超過四個(gè)柱體積。分析來自柱的部分的蛋白酶活性(在ph7下使用普羅塔酶ak(protazymeak)測(cè)定)并且通過sds-page進(jìn)一步分析活性部分。將在考馬斯染色的sds-page凝膠上僅見到一條帶的部分合并，并且用3％naoh將ph調(diào)節(jié)至ph5.8。來自sp-瓊脂糖凝膠ff柱的調(diào)節(jié)的合并物是純化制劑并且用于進(jìn)一步表征。實(shí)例3：來自兩面神菌屬htcc2649的s1蛋白酶1(seqidno:5)的表征將普羅塔酶ak(protazymeak)測(cè)定法用于獲得ph-活性曲線和ph-穩(wěn)定性曲線(在指示的ph值下2小時(shí)之后的殘余活性)。對(duì)于ph-穩(wěn)定性曲線，將蛋白酶在不同測(cè)定緩沖液中稀釋8x以達(dá)到這些緩沖液的ph值并且然后在37℃下孵育2小時(shí)。在孵育之后，通過稀釋于ph8.0測(cè)定緩沖液中，使該蛋白酶孵育的ph轉(zhuǎn)至與殘余活性測(cè)定之前相同的ph值。使用普羅塔酶ak(protazymeak)測(cè)定法以獲得在ph7.0下的溫度-活性曲線。結(jié)果示于下表2-4中。蛋白酶10r(seqidno:8)的數(shù)據(jù)包括在這些表中。對(duì)于表2，活性是相對(duì)于酶的最適ph而言。對(duì)于表3，活性是相對(duì)于樣品的殘余活性而言，將這些樣品在穩(wěn)定條件下(5℃，ph8.0或ph9.0)保持。對(duì)于表4，活性相對(duì)于酶在ph7.0或ph6.5下的最佳溫度。使用suc-aapf-pna測(cè)定來獲得蛋白酶10r的ph-活性曲線和ph-穩(wěn)定性曲線，并且使用ph6.5下的普羅塔酶ak(protazymeak)測(cè)定來獲得溫度-活性曲線。表2：如使用動(dòng)力學(xué)suc-aapf-pna測(cè)定確定的在25℃下的ph-活性曲線表3：如使用動(dòng)力學(xué)suc-aapf-pna測(cè)定確定的ph-穩(wěn)定性曲線(在37℃下2小時(shí)之后的殘余活性)表4：如使用普羅塔酶ak(protazymeak)測(cè)定確定的ph7.0或ph6.5下的溫度活性曲線與蛋白酶10r的數(shù)據(jù)相比，來自兩面神菌屬htcc2649的s1蛋白酶1的對(duì)普羅塔酶ak(protazymeak)底物的ph-活性、ph-穩(wěn)定性曲線(在37℃下2小時(shí)后的殘留活性)以及在ph7.0下的對(duì)普羅塔酶ak(protazymeak)的溫度活性曲線也示出如下圖1-3。來自兩面神菌屬htcc2649的s1蛋白酶1(seqidno:5)的其他特征抑制劑：pmsf。確定n-末端序列為：anvyggq。如通過sds-page確定的相對(duì)分子量是大約mr＝24kda。通過完整分子量分析確定的分子量是20406.3da。成熟序列(來自埃德曼n-末端測(cè)序數(shù)據(jù)和完整ms數(shù)據(jù))：anvyggqqiefsgyvcslgfnatkagapvfitaghcgegyqtfskngttlgktqafsfpgndyaystlasswtgigavdlwtgsaravtgssnaavgtaicksgrttywtcgsvqaknvtvnydngdgttssvsgltksntcteggdsggswmagnlaqgvtsggagygssgvcgekvgqpniayfqpvgeilsaygltlkta(seqidno:5)來自這一成熟序列的計(jì)算的分子量是20406.2da。實(shí)例4：大豆-玉米粉活性測(cè)定法使用大豆-玉米粉作為底物的終點(diǎn)測(cè)定以獲得在ph3-7時(shí)該蛋白酶的活性曲線。底物：從丹麥技術(shù)研究所(danishtechnologicalinstitute)，gl.1,6092stenderup獲得以30:70的比率混合的大豆粉-玉米粉。將商業(yè)原料研磨(2mm篩)，混合10分鐘，然后研磨(1mm篩)并再混合10分鐘。使用jel200旋轉(zhuǎn)篩(j.恩格斯曼(engelsmann)ag公司，路德維希港(ludwigshafen)，德國(guó))的篩分分析顯示1％的顆粒為>500微米，并且約82％為<212微米。測(cè)定緩沖液：制備包含100mm琥珀酸、100mmhepes、100mmches、100mmcaps、12mmcacl2、150mmkcl、0.01％tritonx-100的5種緩沖液，并使用hcl或naoh調(diào)節(jié)至一ph值，使得在將大豆-玉米粉底物(1g)已經(jīng)與測(cè)定緩沖液(10ml)混合之后給出一種漿液，該漿液的終ph是以下ph之一：3.0、4.0、5.0、6.0以及7.0。在添加蛋白酶之前將底物漿液(2ml)混合30min并在40℃下孵育(500rpm)3小時(shí)。將蛋白酶(200mg酶蛋白/kg干物質(zhì))溶解于100μl100mm乙酸鈉緩沖液(9.565g/lnaoac、1.75g/l乙酸、5mmcacl2、0.01％bsa、0.01％吐溫20，ph6.0)中并且添加。將樣品離心(10min，4000rpm，0℃)并且將收集的上清液使用鄰苯二甲醛(opa)測(cè)定進(jìn)行分析。結(jié)果示于表5和圖4中。來自兩面神菌屬htcc2649的s1蛋白酶1對(duì)大豆-玉米粉的蛋白水解活性隨著ph從ph3增加到ph7而增加，并且在ph3-7的整個(gè)范圍內(nèi)，特別是在ph4-6的范圍內(nèi)的活性顯著高于蛋白酶10r。這些數(shù)據(jù)表明，來自兩面神菌屬htcc2649的s1蛋白酶1具有在蛋白質(zhì)水解中更有效的潛力，例如在反芻動(dòng)物連同單胃動(dòng)物中；例如在ph通常在4和6之間的肉雞的嗉囊中，以及在ph從大約2至6變化(這取決于例如飼料、胃區(qū)和喂養(yǎng)后的時(shí)間)的豬的胃中。表5：在ph3.0、4.0、5.0、6.0及7.0下對(duì)大豆-玉米粉的蛋白酶活性(od340x稀釋因子)實(shí)例5：熱穩(wěn)定性將蛋白酶的蛋白樣品的等分部分(如在例如實(shí)例2、9或11中所述的經(jīng)過純化的)脫鹽或使用預(yù)裝pd-10柱改變緩沖液為20mm乙酸鈉，ph4.0或在4℃下以2-3h步驟針對(duì)2x500ml20mm乙酸鈉，ph4.0進(jìn)行透析，隨后是一個(gè)過夜步驟。將該樣品進(jìn)行0.45μm過濾并用緩沖液稀釋至大約2a280單位。在差示掃描量熱法(dsc)中使用該透析緩沖液作為參照。使用真空吸引器對(duì)這些樣品進(jìn)行脫氣并攪拌大約10分鐘。以1.5℃/min的恒定掃描速率從20℃-90℃在microcalvp-dsc上進(jìn)行dsc掃描。使用microcal原點(diǎn)軟件(originsoftware)(4.10版本)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，并將變性溫度td(也稱為熔解溫度tm)定義為溫度自記曲線的峰尖端的溫度。實(shí)例6：蒸汽穩(wěn)定性可以使用以下測(cè)定法評(píng)價(jià)蒸汽處理后該蛋白酶的殘余活性。在這些試驗(yàn)中，使用修改設(shè)置從而該蒸汽是從蒸汽發(fā)生器中提供的并被導(dǎo)入到箱中。當(dāng)溫度達(dá)到約93℃-94℃時(shí)，通過抽屜將放置在板上的這些樣品插入到該箱中。插入這些樣品后，溫度即降低4℃。當(dāng)溫度停留在大約恒定的90℃時(shí)，孵育30秒。此后，將盤快速地從盒中移除，將樣品放置在冰上，重懸浮，并且使用例如suc-aapf-pna或鄰苯二醛(opa)測(cè)定來針對(duì)蛋白酶活性進(jìn)行評(píng)估。將各個(gè)酶樣品與未經(jīng)蒸汽處理的相似樣品比較以計(jì)算殘余活性。實(shí)例7：造粒穩(wěn)定性測(cè)試如美國(guó)專利號(hào)4,106,991，實(shí)例1中所述的方式進(jìn)行酶?；?。將獲得的顆粒在流化床中干燥至含水量低于1％并過篩以獲得具有250μm至850μm粒子范圍的產(chǎn)物。最終，將該產(chǎn)物用棕櫚油和碳酸鈣以如在美國(guó)專利號(hào)4,106,991，實(shí)例22中所述的方式進(jìn)行包衣。在小型臥式攪拌器中，大致地將50g酶顆粒與10kg飼料預(yù)混合10分鐘。在大型臥式攪拌器中將該預(yù)混合物與90kg飼料混合10分鐘。將該飼料從該攪拌器中以大約300kg/小時(shí)的速率導(dǎo)至調(diào)節(jié)器(帶有蒸汽注入的串聯(lián)攪拌器)。該調(diào)節(jié)器通過注入蒸汽將該飼料加熱至95℃(在排氣口進(jìn)行測(cè)量)。在該調(diào)節(jié)器中的停留時(shí)間是30秒。將該飼料從該調(diào)節(jié)器中導(dǎo)至配備有3.0x35mm水平?jīng)_模的西蒙黑森(simonheesen)壓力機(jī)中并將其壓縮成具有15mm左右的長(zhǎng)度的丸。在壓縮后，將這些丸放置在冷氣機(jī)中并冷卻15分鐘。使用suc-aapf-pna測(cè)定法，在造粒之前測(cè)量蛋白酶活性，并在造粒之后測(cè)量該飼料粒中的蛋白酶活性。通過將粒狀飼料中的蛋白酶活性相對(duì)于非粒狀飼料中的活性相對(duì)比以確定造粒穩(wěn)定性。實(shí)例8：來自兩面神菌屬的s1蛋白酶1的4種變體的表達(dá)制備來自兩面神菌屬的s1蛋白酶1的四種變體，每種包含單個(gè)氨基酸變化。氨基酸變化如下：s68n、t71n、t87q和s90t(編號(hào)基于seqidno:5)。通過使用來自實(shí)例1的原始構(gòu)建體dna作為模板和包含dna變化的引物的pcr，通過將變化摻入wtdna序列(seqidno:1)中來構(gòu)建4種變體。為每個(gè)構(gòu)建體制備兩個(gè)dna片段，并且每個(gè)片段覆蓋基因的一部分和實(shí)例1中所述的上游抑或下游側(cè)翼區(qū)。通過soepcr反應(yīng)將兩個(gè)片段融合在一起，以將2個(gè)片段組裝成一個(gè)線性載體構(gòu)建體。將等分部分的該soepcr產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌中。在每ml補(bǔ)充有6μg氯霉素的lb板上選擇轉(zhuǎn)化體。對(duì)于每種變體，選擇具有包含單個(gè)氨基酸變化的確認(rèn)的正確序列的重組克隆用于在液體培養(yǎng)物中發(fā)酵。收獲包含酶的上清液并如實(shí)例9中所述的將該4種變體酶進(jìn)行純化。實(shí)例9：來自兩面神菌屬變體的s1蛋白酶1的純化將每種變體通過以下程序進(jìn)行純化：將培養(yǎng)液離心(20000xg，20min)并且將上清液小心地與沉淀物潷析分開。將上清液通過nalgene0.2μm過濾單元進(jìn)行過濾，以便去除其余的芽孢桿菌宿主細(xì)胞。將濾液與3.0m(nh4)2so4進(jìn)行1:1混合，以給出最終硫酸銨濃度為1.5m(nh4)2so4。將經(jīng)硫酸銨調(diào)節(jié)的濾液施加到在5mmmes/naoh、50mmh3bo3、1mmcacl2、1.5m(nh4)2so4(ph6.0)中平衡的癸基-瓊脂糖柱(來自u(píng)pfront層析公司(upfrontchromatography))上。在用平衡緩沖液充分地洗滌該柱之后，將蛋白酶用具有30％2-丙醇的10mmmes/naoh、100mmh3bo3、2mmcacl2(ph6.0)進(jìn)行逐步洗脫。收集包含來自兩面神菌屬變體的s1蛋白酶1的洗脫峰并轉(zhuǎn)移到g25葡聚糖凝膠柱(來自ge醫(yī)療集團(tuán))上的20mmch3cooh/naoh，1mmcacl2(ph4.5)。將g25葡聚糖凝膠轉(zhuǎn)移的變體施加至在20mmch3cooh/naoh、1mmcacl2(ph4.5)中平衡的sp-瓊脂糖凝膠ff柱(來自ge醫(yī)療集團(tuán))上。在將柱用平衡緩沖液充分地洗滌之后，將蛋白酶用在相同的緩沖液中的線性nacl梯度(0-->0.5m)洗脫超過四個(gè)柱體積。分析來自柱的部分的蛋白酶活性(在ph7下使用普羅塔酶ak(protazymeak)測(cè)定)并且通過sds-page進(jìn)一步分析主要活性峰部分。將其中僅在考馬斯染色的sds-page凝膠上見到一個(gè)條帶的部分匯集作為純化的制劑并且用于進(jìn)一步表征。實(shí)例10：來自土壤球菌屬(terracoccussp.)的s1蛋白酶1的表達(dá)基于被鑒定為seqidno:10的核苷酸序列，由基因技術(shù)(geneart)(基因技術(shù)生物公司(geneartagbiopark)，約瑟夫-恩格特大街(josef-engert-str.)11號(hào)，93053，雷根斯堡，德國(guó))合成具有seqidno:12的經(jīng)密碼子優(yōu)化的合成基因。如在wo2012/025577中所述，使用clai和mlui限制酶切位點(diǎn)將該合成基因亞克隆進(jìn)芽孢桿菌屬表達(dá)載體中。用克勞氏芽孢桿菌分泌信號(hào)(具有以下氨基酸序列：mkkplgkivastallisvafsssiasa，seqidno:6)代替天然的分泌信號(hào)來表達(dá)該s1蛋白酶1。將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌中。將表達(dá)盒通過同源重組進(jìn)果膠裂解酶基因座中來整合。在每ml補(bǔ)充有6μg氯霉素的lb板上選擇轉(zhuǎn)化體。選擇包含整合的表達(dá)構(gòu)建體的重組體枯草芽孢桿菌克隆并且將其指定為來自土壤球菌屬(terracoccussp.)的s1蛋白酶1。將其在500ml帶擋板的錐形瓶(erlenmeyerflask)中的旋轉(zhuǎn)搖床上培養(yǎng)，每個(gè)錐形瓶包含100ml基于酵母提取物的培養(yǎng)基。將該克隆在30℃下培養(yǎng)3天。收獲包含上清液的酶并如實(shí)施例9中所述的將該酶進(jìn)行純化。實(shí)例11：來自土壤球菌屬(terracoccussp.)的s1蛋白酶1的純化將培養(yǎng)液離心(20000xg，20min)并且將上清液小心地與沉淀物潷析分開。將上清液通過nalgene0.2μm過濾單元進(jìn)行過濾，以便去除其余的芽孢桿菌宿主細(xì)胞。用3％naoh將0.2μm濾液的ph調(diào)節(jié)至ph8.0，并將該溶液施加至在20mmtris/hcl、1mmcacl2(ph8.0)中平衡的mephypercel柱(來自頗爾公司(pallcorporation))上。在將柱用平衡緩沖液充分洗滌后，將蛋白酶用20mmch3cooh/naoh、1mmcacl2(ph4.5)進(jìn)行逐步洗脫。收集包含來自土壤球菌屬(terracoccussp.)的s1蛋白酶1的洗脫峰并用脫礦質(zhì)水稀釋3x以降低導(dǎo)電性。將溶液的ph調(diào)節(jié)至ph4.5并施加到在20mmch3cooh/naoh，1mmcacl2(ph4.5)中平衡的source30s柱(來自ge醫(yī)療集團(tuán))上。在將柱用平衡緩沖液充分地洗滌之后，將蛋白酶用在平衡緩沖液與20mmch3cooh/naoh、1mmcacl2、0.5mnacl(ph4.5)之間的線性梯度洗脫超過五個(gè)柱體積。分析來自柱的部分的蛋白酶活性(使用在ph8下的suc-aapf-pna測(cè)定)，并匯集主要活性峰，并且最后用3％naoh將ph調(diào)節(jié)至ph5.0。經(jīng)ph調(diào)節(jié)的合并物是純化的制劑并且用于進(jìn)一步表征。實(shí)例12：來自土壤球菌屬(terracoccussp.)的s1蛋白酶1(seqidno:14)和來自兩面神菌屬變體的s1蛋白酶1的表征使用suc-aapf-pna測(cè)定來獲得來自土壤球菌屬(terracoccussp.)的s1蛋白酶1的ph-活性曲線和ph-穩(wěn)定性曲線。使用普羅塔酶ak(protazymeak)測(cè)定來獲得來自兩面神菌屬變體的s1蛋白酶1的ph-活性曲線和ph-穩(wěn)定性曲線。對(duì)于ph-穩(wěn)定性曲線，將蛋白酶在不同測(cè)定緩沖液中稀釋8-10x以達(dá)到這些緩沖液的ph值并且然后在37℃下孵育2小時(shí)。在孵育之后，通過稀釋于ph8.0測(cè)定緩沖液中，使該蛋白酶孵育的ph轉(zhuǎn)至與殘余活性測(cè)定之前相同的ph值。使用普羅塔酶ak(protazymeak)測(cè)定法以獲得在ph7.0下的溫度-活性曲線。結(jié)果示于下表6-8中。蛋白酶10r的數(shù)據(jù)包括在這些表中。對(duì)于表6，活性是相對(duì)于酶的最適ph而言。對(duì)于表7，活性是相對(duì)于樣品的殘余活性而言，將這些樣品在穩(wěn)定條件下(5℃，ph8.0或ph9.0)保持。對(duì)于表8，活性相對(duì)于酶在ph7.0或ph6.5下的最佳溫度。使用suc-aapf-pna測(cè)定來獲得蛋白酶10r的ph-活性曲線和ph-穩(wěn)定性曲線，并且使用ph6.5下的普羅塔酶ak(protazymeak)測(cè)定來獲得溫度-活性曲線。表6：ph-活性曲線表7：ph-穩(wěn)定性曲線(在37℃下2小時(shí)之后的殘余活性)表8：在ph7.0或ph6.5下的溫度活性曲線來自土壤球菌屬(terracoccussp.)的s1蛋白酶1的其他特征抑制劑：pmsf。確定n-末端序列為：anvyggq。如通過sds-page確定的相對(duì)分子量是大約mr＝24kda。通過完整分子量分析所確定的分子量是20603.4da((m+h)+)。成熟序列(來自埃德曼n-末端測(cè)序數(shù)據(jù)和完整ms數(shù)據(jù))：anvyggqqiefsgyvcslgfnatrggapvfvtaghcgegyqtfskggttlgstqaysfpgndyaystltsswtgvgavdlydgvnarrvsgysnapvgtaicksgrttgwtcgsvqaknvtvnysnadgststvsgltksntcteggdsggswmastsaqgvtsggagygansvcgqkvgqpniayfqpvdeivsaygltlkts(seqidno:14)來自這一成熟序列的計(jì)算分子量為20601.2da((m+h)+峰的計(jì)算分子量為20602.2da)。實(shí)例13：大豆-玉米粉活性測(cè)定法將如在實(shí)例4中使用大豆-玉米粉作為底物的終點(diǎn)測(cè)定用于獲得在ph3-7下蛋白酶的活性曲線。結(jié)果示于表9和圖5中。來自兩面神菌變體的s1蛋白酶1連同來自土壤球菌屬(terracoccus)的s1蛋白酶1對(duì)大豆-玉米粉的蛋白水解活性隨著ph從ph3增加到ph7而增加，并且在ph3-7的整個(gè)范圍內(nèi)，特別是在ph4-6的范圍內(nèi)的活性顯著高于蛋白酶10r。這些數(shù)據(jù)表明，來自兩面神菌變體的s1蛋白酶1連同來自土壤球菌屬(terracoccus)的s1蛋白酶1具有在蛋白質(zhì)水解中更有效的潛力，例如在反芻動(dòng)物以及單胃動(dòng)物中；例如在ph通常在4和6之間的肉雞的嗉囊中，以及在ph從約2至6變化(這取決于例如飼料、胃區(qū)和喂養(yǎng)后的時(shí)間)的豬的胃中。此外，來自兩面神菌變體s68n和t71n的s1蛋白酶1與來自土壤球菌屬(terracoccus)的s1蛋白酶1在40℃下對(duì)大豆-玉米粉共享非常相似的ph-活性曲線，并且與本領(lǐng)域已知的其他蛋白酶顯著不同。表9：在ph3.0、4.0、5.0、6.0及7.0下對(duì)大豆-玉米粉的蛋白酶活性(od340x稀釋因子)實(shí)例14：來自黃色諾爾氏菌tl1的s1蛋白酶1的表達(dá)來自黃色諾爾氏菌的具有序列seqidno:17(swissprot：a0a0a0jf07)的s1蛋白酶1被表達(dá)為密碼子優(yōu)化的合成基因(seqidno:18)，其中克勞氏芽孢桿菌分泌信號(hào)替換了如實(shí)例10中所述的天然分泌信號(hào)，給出氨基酸序列seqidno:19。該基因由基因技術(shù)(geneart)(基因技術(shù)生物公司(geneartagbiopark)，約瑟夫-恩格特大街(josef-engert-str.)11號(hào)，93053，雷根斯堡，德國(guó))合成。如針對(duì)實(shí)例10所述的來自土壤球菌屬(terracoccussp.)的s1蛋白酶1進(jìn)行克隆和表達(dá)。實(shí)例15：來自黃色諾爾氏菌tl1的s1蛋白酶1的純化將培養(yǎng)液離心(20000xg，20min)并且將上清液小心地與沉淀物潷析分開。將上清液通過nalgene0.2μm過濾單元進(jìn)行過濾，以便去除其余的芽孢桿菌宿主細(xì)胞。用3mtris堿將0.2μm濾液中的ph調(diào)節(jié)至ph8.0，并將經(jīng)ph調(diào)節(jié)的濾液施加至在20mmtris/hcl、1mmcacl2(ph8.0)中平衡的mephypercel柱(來自頗爾公司(pallcorporatio))上。在將柱用平衡緩沖液充分洗滌后，將蛋白酶用20mmch3cooh/naoh、1mmcacl2(ph4.5)進(jìn)行逐步洗脫。收集包含來自黃色諾爾氏菌tl1的s1蛋白酶1的洗脫峰并用脫礦質(zhì)水稀釋3x以降低導(dǎo)電性。將溶液的ph調(diào)節(jié)至ph4.5并施加到在20mmch3cooh/naoh，1mmcacl2(ph4.5)中平衡的source30s柱(來自ge醫(yī)療集團(tuán))上。在將柱用平衡緩沖液充分地洗滌之后，將蛋白酶用在平衡緩沖液與20mmch3cooh/naoh、1mmcacl2、0.5mnacl(ph4.5)之間的線性梯度洗脫超過五個(gè)柱體積。分析來自柱的部分的蛋白酶活性(使用在ph8下的suc-aapm-pna測(cè)定)，并匯集主要活性峰，并且最后用3％naoh將ph調(diào)節(jié)至ph5.5。經(jīng)ph調(diào)節(jié)的合并物是純化的制劑并且用于進(jìn)一步表征。實(shí)例16：來自黃色諾爾氏菌tl1(seqidno:20)的s1蛋白酶1的表征使用suc-aapm-pna測(cè)定來獲得來自黃色諾爾氏菌tl1的s1蛋白酶1的ph-活性曲線和ph-穩(wěn)定性曲線。對(duì)于ph-穩(wěn)定性曲線，將蛋白酶在不同測(cè)定緩沖液中稀釋10x以達(dá)到這些緩沖液的ph值并且然后在37℃下孵育2小時(shí)。在孵育之后，通過稀釋于ph9.0測(cè)定緩沖液中，使該蛋白酶孵育的ph轉(zhuǎn)至與殘余活性測(cè)定之前相同的ph值。使用普羅塔酶ak(protazymeak)測(cè)定法以獲得在ph7.0下的溫度-活性曲線。結(jié)果示于下表10-12中。蛋白酶10r的數(shù)據(jù)包括在這些表中。對(duì)于表10，活性是相對(duì)于酶的最適ph而言。對(duì)于表11，活性是相對(duì)于樣品的殘余活性，將這些樣品保持在穩(wěn)定條件(5℃，ph9.0)下。對(duì)于表12，活性相對(duì)于酶在ph7.0或ph6.5下的最佳溫度。使用suc-aapf-pna測(cè)定來獲得蛋白酶10r的ph-活性曲線和ph-穩(wěn)定性曲線，并且使用ph6.5下的普羅塔酶ak(protazymeak)測(cè)定來獲得溫度-活性曲線。表10：ph-活性曲線表11：ph-穩(wěn)定性曲線(在37℃下2小時(shí)之后的殘余活性)表12：在ph7.0或ph6.5下的溫度活性曲線來自黃色諾爾氏菌tl1的s1蛋白酶1的其他特征抑制劑：pmsf。確定n-末端序列為：anvyggq。如通過sds-page確定的相對(duì)分子量是大約mr＝24kda。通過完整分子量分析確定的分子量是20697.8da。成熟序列(來自埃德曼n-末端測(cè)序數(shù)據(jù)和完整ms數(shù)據(jù))：anvyggqqiefsgyvcslgfnatksgtpvfitaghcaegnqtftrngttlgttrgwsfpgndyayssltsswtgigavdlwngtsarsvtgssnaavgtaicksgrttgwtcgsvqtknvtvnynngdgtystvsgltksntcteggdsggswmagnlaqgvtsggagygsngvcgqkvgqpniayfqpigeilsvygltlkta(seqidno:20)來自這一成熟序列的計(jì)算的分子量是20698.4da。實(shí)例17：大豆-玉米粉活性測(cè)定法將如在實(shí)例4中使用大豆-玉米粉作為底物的終點(diǎn)測(cè)定用于獲得在ph3-7下蛋白酶的活性曲線。結(jié)果示于表13中。來自黃色諾爾氏菌的s1蛋白酶1對(duì)大豆-玉米粉的蛋白水解活性隨著ph從ph3增加到ph7而增加，并且在ph3-7的整個(gè)范圍內(nèi)，特別是在ph4-6的范圍內(nèi)的活性顯著高于蛋白酶10r。這些數(shù)據(jù)表明，來自黃色諾爾氏菌的s1蛋白酶1具有在蛋白質(zhì)水解中更有效的潛力，例如在反芻動(dòng)物以及單胃動(dòng)物中；例如在ph通常在4和6之間的肉雞的嗉囊中，以及在ph從約2至6變化(這取決于例如飼料、胃區(qū)和喂養(yǎng)后的時(shí)間)的豬的胃中。表13：在ph3.0、4.0、5.0、6.0及7.0下對(duì)大豆-玉米粉的蛋白酶活性(od340x稀釋因子)在此描述并且要求保護(hù)的本發(fā)明不局限于在此披露的特定方面的范圍，因?yàn)檫@些方面旨在作為本發(fā)明若干方面的說明。預(yù)期任何等效方面都處于本發(fā)明的范圍內(nèi)。實(shí)際上，除在此所示和描述的那些之外，本發(fā)明的不同修改對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言從前述描述將變得清楚。這樣的修改也旨在落入所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。在有沖突的情況下，以包括定義的本披露為準(zhǔn)。序列表<110>諾維信公司(novozymesa/s)<120>具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽和編碼它們的多核苷酸以及它們?cè)趧?dòng)物飼料方面的應(yīng)用<130>13078-wo-pct<150>ep14191691.6<151>2014-11-04<160>20<170>patentin版本3.5<210>1<211>1212<212>dna<213>兩面神菌屬（janibactersp.）htcc2649<220><221>cds<222>(1)..(1209)<220><221>信號(hào)肽<222>(1)..(90)<220><221>成熟肽<222>(601)..(1209)<400>1atgtctcgcagaagtctcaccgtcctggccggaaccctctcggcc45metserargargserleuthrvalleualaglythrleuserala-200-195-190gctgcagcagcaaccgccctctgcgtcgcgcccgccgcgaacgct90alaalaalaalathralaleucysvalalaproalaalaasnala-185-180-175gcgaaccctggcccgagcggcccgagcagcccgagcaccggaccc135alaasnproglyproserglyproserserproserthrglypro-170-165-160ctggctgtcgactccggtgactccgtcgccgagatgtcggcgcag180leualavalaspserglyaspservalalaglumetseralagln-155-150-145tggctcgcgacggaggagggcctgagcctcgagaccgcccgtgac225trpleualathrglugluglyleuserleugluthralaargasp-140-135-130cgagtggccgctcaggaggggttgtcgcgcacggcgacgtcgctg270argvalalaalaglngluglyleuserargthralathrserleu-125-120-115gagacgtcgctcggcgccaaggccgtcggcacgtggatcgaccag315gluthrserleuglyalalysalavalglythrtrpileaspgln-110-105-100gcgacgggcgtgctccacgtcaacgtcaccgacgccgccgccgcgtcc363alathrglyvalleuhisvalasnvalthraspalaalaalaalaser-95-90-85-80acggtgcgttccgccggggcgagcgcccgtgtcgtcagcgccgacaag411thrvalargseralaglyalaseralaargvalvalseralaasplys-75-70-65tcccggctcgccgcctccgagaaggccgccaccaccgtcgccggcaag459serargleualaalaserglulysalaalathrthrvalalaglylys-60-55-50gacaccatcgcgtcctacgtcgacccggtcaccaacaaggtcatcctc507aspthrilealasertyrvalaspprovalthrasnlysvalileleu-45-40-35acggtgcccgcggatcgcgtcgaggcgacccgcgccaagatcgccgac555thrvalproalaaspargvalglualathrargalalysilealaasp-30-25-20ccgtccgtcacggtcgagggcacgcaggccaaggtctccacccaggcc603proservalthrvalgluglythrglnalalysvalserthrglnala-15-10-5-11aacgtctacggcggccagcagatcgagttcagcggctacgtctgctcg651asnvaltyrglyglyglnglnileglupheserglytyrvalcysser51015ctcggcttcaacgccaccaaggccggcgccccggtcttcatcacggcc699leuglypheasnalathrlysalaglyalaprovalpheilethrala202530ggccactgcggcgagggctaccagaccttctccaagaacggcacgacc747glyhiscysglygluglytyrglnthrpheserlysasnglythrthr354045ctgggcaagacacaggccttctcgttccccggcaacgactacgcctac795leuglylysthrglnalapheserpheproglyasnasptyralatyr50556065tcgaccctcgcgtcgagctggaccggcatcggcgcggtcgacctgtgg843serthrleualasersertrpthrglyileglyalavalaspleutrp707580accggctccgcacgggcggtgacggggtcgagcaacgccgccgtcggc891thrglyseralaargalavalthrglyserserasnalaalavalgly859095accgcgatctgcaagtccggccgcaccacctactggacctgcggctcg939thralailecyslysserglyargthrthrtyrtrpthrcysglyser100105110gtccaggccaagaacgtcaccgtgaactacgacaacggtgacggcacg987valglnalalysasnvalthrvalasntyraspasnglyaspglythr115120125acgagctcggtctcgggcctcacgaagtccaacacctgcaccgagggc1035thrserservalserglyleuthrlysserasnthrcysthrglugly130135140145ggcgactccggcggctcctggatggcgggcaaccttgcccagggcgtg1083glyaspserglyglysertrpmetalaglyasnleualaglnglyval150155160acgagcggcggcgcgggctacggctccagcggagtgtgcggcgagaag1131thrserglyglyalaglytyrglyserserglyvalcysglyglulys165170175gtcggccagcccaacatcgcctacttccagccggtcggcgagatcctc1179valglyglnproasnilealatyrpheglnprovalglygluileleu180185190tccgcctacggcctcaccctcaagacggcctga1212seralatyrglyleuthrleulysthrala195200<210>2<211>403<212>prt<213>兩面神菌屬htcc2649<400>2metserargargserleuthrvalleualaglythrleuserala-200-195-190alaalaalaalathralaleucysvalalaproalaalaasnala-185-180-175alaasnproglyproserglyproserserproserthrglypro-170-165-160leualavalaspserglyaspservalalaglumetseralagln-155-150-145trpleualathrglugluglyleuserleugluthralaargasp-140-135-130argvalalaalaglngluglyleuserargthralathrserleu-125-120-115gluthrserleuglyalalysalavalglythrtrpileaspgln-110-105-100alathrglyvalleuhisvalasnvalthraspalaalaalaalaser-95-90-85-80thrvalargseralaglyalaseralaargvalvalseralaasplys-75-70-65serargleualaalaserglulysalaalathrthrvalalaglylys-60-55-50aspthrilealasertyrvalaspprovalthrasnlysvalileleu-45-40-35thrvalproalaaspargvalglualathrargalalysilealaasp-30-25-20proservalthrvalgluglythrglnalalysvalserthrglnala-15-10-5-11asnvaltyrglyglyglnglnileglupheserglytyrvalcysser51015leuglypheasnalathrlysalaglyalaprovalpheilethrala202530glyhiscysglygluglytyrglnthrpheserlysasnglythrthr354045leuglylysthrglnalapheserpheproglyasnasptyralatyr50556065serthrleualasersertrpthrglyileglyalavalaspleutrp707580thrglyseralaargalavalthrglyserserasnalaalavalgly859095thralailecyslysserglyargthrthrtyrtrpthrcysglyser100105110valglnalalysasnvalthrvalasntyraspasnglyaspglythr115120125thrserservalserglyleuthrlysserasnthrcysthrglugly130135140145glyaspserglyglysertrpmetalaglyasnleualaglnglyval150155160thrserglyglyalaglytyrglyserserglyvalcysglyglulys165170175valglyglnproasnilealatyrpheglnprovalglygluileleu180185190seralatyrglyleuthrleulysthrala195200<210>3<211>1203<212>dna<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<220><221>cds<222>(1)..(1200)<220><221>信號(hào)肽<222>(1)..(81)<220><221>成熟肽<222>(592)..(1200)<400>3atgaagaaaccgttggggaaaattgtcgcaagcaccgcactactc45metlyslysproleuglylysilevalalaserthralaleuleu-195-190-185atttctgttgcttttagttcatcgatagcatcggctgcaaatccg90ileservalalapheserserserilealaseralaalaasnpro-180-175-170ggaccgagcggaccgtcatcaccgtcaacaggaccgctggcagtt135glyproserglyproserserproserthrglyproleualaval-165-160-155gattcaggcgattcagttgcagaaatgtcagcacaatggctggca180aspserglyaspservalalaglumetseralaglntrpleuala-150-145-140acagaagaaggcctgtcactggaaacagcaagagatagagttgca225thrglugluglyleuserleugluthralaargaspargvalala-135-130-125gcacaagaaggactttcaagaacagcaacatcacttgaaacaagc270alaglngluglyleuserargthralathrserleugluthrser-120-115-110cttggcgcaaaagcagttggcacatggattgatcaagcaacaggcgtt318leuglyalalysalavalglythrtrpileaspglnalathrglyval-105-100-95ctgcatgttaatgttacagatgcagcagcagcatcaacagttagatca366leuhisvalasnvalthraspalaalaalaalaserthrvalargser-90-85-80gcaggcgcatcagcaagagttgtttcagcagataaatcaagactggca414alaglyalaseralaargvalvalseralaasplysserargleuala-75-70-65-60gcatcagaaaaagcagcgacaacagttgcaggcaaagatacaattgca462alaserglulysalaalathrthrvalalaglylysaspthrileala-55-50-45tcatatgttgatccggtcacgaacaaagttattctgacagttccggca510sertyrvalaspprovalthrasnlysvalileleuthrvalproala-40-35-30gatagagtcgaagcaacacgcgcaaaaattgcagatccgtcagttaca558aspargvalglualathrargalalysilealaaspproservalthr-25-20-15gttgaaggcacacaagcaaaagtttcaacacaagcgaatgtttatggc606valgluglythrglnalalysvalserthrglnalaasnvaltyrgly-10-5-115ggacagcaaattgaatttagcggctatgtttgctcactgggctttaat654glyglnglnileglupheserglytyrvalcysserleuglypheasn101520gcaacaaaagcaggcgctccggtctttattacagcaggccattgcgga702alathrlysalaglyalaprovalpheilethralaglyhiscysgly253035gaaggctatcaaacattttcaaaaaatggcacaacactgggcaaaaca750gluglytyrglnthrpheserlysasnglythrthrleuglylysthr404550caggcattttcatttccgggaaacgattatgcatattcaacacttgca798glnalapheserpheproglyasnasptyralatyrserthrleuala556065tcaagctggacaggcattggcgcagttgatctgtggacaggctcagcg846sersertrpthrglyileglyalavalaspleutrpthrglyserala70758085agagcagttacaggctcatcaaatgcagcagttggaacagcaatttgc894argalavalthrglyserserasnalaalavalglythralailecys9095100aaaagcggcagaacaacatattggacatgcggctcagttcaagcaaaa942lysserglyargthrthrtyrtrpthrcysglyservalglnalalys105110115aatgtgacagtcaactatgataatggcgacggcacaacatcatcagtt990asnvalthrvalasntyraspasnglyaspglythrthrserserval120125130tcaggccttacaaaaagcaacacatgcacagaaggcggagatagcgga1038serglyleuthrlysserasnthrcysthrgluglyglyaspsergly135140145ggctcatggatggcaggcaatctggcacaaggcgttacatcaggcgga1086glysertrpmetalaglyasnleualaglnglyvalthrserglygly150155160165gcaggatatggctcatcaggcgtctgcggagaaaaagttggacaaccg1134alaglytyrglyserserglyvalcysglyglulysvalglyglnpro170175180aatattgcatattttcaaccggtcggcgaaattctgtcagcatatggc1182asnilealatyrpheglnprovalglygluileleuseralatyrgly185190195ctgacacttaaaacagcataa1203leuthrleulysthrala200<210>4<211>400<212>prt<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>4metlyslysproleuglylysilevalalaserthralaleuleu-195-190-185ileservalalapheserserserilealaseralaalaasnpro-180-175-170glyproserglyproserserproserthrglyproleualaval-165-160-155aspserglyaspservalalaglumetseralaglntrpleuala-150-145-140thrglugluglyleuserleugluthralaargaspargvalala-135-130-125alaglngluglyleuserargthralathrserleugluthrser-120-115-110leuglyalalysalavalglythrtrpileaspglnalathrglyval-105-100-95leuhisvalasnvalthraspalaalaalaalaserthrvalargser-90-85-80alaglyalaseralaargvalvalseralaasplysserargleuala-75-70-65-60alaserglulysalaalathrthrvalalaglylysaspthrileala-55-50-45sertyrvalaspprovalthrasnlysvalileleuthrvalproala-40-35-30aspargvalglualathrargalalysilealaaspproservalthr-25-20-15valgluglythrglnalalysvalserthrglnalaasnvaltyrgly-10-5-115glyglnglnileglupheserglytyrvalcysserleuglypheasn101520alathrlysalaglyalaprovalpheilethralaglyhiscysgly253035gluglytyrglnthrpheserlysasnglythrthrleuglylysthr404550glnalapheserpheproglyasnasptyralatyrserthrleuala556065sersertrpthrglyileglyalavalaspleutrpthrglyserala70758085argalavalthrglyserserasnalaalavalglythralailecys9095100lysserglyargthrthrtyrtrpthrcysglyservalglnalalys105110115asnvalthrvalasntyraspasnglyaspglythrthrserserval120125130serglyleuthrlysserasnthrcysthrgluglyglyaspsergly135140145glysertrpmetalaglyasnleualaglnglyvalthrserglygly150155160165alaglytyrglyserserglyvalcysglyglulysvalglyglnpro170175180asnilealatyrpheglnprovalglygluileleuseralatyrgly185190195leuthrleulysthrala200<210>5<211>203<212>prt<213>兩面神菌屬htcc2649<220><221>成熟多肽<222>(1)..(203)<400>5alaasnvaltyrglyglyglnglnileglupheserglytyrvalcys151015serleuglypheasnalathrlysalaglyalaprovalpheilethr202530alaglyhiscysglygluglytyrglnthrpheserlysasnglythr354045thrleuglylysthrglnalapheserpheproglyasnasptyrala505560tyrserthrleualasersertrpthrglyileglyalavalaspleu65707580trpthrglyseralaargalavalthrglyserserasnalaalaval859095glythralailecyslysserglyargthrthrtyrtrpthrcysgly100105110servalglnalalysasnvalthrvalasntyraspasnglyaspgly115120125thrthrserservalserglyleuthrlysserasnthrcysthrglu130135140glyglyaspserglyglysertrpmetalaglyasnleualaglngly145150155160valthrserglyglyalaglytyrglyserserglyvalcysglyglu165170175lysvalglyglnproasnilealatyrpheglnprovalglygluile180185190leuseralatyrglyleuthrleulysthrala195200<210>6<211>27<212>prt<213>人工序列<220><223>克勞氏芽孢桿菌分泌信號(hào)<400>6metlyslysproleuglylysilevalalaserthralaleuleuile151015servalalapheserserserilealaserala2025<210>7<211>1596<212>dna<213>擬諾卡氏菌（nocardiopsissp.）<220><221>cds<222>(318)..(1463)<220><221>信號(hào)肽<222>(318)..(404)<220><221>成熟肽<222>(900)..(1463)<400>7acgtttggtacgggtaccggtgtccgcatgtggccagaatgcccccttgcgacagggaac60ggattcggtcggtagcgcatcgactccgacaaccgcgaggtggccgttcgcgtcgccacg120ttctgcgaccgtcatgcgacccatcatcgggtgaccccaccgagctctgaatggtccacc180gttctgacggtctttccctcaccaaaacgtgcacctatggttaggacgttgtttaccgaa240tgtctcggtgaacgacaggggccggacggtattcggccccgatcccccgttgatcccccc300aggagagtagggaccccatgcgaccctcccccgttgtctccgccatcggt350metargproserprovalvalseralailegly-190-185acgggagcgctggccttcggtctggcgctgtccggtaccccgggt395thrglyalaleualapheglyleualaleuserglythrprogly-180-175-170gccctcgcggccaccggagcgctcccccagtcacccaccccggag440alaleualaalathrglyalaleuproglnserprothrproglu-165-160-155gccgacgcggtctccatgcaggaggcgctccagcgcgacctcgac485alaaspalavalsermetglnglualaleuglnargaspleuasp-150-145-140ctgacctccgccgaggccgaggagctgctggccgcccaggacacc530leuthrseralaglualaglugluleuleualaalaglnaspthr-135-130-125gccttcgaggtcgacgaggccgcggccgaggccgccggggacgcc575alaphegluvalaspglualaalaalaglualaalaglyaspala-120-115-110tacggcggctccgtcttcgacaccgagagcctggaactgaccgtcctg623tyrglyglyservalpheaspthrgluserleugluleuthrvalleu-105-100-95gtcaccgatgccgccgcggtcgaggccgtggaggccaccggcgccggg671valthraspalaalaalavalglualavalglualathrglyalagly-90-85-80accgagctggtctcctacggcatcgacggtctcgacgagatcgtccag719thrgluleuvalsertyrglyileaspglyleuaspgluilevalgln-75-70-65gagctcaacgccgccgacgccgttcccggtgtggtcggctggtacccg767gluleuasnalaalaaspalavalproglyvalvalglytrptyrpro-60-55-50-45gacgtggcgggtgacaccgtcgtcctggaggtcctggagggttccgga815aspvalalaglyaspthrvalvalleugluvalleugluglysergly-40-35-30gccgacgtcagcggcctgctcgcggacgccggcgtggacgcctcggcc863alaaspvalserglyleuleualaaspalaglyvalaspalaserala-25-20-15gtcgaggtgaccacgagcgaccagcccgagctctacgccgacatcatc911valgluvalthrthrseraspglnprogluleutyralaaspileile-10-5-11ggtggtctggcctacaccatgggcggccgctgttcggtcggcttcgcg959glyglyleualatyrthrmetglyglyargcysservalglypheala5101520gccaccaacgccgccggtcagcccgggttcgtcaccgccggtcactgc1007alathrasnalaalaglyglnproglyphevalthralaglyhiscys253035ggccgcgtgggcacccaggtgaccatcggcaacggcaggggcgtcttc1055glyargvalglythrglnvalthrileglyasnglyargglyvalphe404550gagcagtccgtcttccccggcaacgacgcggccttcgtccgcggtacg1103gluglnservalpheproglyasnaspalaalaphevalargglythr556065tccaacttcacgctgaccaacctggtcagccgctacaacaccggcggg1151serasnphethrleuthrasnleuvalserargtyrasnthrglygly707580tacgccacggtcgccggtcacaaccaggcccccatcggctcctccgtc1199tyralathrvalalaglyhisasnglnalaproileglyserserval859095100tgccgctccggctccaccaccggttggcactgcggcaccatccaggcc1247cysargserglyserthrthrglytrphiscysglythrileglnala105110115cgcggccagtcggtgagctaccccgagggcaccgtcaccaacatgacc1295argglyglnservalsertyrprogluglythrvalthrasnmetthr120125130cggaccaccgtgtgcgccgagcccggcgactccggcggctcctacatc1343argthrthrvalcysalagluproglyaspserglyglysertyrile135140145tccggcacccaggcccagggcgtgacctccggcggctccggcaactgc1391serglythrglnalaglnglyvalthrserglyglyserglyasncys150155160cgcaccggcgggaccaccttctaccaggaggtcacccccatggtgaac1439argthrglyglythrthrphetyrglngluvalthrprometvalasn165170175180tcctggggcgtccgtctccggacctgatccccgcggttccaggcggaccgacgg1493sertrpglyvalargleuargthr185tcgtgacctgagtaccaggcgtccccgccgcttccagcggcgtccgcaccggggtgggac1553cgggcgtggccacggccccacccgtgaccggaccgcccggcta1596<210>8<211>382<212>prt<213>擬諾卡氏菌<400>8metargproserprovalvalseralaileglythrglyalaleu-190-185-180alapheglyleualaleuserglythrproglyalaleualaala-175-170-165thrglyalaleuproglnserprothrproglualaaspalaval-160-155-150sermetglnglualaleuglnargaspleuaspleuthrserala-145-140-135glualaglugluleuleualaalaglnaspthralaphegluval-130-125-120aspglualaalaalaglualaalaglyaspalatyrglyglyser-115-110-105valpheaspthrgluserleugluleuthrvalleuvalthraspala-100-95-90alaalavalglualavalglualathrglyalaglythrgluleuval-85-80-75sertyrglyileaspglyleuaspgluilevalglngluleuasnala-70-65-60alaaspalavalproglyvalvalglytrptyrproaspvalalagly-55-50-45aspthrvalvalleugluvalleugluglyserglyalaaspvalser-40-35-30-25glyleuleualaaspalaglyvalaspalaseralavalgluvalthr-20-15-10thrseraspglnprogluleutyralaaspileileglyglyleuala-5-115tyrthrmetglyglyargcysservalglyphealaalathrasnala101520alaglyglnproglyphevalthralaglyhiscysglyargvalgly25303540thrglnvalthrileglyasnglyargglyvalphegluglnserval455055pheproglyasnaspalaalaphevalargglythrserasnphethr606570leuthrasnleuvalserargtyrasnthrglyglytyralathrval758085alaglyhisasnglnalaproileglyserservalcysargsergly9095100serthrthrglytrphiscysglythrileglnalaargglyglnser105110115120valsertyrprogluglythrvalthrasnmetthrargthrthrval125130135cysalagluproglyaspserglyglysertyrileserglythrgln140145150alaglnglyvalthrserglyglyserglyasncysargthrglygly155160165thrthrphetyrglngluvalthrprometvalasnsertrpglyval170175180argleuargthr185<210>9<211>415<212>prt<213>austwickiachelonaenbrc105200<400>9metasnlysargileglyalathrleualaleuleuserseralaala151015leuleuproalaalaalaproleuthralaglnalaalaaspglulys202530lysserglugluleuserthrileglnglumetseralaglutrpleu354045serlyssertyrglyleuaspglygluglualalysargargvallys505560aspglnaspglyhisalaglnlysalalysaspilegluglyaspleu65707580glyasplysthralaglyserpheileaspglnlysargglylysleu859095valvalthrvalthraspglulysalavalasplysvallysglulys100105110asplysasnalaaspvalargvalvallysasnseralaserlysleu115120125asnaspserlyslysasnalagluasplysvalglyasplysmetala130135140alasertyrvalaspvalgluargasnvalvalvalleuthrvalpro145150155160lysasplysalagluglualalyslysglnvallysaspvalglngly165170175valgluvalglngluvalglualathrileglualaglnalaasnleu180185190tyrglyglyglngluileglnpheglyargservalcysservalgly195200205pheproalathrlysaspglylysasnvalpheilethralaglyhis210215220cysalaalaglyglyglnalapheargargasnglyglnasnleugly225230235240lysprovallystyrasnpheproglyproaspmetalatyrserthr245250255metgluasnglytrpasnglyvalglyalavalasphistrpasngly260265270lysalavalalavalalaglyserglnglualaprovalglyalathr275280285valcyslysserglyargthrthrargtrpthrcysglyvalilegln290295300alalysasnvalthrvalargtyrglylysproglyglyglyglnasp305310315320ilevalargglymetthrglnalaasnvalcyssergluglyglyasp325330335serglyglysertrpilealaglyasnglnalaglnglyvalthrser340345350glyglyalaglytyrglyproasnlyssercysglyglulysvalgly355360365argproasnvalalatyrpheglnproleuasnproileleulysasp370375380tyrglyleulysleuthrthrhisasnglyglylysglyglyglyasp385390395400asnglyglyaspargasnargaspasnarglysglyglyargtyr405410415<210>10<211>1203<212>dna<213>土壤球菌屬（terracoccussp.）<220><221>cds<222>(1)..(1200)<220><221>信號(hào)肽<222>(1)..(78)<220><221>成熟肽<222>(589)..(1200)<400>10atgatccgcaccagtctcaccaccctggccgccacggccgcgatc45metileargthrserleuthrthrleualaalathralaalaile-195-190-185gccaccgcgatcaccgtgatgccggcccaggcatcgaccctcgcg90alathralailethrvalmetproalaglnalaserthrleuala-180-175-170tccgacccgacccccgcgccgacgccagcggcgtccaccgactca135seraspprothrproalaprothrproalaalaserthraspser-165-160-155ggccagtccgtcgccgagatgtcggcgcgctggctcgcgaaggac180glyglnservalalaglumetseralaargtrpleualalysasp-150-145-140cgtgccatcagcctcgccacggctcgccagcgcgtcgcggcccag225argalaileserleualathralaargglnargvalalaalagln-135-130-125gacggacagacccgcacggcggcctcgctcgagcgcgcgctcggc270aspglyglnthrargthralaalaserleugluargalaleugly-120-115-110gcccgggccgcagggtcctacatcgacgccacctccggcgcgctcgtc318alaargalaalaglysertyrileaspalathrserglyalaleuval-105-100-95gtcaacgtcgtcgacaccgcgtccgtcgccagggtgctgtctgccggt366valasnvalvalaspthralaservalalaargvalleuseralagly-90-85-80-75gccgtcgccaaggtcgtcgaccgctcgacgagcgagctgtccgcgacc414alavalalalysvalvalaspargserthrsergluleuseralathr-70-65-60gagcgcgcggcacgcgcacgtgccgggtcggccgtcgtgtcctcctac462gluargalaalaargalaargalaglyseralavalvalsersertyr-55-50-45accgaccccgtcaccaacggcgtcgtcctgaccgtccccagcgcgcgg510thraspprovalthrasnglyvalvalleuthrvalproseralaarg-40-35-30gtctcggaggtccgcagcgaggtcgttggtctcgacggggtgaccgtc558valsergluvalargsergluvalvalglyleuaspglyvalthrval-25-20-15gcaggcaccgacgcacggacgacgacgcaggccaacgtctacggcggc606alaglythraspalaargthrthrthrglnalaasnvaltyrglygly-10-5-115cagcagatcgagttcagcggctacgtctgctcgctcggcttcaacgcc654glnglnileglupheserglytyrvalcysserleuglypheasnala101520acccgcggcggtgctccggtgttcgtcaccgccggccactgtggtgag702thrargglyglyalaprovalphevalthralaglyhiscysglyglu253035ggttaccagaccttcagcaagggaggcacgacgctggggtcgacgcag750glytyrglnthrpheserlysglyglythrthrleuglyserthrgln404550gcgtactccttcccgggcaacgactacgcctactcgaccctgacgtcg798alatyrserpheproglyasnasptyralatyrserthrleuthrser55606570agctggaccggggtcggtgccgtcgacctctacgacggcgtcaacgcc846sertrpthrglyvalglyalavalaspleutyraspglyvalasnala758085cgccgggtctcgggctactcgaacgccccggtcgggaccgcgatctgc894argargvalserglytyrserasnalaprovalglythralailecys9095100aagtcgggccgcacgaccggctggacctgcggctcggtgcaggccaag942lysserglyargthrthrglytrpthrcysglyservalglnalalys105110115aacgtcaccgtcaactacagcaacgccgacggctcgacgagcaccgtg990asnvalthrvalasntyrserasnalaaspglyserthrserthrval120125130agcggcctgacgaagagcaacacctgcaccgagggtggcgactcgggc1038serglyleuthrlysserasnthrcysthrgluglyglyaspsergly135140145150ggctcgtggatggcgagcacgtcggcacagggcgtgacgagcggtggt1086glysertrpmetalaserthrseralaglnglyvalthrserglygly155160165gccggctacggcgccaacagcgtctgcggccagaaggtcggccagccc1134alaglytyrglyalaasnservalcysglyglnlysvalglyglnpro170175180aacatcgcctacttccagcccgtcgacgagatcgtgtcggcctacggc1182asnilealatyrpheglnprovalaspgluilevalseralatyrgly185190195ctgacgctcaagacctcctga1203leuthrleulysthrser200<210>11<211>400<212>prt<213>土壤球菌屬（terracoccussp.）<400>11metileargthrserleuthrthrleualaalathralaalaile-195-190-185alathralailethrvalmetproalaglnalaserthrleuala-180-175-170seraspprothrproalaprothrproalaalaserthraspser-165-160-155glyglnservalalaglumetseralaargtrpleualalysasp-150-145-140argalaileserleualathralaargglnargvalalaalagln-135-130-125aspglyglnthrargthralaalaserleugluargalaleugly-120-115-110alaargalaalaglysertyrileaspalathrserglyalaleuval-105-100-95valasnvalvalaspthralaservalalaargvalleuseralagly-90-85-80-75alavalalalysvalvalaspargserthrsergluleuseralathr-70-65-60gluargalaalaargalaargalaglyseralavalvalsersertyr-55-50-45thraspprovalthrasnglyvalvalleuthrvalproseralaarg-40-35-30valsergluvalargsergluvalvalglyleuaspglyvalthrval-25-20-15alaglythraspalaargthrthrthrglnalaasnvaltyrglygly-10-5-115glnglnileglupheserglytyrvalcysserleuglypheasnala101520thrargglyglyalaprovalphevalthralaglyhiscysglyglu253035glytyrglnthrpheserlysglyglythrthrleuglyserthrgln404550alatyrserpheproglyasnasptyralatyrserthrleuthrser55606570sertrpthrglyvalglyalavalaspleutyraspglyvalasnala758085argargvalserglytyrserasnalaprovalglythralailecys9095100lysserglyargthrthrglytrpthrcysglyservalglnalalys105110115asnvalthrvalasntyrserasnalaaspglyserthrserthrval120125130serglyleuthrlysserasnthrcysthrgluglyglyaspsergly135140145150glysertrpmetalaserthrseralaglnglyvalthrserglygly155160165alaglytyrglyalaasnservalcysglyglnlysvalglyglnpro170175180asnilealatyrpheglnprovalaspgluilevalseralatyrgly185190195leuthrleulysthrser200<210>12<211>1206<212>dna<213>人工序列<220><223>表達(dá)構(gòu)建體<220><221>cds<222>(1)..(1203)<220><221>信號(hào)肽<222>(1)..(81)<220><221>成熟肽<222>(592)..(1203)<400>12atgaagaaaccgttggggaaaattgtcgcaagcaccgcactactc45metlyslysproleuglylysilevalalaserthralaleuleu-195-190-185atttctgttgcttttagttcatcgatcgcatcggcttcaacactg90ileservalalapheserserserilealaseralaserthrleu-180-175-170gcatcagatccgacaccggcacctacaccggcagcaagcacagat135alaseraspprothrproalaprothrproalaalaserthrasp-165-160-155tcaggccaatcagttgcagaaatgtcagcaagatggctggcaaaa180serglyglnservalalaglumetseralaargtrpleualalys-150-145-140gatagagcaatttcactggcaacagcaagacagcgcgttgcagca225aspargalaileserleualathralaargglnargvalalaala-135-130-125caagatggccaaacaagaacagcagcatcactggaaagagcactt270glnaspglyglnthrargthralaalaserleugluargalaleu-120-115-110ggcgcaagagcagcaggctcatatattgatgcaacatcaggcgcactg318glyalaargalaalaglysertyrileaspalathrserglyalaleu-105-100-95gttgttaatgttgttgatacagcaagcgttgcaagagttctgtcagca366valvalasnvalvalaspthralaservalalaargvalleuserala-90-85-80-75ggcgcagttgcaaaagttgtcgatagatcaacatcagaactgagcgca414glyalavalalalysvalvalaspargserthrsergluleuserala-70-65-60acagaaagagcggcaagagcgagagcaggcagcgcagttgtttcatca462thrgluargalaalaargalaargalaglyseralavalvalserser-55-50-45tatacagatccggttacaaatggcgttgttctgacagttccgagcgca510tyrthraspprovalthrasnglyvalvalleuthrvalproserala-40-35-30agagtttcagaagttagaagcgaagttgttggcctggatggcgttaca558argvalsergluvalargsergluvalvalglyleuaspglyvalthr-25-20-15gttgcaggcacagatgcaagaacaacaacacaagcaaatgtttatggc606valalaglythraspalaargthrthrthrglnalaasnvaltyrgly-10-5-115ggacagcagattgaattttcaggctatgtttgctcactgggctttaat654glyglnglnileglupheserglytyrvalcysserleuglypheasn101520gcaacaagaggcggagcaccggtttttgttacagcaggccattgcgga702alathrargglyglyalaprovalphevalthralaglyhiscysgly253035gaaggctatcaaacattttcaaaaggcggaacaacactgggcagcaca750gluglytyrglnthrpheserlysglyglythrthrleuglyserthr404550caagcatattcatttccgggaaacgattatgcatatagcacactgaca798glnalatyrserpheproglyasnasptyralatyrserthrleuthr556065tcatcatggacaggcgttggagcagttgatctgtatgatggcgtcaat846sersertrpthrglyvalglyalavalaspleutyraspglyvalasn70758085gcaagaagagttagcggctattcaaatgcaccggttggcacagcaatt894alaargargvalserglytyrserasnalaprovalglythralaile9095100tgcaaaagcggcagaacaacaggctggacatgcggctcagttcaagca942cyslysserglyargthrthrglytrpthrcysglyservalglnala105110115aaaaatgtcacagtcaattatagcaatgcagatggctcaacatcaaca990lysasnvalthrvalasntyrserasnalaaspglyserthrserthr120125130gtttcaggccttacaaaaagcaacacatgcacagaaggcggagatagc1038valserglyleuthrlysserasnthrcysthrgluglyglyaspser135140145ggaggctcatggatggcatcaacaagcgcacaaggcgttacaagcgga1086glyglysertrpmetalaserthrseralaglnglyvalthrsergly150155160165ggcgcaggctatggcgcaaattcagtttgcggacaaaaagttggacaa1134glyalaglytyrglyalaasnservalcysglyglnlysvalglygln170175180ccgaacattgcatattttcaaccggtcgatgaaattgttagcgcatat1182proasnilealatyrpheglnprovalaspgluilevalseralatyr185190195ggcctgacactgaaaacatcataa1206glyleuthrleulysthrser200<210>13<211>401<212>prt<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>13metlyslysproleuglylysilevalalaserthralaleuleu-195-190-185ileservalalapheserserserilealaseralaserthrleu-180-175-170alaseraspprothrproalaprothrproalaalaserthrasp-165-160-155serglyglnservalalaglumetseralaargtrpleualalys-150-145-140aspargalaileserleualathralaargglnargvalalaala-135-130-125glnaspglyglnthrargthralaalaserleugluargalaleu-120-115-110glyalaargalaalaglysertyrileaspalathrserglyalaleu-105-100-95valvalasnvalvalaspthralaservalalaargvalleuserala-90-85-80glyalavalalalysvalvalaspargserthrsergluleuserala-75-70-65-60thrgluargalaalaargalaargalaglyseralavalvalserser-55-50-45tyrthraspprovalthrasnglyvalvalleuthrvalproserala-40-35-30argvalsergluvalargsergluvalvalglyleuaspglyvalthr-25-20-15valalaglythraspalaargthrthrthrglnalaasnvaltyrgly-10-5-115glyglnglnileglupheserglytyrvalcysserleuglypheasn101520alathrargglyglyalaprovalphevalthralaglyhiscysgly253035gluglytyrglnthrpheserlysglyglythrthrleuglyserthr404550glnalatyrserpheproglyasnasptyralatyrserthrleuthr556065sersertrpthrglyvalglyalavalaspleutyraspglyvalasn70758085alaargargvalserglytyrserasnalaprovalglythralaile9095100cyslysserglyargthrthrglytrpthrcysglyservalglnala105110115lysasnvalthrvalasntyrserasnalaaspglyserthrserthr120125130valserglyleuthrlysserasnthrcysthrgluglyglyaspser135140145glyglysertrpmetalaserthrseralaglnglyvalthrsergly150155160165glyalaglytyrglyalaasnservalcysglyglnlysvalglygln170175180proasnilealatyrpheglnprovalaspgluilevalseralatyr185190195glyleuthrleulysthrser200<210>14<211>204<212>prt<213>土壤球菌屬（terracoccussp.）<220><221>成熟肽<222>(1)..(204)<400>14alaasnvaltyrglyglyglnglnileglupheserglytyrvalcys151015serleuglypheasnalathrargglyglyalaprovalphevalthr202530alaglyhiscysglygluglytyrglnthrpheserlysglyglythr354045thrleuglyserthrglnalatyrserpheproglyasnasptyrala505560tyrserthrleuthrsersertrpthrglyvalglyalavalaspleu65707580tyraspglyvalasnalaargargvalserglytyrserasnalapro859095valglythralailecyslysserglyargthrthrglytrpthrcys100105110glyservalglnalalysasnvalthrvalasntyrserasnalaasp115120125glyserthrserthrvalserglyleuthrlysserasnthrcysthr130135140gluglyglyaspserglyglysertrpmetalaserthrseralagln145150155160glyvalthrserglyglyalaglytyrglyalaasnservalcysgly165170175glnlysvalglyglnproasnilealatyrpheglnprovalaspglu180185190ilevalseralatyrglyleuthrleulysthrser195200<210>15<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>基序vcg[e/q]kvgqp.<220><221>尚未歸類的特征<222>(4)..(4)<223>該保守基序的位置4處的氨基酸是谷氨酸（glu，e）抑或谷氨酰胺（gln，q）。<400>15valcysglyxaalysvalglyglnpro15<210>16<211>1209<212>dna<213>黃色諾爾氏菌（knoelliaflava）<220><221>cds<222>(1)..(1206)<220><221>信號(hào)肽<222>(1)..(87)<220><221>成熟肽<222>(595)..(1206)<400>16atgtctcgcagacgtctcaccgtcctcgccgggggcctctcggcc45metserargargargleuthrvalleualaglyglyleuserala-195-190-185gcggcggcagccaccgccctctgcgtcgcgcccgcgtccgccgcc90alaalaalaalathralaleucysvalalaproalaseralaala-180-175-170acctccgcggcgggcggtccggagccgagcaccggccctctcgcc135thrseralaalaglyglyprogluproserthrglyproleuala-165-160-155accgactcgggcgcgtccgtcgccgagatgtcggcccggtggctc180thraspserglyalaservalalaglumetseralaargtrpleu-150-145-140gccaaggagcacgacctgagcatcgagaccgctcgtgagcggatc225alalysgluhisaspleuserilegluthralaarggluargile-135-130-125gcgtcccaggaggacaagagtcgcaaggccgaggctctcgaacgg270alaserglngluasplysserarglysalaglualaleugluarg-120-115-110tcgctcggcgcgcgagccgtgggctcgttcatcgaccagaccggcggc318serleuglyalaargalavalglyserpheileaspglnthrglygly-105-100-95gtgctcgtcgtcaacgtcaccgacgccgacgccgctgcccgcgtgcag366valleuvalvalasnvalthraspalaaspalaalaalaargvalgln-90-85-80aaggcgggcgcgaccgcccgcgtcgtcaccgaggacaaggcggagctc414lysalaglyalathralaargvalvalthrgluasplysalagluleu-75-70-65ggcgcgtcgcaggcgagggcggtcaaggcgctcggcgccacggtcatc462glyalaserglnalaargalavallysalaleuglyalathrvalile-60-55-50-45gacagctccgtcgacccggtgaccaacaaggtcgtcgtcaccgtgccc510aspserservalaspprovalthrasnlysvalvalvalthrvalpro-40-35-30accgccgacgtcgccgccgcgcgggcgcgcacgagcgacccgtcggtg558thralaaspvalalaalaalaargalaargthrseraspproserval-25-20-15acgatccagggcaccgacgcgacggtgtcgacgcaggccaacgtctat606thrileglnglythraspalathrvalserthrglnalaasnvaltyr-10-5-11ggcgggcagcagatcgagttcagcggctacgtctgctcgctgggcttc654glyglyglnglnileglupheserglytyrvalcysserleuglyphe5101520aacgcgacgaagtccggcaccccggtcttcatcaccgccggccactgc702asnalathrlysserglythrprovalpheilethralaglyhiscys253035gccgaggggaaccagaccttcacgcgcaacggcacgaccctcggcacg750alagluglyasnglnthrphethrargasnglythrthrleuglythr404550acccgcggctggtccttcccgggcaacgactacgcctactcgagcctc798thrargglytrpserpheproglyasnasptyralatyrserserleu556065acctcgagctggaccggcatcggcgccgtcgacctgtggaacggcacg846thrsersertrpthrglyileglyalavalaspleutrpasnglythr707580agcgcgcgctccgtcacgggctcgagcaacgccgccgtcggcaccgcg894seralaargservalthrglyserserasnalaalavalglythrala859095100atctgcaagtcgggccgcacgaccggctggacctgtggctcggtccag942ilecyslysserglyargthrthrglytrpthrcysglyservalgln105110115accaagaacgtcaccgtcaactacaacaacggcgacggcacctactcg990thrlysasnvalthrvalasntyrasnasnglyaspglythrtyrser120125130accgtgagcggcctgacgaagtccaacacctgcaccgagggtggcgac1038thrvalserglyleuthrlysserasnthrcysthrgluglyglyasp135140145tccggcggctcgtggatggcgggcaacctcgcccagggcgtgacgagc1086serglyglysertrpmetalaglyasnleualaglnglyvalthrser150155160ggcggcgccggctacggctccaacggcgtctgcggccagaaggtcggc1134glyglyalaglytyrglyserasnglyvalcysglyglnlysvalgly165170175180cagcccaacatcgcctacttccagccgatcggcgagatcctctccgtc1182glnproasnilealatyrpheglnproileglygluileleuserval185190195tacggcctcaccctcaagaccgcctga1209tyrglyleuthrleulysthrala200<210>17<211>402<212>prt<213>黃色諾爾氏菌<400>17metserargargargleuthrvalleualaglyglyleuserala-195-190-185alaalaalaalathralaleucysvalalaproalaseralaala-180-175-170thrseralaalaglyglyprogluproserthrglyproleuala-165-160-155thraspserglyalaservalalaglumetseralaargtrpleu-150-145-140alalysgluhisaspleuserilegluthralaarggluargile-135-130-125alaserglngluasplysserarglysalaglualaleugluarg-120-115-110serleuglyalaargalavalglyserpheileaspglnthrglygly-105-100-95valleuvalvalasnvalthraspalaaspalaalaalaargvalgln-90-85-80lysalaglyalathralaargvalvalthrgluasplysalagluleu-75-70-65glyalaserglnalaargalavallysalaleuglyalathrvalile-60-55-50-45aspserservalaspprovalthrasnlysvalvalvalthrvalpro-40-35-30thralaaspvalalaalaalaargalaargthrseraspproserval-25-20-15thrileglnglythraspalathrvalserthrglnalaasnvaltyr-10-5-11glyglyglnglnileglupheserglytyrvalcysserleuglyphe5101520asnalathrlysserglythrprovalpheilethralaglyhiscys253035alagluglyasnglnthrphethrargasnglythrthrleuglythr404550thrargglytrpserpheproglyasnasptyralatyrserserleu556065thrsersertrpthrglyileglyalavalaspleutrpasnglythr707580seralaargservalthrglyserserasnalaalavalglythrala859095100ilecyslysserglyargthrthrglytrpthrcysglyservalgln105110115thrlysasnvalthrvalasntyrasnasnglyaspglythrtyrser120125130thrvalserglyleuthrlysserasnthrcysthrgluglyglyasp135140145serglyglysertrpmetalaglyasnleualaglnglyvalthrser150155160glyglyalaglytyrglyserasnglyvalcysglyglnlysvalgly165170175180glnproasnilealatyrpheglnproileglygluileleuserval185190195tyrglyleuthrleulysthrala200<210>18<211>1200<212>dna<213>人工序列<220><223>密碼子優(yōu)化的合成基因<220><221>cds<222>(1)..(1200)<220><221>信號(hào)肽<222>(1)..(81)<220><221>成熟肽<222>(589)..(1200)<400>18atgaagaaaccgttggggaaaattgtcgcaagcaccgcactactc45metlyslysproleuglylysilevalalaserthralaleuleu-195-190-185atttctgttgcttttagttcatcgatcgcatcggctgctacatct90ileservalalapheserserserilealaseralaalathrser-180-175-170gcagctggtggcccagaaccatcaactggcccacttgctacagat135alaalaglyglyprogluproserthrglyproleualathrasp-165-160-155tctggcgcttcagttgccgagatgtcagcacgctggcttgcgaaa180serglyalaservalalaglumetseralaargtrpleualalys-150-145-140gaacacgatctttcaattgagactgcacgtgagcgcatcgctagc225gluhisaspleuserilegluthralaarggluargilealaser-135-130-125caggaagacaaatctcgcaaggctgaagctcttgaacgctcactt270glngluasplysserarglysalaglualaleugluargserleu-120-115-110ggcgctcgtgctgttggcagctttatcgaccaaactggcggtgtattg318glyalaargalavalglyserpheileaspglnthrglyglyvalleu-105-100-95gtagtaaacgttactgatgcggatgcagcagctcgcgttcaaaaggca366valvalasnvalthraspalaaspalaalaalaargvalglnlysala-90-85-80-75ggagctacagctcgtgttgttactgaggataaggctgaacttggcgct414glyalathralaargvalvalthrgluasplysalagluleuglyala-70-65-60tctcaagctcgtgctgttaaggctcttggtgccactgtaattgatagc462serglnalaargalavallysalaleuglyalathrvalileaspser-55-50-45tcagttgaccctgtaacgaacaaagttgtagttacagtacctactgct510servalaspprovalthrasnlysvalvalvalthrvalprothrala-40-35-30gatgttgcggcagcacgtgcacgtacaagcgacccatctgtaactatt558aspvalalaalaalaargalaargthrseraspproservalthrile-25-20-15caaggaacagacgcaacggtttctacacaggctaacgtttatggtggc606glnglythraspalathrvalserthrglnalaasnvaltyrglygly-10-5-115cagcagatcgagttctctggatacgtatgttcattaggtttcaacgca654glnglnileglupheserglytyrvalcysserleuglypheasnala101520actaaatctggaactcctgttttcatcacagctggccattgtgcggaa702thrlysserglythrprovalpheilethralaglyhiscysalaglu253035ggtaaccagactttcactcgtaatggtacaacattgggtacaacacgc750glyasnglnthrphethrargasnglythrthrleuglythrthrarg404550ggttggtcttttccaggtaacgattatgcgtactcatctcttacttct798glytrpserpheproglyasnasptyralatyrserserleuthrser55606570tcttggactggtattggagctgttgacttatggaatggaacatcagct846sertrpthrglyileglyalavalaspleutrpasnglythrserala758085cgctctgtaactggctcatcaaacgctgctgttggaactgcaatttgc894argservalthrglyserserasnalaalavalglythralailecys9095100aaatctggtcgtacaacgggatggacatgtggttctgtacaaacgaaa942lysserglyargthrthrglytrpthrcysglyservalglnthrlys105110115aacgtaactgtaaactataacaacggagatggtacatattctactgta990asnvalthrvalasntyrasnasnglyaspglythrtyrserthrval120125130tctggtcttacaaaaagcaatacttgcactgaaggtggagattcaggc1038serglyleuthrlysserasnthrcysthrgluglyglyaspsergly135140145150ggttcttggatggctggcaacttagcacaaggtgtaactagcggtggt1086glysertrpmetalaglyasnleualaglnglyvalthrserglygly155160165gctggctatggtagcaatggagtatgtggccagaaagtaggtcaaccg1134alaglytyrglyserasnglyvalcysglyglnlysvalglyglnpro170175180aacattgcttactttcagcctatcggtgaaatcttgtctgtttatggt1182asnilealatyrpheglnproileglygluileleuservaltyrgly185190195cttacattgaaaacagct1200leuthrleulysthrala200<210>19<211>400<212>prt<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>19metlyslysproleuglylysilevalalaserthralaleuleu-195-190-185ileservalalapheserserserilealaseralaalathrser-180-175-170alaalaglyglyprogluproserthrglyproleualathrasp-165-160-155serglyalaservalalaglumetseralaargtrpleualalys-150-145-140gluhisaspleuserilegluthralaarggluargilealaser-135-130-125glngluasplysserarglysalaglualaleugluargserleu-120-115-110glyalaargalavalglyserpheileaspglnthrglyglyvalleu-105-100-95valvalasnvalthraspalaaspalaalaalaargvalglnlysala-90-85-80-75glyalathralaargvalvalthrgluasplysalagluleuglyala-70-65-60serglnalaargalavallysalaleuglyalathrvalileaspser-55-50-45servalaspprovalthrasnlysvalvalvalthrvalprothrala-40-35-30aspvalalaalaalaargalaargthrseraspproservalthrile-25-20-15glnglythraspalathrvalserthrglnalaasnvaltyrglygly-10-5-115glnglnileglupheserglytyrvalcysserleuglypheasnala101520thrlysserglythrprovalpheilethralaglyhiscysalaglu253035glyasnglnthrphethrargasnglythrthrleuglythrthrarg404550glytrpserpheproglyasnasptyralatyrserserleuthrser55606570sertrpthrglyileglyalavalaspleutrpasnglythrserala758085argservalthrglyserserasnalaalavalglythralailecys9095100lysserglyargthrthrglytrpthrcysglyservalglnthrlys105110115asnvalthrvalasntyrasnasnglyaspglythrtyrserthrval120125130serglyleuthrlysserasnthrcysthrgluglyglyaspsergly135140145150glysertrpmetalaglyasnleualaglnglyvalthrserglygly155160165alaglytyrglyserasnglyvalcysglyglnlysvalglyglnpro170175180asnilealatyrpheglnproileglygluileleuservaltyrgly185190195leuthrleulysthrala200<210>20<211>204<212>prt<213>黃色諾爾氏菌<220><221>成熟肽<222>(1)..(204)<400>20alaasnvaltyrglyglyglnglnileglupheserglytyrvalcys151015serleuglypheasnalathrlysserglythrprovalpheilethr202530alaglyhiscysalagluglyasnglnthrphethrargasnglythr354045thrleuglythrthrargglytrpserpheproglyasnasptyrala505560tyrserserleuthrsersertrpthrglyileglyalavalaspleu65707580trpasnglythrseralaargservalthrglyserserasnalaala859095valglythralailecyslysserglyargthrthrglytrpthrcys100105110glyservalglnthrlysasnvalthrvalasntyrasnasnglyasp115120125glythrtyrserthrvalserglyleuthrlysserasnthrcysthr130135140gluglyglyaspserglyglysertrpmetalaglyasnleualagln145150155160glyvalthrserglyglyalaglytyrglyserasnglyvalcysgly165170175glnlysvalglyglnproasnilealatyrpheglnproileglyglu180185190ileleuservaltyrglyleuthrleulysthrala195200當(dāng)前第1頁(yè)12當(dāng)前第1頁(yè)12