本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種約氏乳桿菌在誘食中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
約氏乳桿菌(Lactobacillus johnsonii)屬于厚壁菌門(Firmicutes)芽孢桿菌綱(Bacilli)乳桿菌目(Lactobacillales)乳桿菌科(Lactobacillaceae)乳桿菌屬(Lactobacillus)。歐盟食品安全局(EFSA)會(huì)分別于2009年和2011年三次發(fā)布了針對(duì)約氏乳桿菌的健康申明，申明指出約氏乳桿菌具有減少腸道內(nèi)病原菌的微生物，增強(qiáng)天然防御和免疫系統(tǒng)和保持皮膚健康。并且歐盟對(duì)約氏乳桿菌進(jìn)行了安全資格認(rèn)定(qualified presumption of safety,QPS)批準(zhǔn)其在飼料和食品中使用。2010年我國(guó)衛(wèi)生部辦公廳將約氏乳桿菌收錄到《可用于食品的菌種名單》中，批準(zhǔn)其作為具有益生功能的食品添加劑使用。
在增加南美白對(duì)蝦誘食劑方面，目前市場(chǎng)相關(guān)產(chǎn)品種類多樣，但是效果不明顯，多以以香味物質(zhì)“引誘”為主，提高采食量?jī)H在10％以內(nèi)。市場(chǎng)上相關(guān)誘食主要分為如下幾種：氨基酸類、動(dòng)植物提取物、生物堿、含硫化合物、中藥類、脂肪酸等等。目前，國(guó)家已經(jīng)明文規(guī)定，禁止諸如DMPT等化學(xué)誘食劑使用。因此，開發(fā)綠色、高效的蝦類誘食產(chǎn)品是必要的。乳酸菌用于水產(chǎn)行業(yè)已有先例，有的作為飼料添加劑，有的作為水質(zhì)改良劑，有的作為微生態(tài)改良劑，但是用于對(duì)蝦誘食，尚無先例。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為了解決上述問題，本發(fā)明提供約氏乳桿菌CGMCC No.4926在 對(duì)蝦誘食方面的應(yīng)用。
本發(fā)明的約氏乳桿菌(Lactobacillus johnsonii)，是通過體外耐酸和耐膽鹽篩選得到的一株具有益生功能的約氏乳桿菌，命名為約氏乳桿菌(Lactobacillus johnsonii)YS-12，并于2011年6月8日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物保藏中心進(jìn)行了保藏，保藏號(hào)為CGMCC No.4926。
其中，所述的約氏乳桿菌YS-12的篩選過程如下：
(1)收集菌種
截取健康豬結(jié)腸后半段，用生理鹽水沖洗三次，用牙簽多次掛取腸道上皮上的附著物，放入10mL的生理鹽水中，作為樣品原液，對(duì)原液進(jìn)行10倍梯度稀釋。
(2)菌種培養(yǎng)
將每個(gè)稀釋度，取100微升涂布于MRS平板上，37℃倒置培養(yǎng)24小時(shí)。
(3)菌種鑒定
挑取平板上的單菌落進(jìn)行對(duì)其16S rRNA進(jìn)行菌落PCR鑒定，通過在數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其16S序列(GenBank登錄號(hào)：HQ641209)，進(jìn)一步通過理化實(shí)驗(yàn)證實(shí)其為約氏乳桿菌。
(4)菌種篩選
1)將菌體重懸于PBS液后，梯度稀釋至10-2，用移液器吸取10-2稀釋液100微升分別加入900微升0.3％的膽鹽溶液和PBS(對(duì)照)中，37℃保溫3小時(shí)。
2)將菌體重懸于PBS液后，梯度稀釋至10-2，用移液器吸取10-2稀釋液100微升分別加入900微升pH3.0的緩沖液和PBS(對(duì)照)中，37℃保溫3小時(shí)。
3)將酸處理過的菌液繼續(xù)稀釋至10-5，取10-3、10-4、10-5三個(gè)稀釋度(對(duì)照組稀釋至10-6，取10-4、10-5、10-6)各0.1ml涂布MRS平板，37℃倒置培養(yǎng)48小時(shí)。挑取耐受性菌株進(jìn)行反復(fù)篩選，得到耐酸和耐膽鹽性能優(yōu)良的約氏乳桿菌。
(5)菌種保藏
將篩選得到的約氏乳桿菌(Lactobacillus johnsonii)YS-12保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，獲得保藏號(hào)為CGMCC No.4926。
將本發(fā)明的約氏乳桿菌CGMCC No.4926發(fā)酵液以適當(dāng)?shù)膭┝颗c飼料混合，可增加對(duì)蝦采食量和加快蝦吃料速度。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，將所述的約氏乳桿菌制劑與飼料混合，優(yōu)選的，每公斤飼料拌入約氏乳桿菌制劑25ml～50ml。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的約氏乳桿菌制劑可為本領(lǐng)域常規(guī)制劑，優(yōu)選為約氏乳桿菌發(fā)酵液。
優(yōu)選的，所述的約氏乳桿菌發(fā)酵液中約氏乳桿菌的活菌數(shù)為 1010cfu/ml。
其中，所述約氏乳桿菌發(fā)酵液的制備培養(yǎng)基為MRS液體培養(yǎng)基。
其中，所述的飼料為對(duì)蝦飼料。
其中，所述飼料由魚粉、豆粕、膨化大豆、花生粕、玉米蛋白粉、血球蛋白粉、面粉、蝦殼粉、啤酒酵母、魷魚膏、魚油、磷脂油、氯化膽堿、磷酸二氫鈣、防霉劑、抗氧化劑、脫殼素、預(yù)混料制成，優(yōu)選地，所述飼料由魚粉16％、豆粕20.3％、膨化大豆4％、花生粕21.05％、玉米蛋白粉3％、血球蛋白粉3％、面粉19.87％、蝦殼粉2％、啤酒酵母5％、魷魚膏1.5％、魚油0.8％、磷脂油2.4％、氯化膽堿0.3％、磷酸二氫鈣1％、防霉劑0.05％、抗氧化劑0.03％、脫殼素0.01％、預(yù)混料5％制成。
其中，預(yù)混料為本領(lǐng)域常規(guī)的對(duì)蝦預(yù)混料，可市售獲得。
其中，所述約氏乳桿菌發(fā)酵液的制備方法如下：
1)將冷凍保存的約氏乳桿菌CGMCC No.4926在MRS瓊脂平板活化三次，挑取單菌落接種于10mL深層MRS液體試管，37℃培養(yǎng)10小時(shí)后，以1％接種量轉(zhuǎn)接于250mL MRS液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)8～10小時(shí)后作為種子液；
2)以5％～10％的接種量將步驟1)所得的種子液接種于5L的發(fā)酵罐中培養(yǎng)；
3)發(fā)酵過程中維持發(fā)酵液pH值為6.0～6.5，當(dāng)pH超過設(shè)定值時(shí)，補(bǔ)加料液；當(dāng)pH低于設(shè)定值時(shí)，自動(dòng)流加堿性中和劑氨水、KOH、NaOH中的任一種；在溫度37～39℃、轉(zhuǎn)速100rpm條件下發(fā)酵10～14小時(shí)，發(fā)酵過程不通氣或通入N2，維持溶氧小于1％；
4)當(dāng)補(bǔ)加料液pH不再降低或發(fā)酵液在600nm波長(zhǎng)下的吸光值(即OD600)不再增加時(shí)，終止發(fā)酵，即得約氏乳桿菌活菌數(shù)達(dá)1010cfu/ml以上的發(fā)酵液。
本發(fā)明還提供一種促進(jìn)對(duì)蝦采食量和加快對(duì)蝦吃料速度的方法，其將約氏乳桿菌CGMCC No.4926制劑拌飼料，每升約氏乳桿菌拌飼料30kg～50kg，更優(yōu)選以每升約氏乳桿菌發(fā)酵液拌40kg飼料。
與未拌約氏乳桿菌CGMCC No.4926的對(duì)照相比，約氏乳桿菌制劑可以增加對(duì)蝦采食量一倍左右，能顯著增加對(duì)蝦吃料的速度。與現(xiàn)有的誘食劑相比，誘食效率更好。
本發(fā)明中的約氏乳桿菌(Lactobacillus johnsonii)YS-12保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，100101)保藏，保藏日期為2011年6月8日，保藏號(hào)為CGMCC No.4926。
具體實(shí)施方式
以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1約氏乳桿菌CGMCC No.4926發(fā)酵液的制備
1)將冷凍保存的約氏乳桿菌CGMCC No.4926在MRS瓊脂平板活化三次，挑取單菌落接種于10mL深層MRS液體試管，37℃培養(yǎng)10小時(shí)后，以1％接種量轉(zhuǎn)接于250mL MRS液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)10小時(shí)后作為種子液；
2)以5％的接種量將步驟1)所得的種子液接種于5L的發(fā)酵罐中培養(yǎng)；
3)發(fā)酵過程中維持發(fā)酵液pH值為6.0，當(dāng)pH超過設(shè)定值時(shí)，補(bǔ)加料液；當(dāng)pH低于設(shè)定值時(shí)，自動(dòng)流加堿性中和劑氨水；在溫度37℃、轉(zhuǎn)速100rpm條件下發(fā)酵14小時(shí)，發(fā)酵過程通入N2，維持溶氧小于1％；
4)當(dāng)補(bǔ)加料液pH不再降低或發(fā)酵液在600nm波長(zhǎng)下的吸光值(即OD600)不再增加時(shí)，終止發(fā)酵，即得約氏乳桿菌活菌數(shù)達(dá)1011cfu/ml以上的發(fā)酵液。
實(shí)施例2約氏乳桿菌在南美白對(duì)蝦誘食中的應(yīng)用
1、試驗(yàn)材料
基礎(chǔ)飼料：由魚粉16％、豆粕20.3％、膨化大豆4％、花生粕21.05％、玉米蛋白粉3％、血球蛋白粉3％、面粉19.87％、蝦殼粉2％、啤酒酵母5％、魷魚膏1.5％、魚油0.8％、磷脂油2.4％、氯化膽堿0.3％、磷酸二氫鈣1％、防霉劑0.05％、抗氧化劑0.03％、脫殼素0.01％，預(yù)混料5％組成，經(jīng)飼料加工設(shè)備制成顆粒料。
誘食物質(zhì)：約氏乳桿菌制劑、DMPT(二甲基-β-乙酸噻亭)、甘氨酸
2、試驗(yàn)設(shè)計(jì)
2個(gè)玻璃水族箱(1.0m×0.5m×0.5m)并排放置,相互之間以暗色隔板相隔,使其相互沒有干擾。每個(gè)箱中放大約240L水，水溫保持在25℃，NH3-N<0.5mg/L，DO>5mg/L，12小時(shí)光照,每個(gè)水族箱的光度一致。正式試驗(yàn)前24h,在每個(gè)水族箱中隨機(jī)放入20尾南美白對(duì)蝦，使其能夠完全適應(yīng)周圍的環(huán)境,操作時(shí)沒有驚跳反應(yīng)。
(1)約氏乳桿菌制劑與DMPT、甘氨酸誘食效果對(duì)比：
誘食物質(zhì)均用蒸餾水提前配制成溶液，以基礎(chǔ)飼料為對(duì)照組，在基礎(chǔ)飼料中分別拌料添加50mL/kg約氏乳桿菌制劑、DMPT、甘氨酸作為試驗(yàn)組。在每個(gè)水族箱左右兩邊分別放置1000粒對(duì)照餌料和試驗(yàn)餌料,且兩箱中飼料互換位置。在距水族箱中央1.5m處設(shè)置攝像機(jī),記錄南美白對(duì)蝦對(duì)飼料的反應(yīng)時(shí)間。從第一次反應(yīng)時(shí)間開始計(jì)時(shí),記錄10min內(nèi)南美白對(duì)蝦啄咬并吞食的飼料顆粒數(shù),以此作為評(píng)定指標(biāo)。每個(gè)試驗(yàn)試劑重復(fù)4次。試驗(yàn)結(jié)束后,將試驗(yàn)水槽清洗干凈,用酒精擦洗一遍,以保證不受其他試驗(yàn)液的干擾,等酒精揮發(fā)干凈后注入蓄水池新水。換另一批蝦重新試驗(yàn)。依次循環(huán)。
(2)約氏乳桿菌制劑不同添加量對(duì)南美白對(duì)蝦的誘食效果：
以基礎(chǔ)飼料為對(duì)照組，在基礎(chǔ)飼料中分別拌料添加20、35、 50、65mL/kg約氏乳桿菌發(fā)酵液。試驗(yàn)方法與1.2.1的方法相同，記錄南美白對(duì)蝦對(duì)飼料的反應(yīng)時(shí)間和10min內(nèi)對(duì)蝦啄咬并吞食的飼料顆粒數(shù)。
3、試驗(yàn)結(jié)果
(1)約氏乳桿菌制劑與DMPT、甘氨酸誘食效果
由表1可以看出，3種誘食物質(zhì)對(duì)南美白對(duì)蝦的誘食效果差異很大，對(duì)南美白對(duì)蝦的促攝食作用也有所不同。其中約氏乳桿菌制劑的作用最強(qiáng)烈，表現(xiàn)出最短的第一反應(yīng)時(shí)間和最多的吞食顆粒數(shù)。DMPT、甘氨酸的作用次之。
表1、約氏乳桿菌制劑與DMPT、甘氨酸誘食效果
(2)約氏乳桿菌制劑不同添加量對(duì)南美白對(duì)蝦的誘食效果
表2約氏乳桿菌制劑不同添加量對(duì)南美白對(duì)蝦的誘食效果
有表2可以看出添加量在50ml/kg以下時(shí)，隨著約氏乳桿菌制劑添加量的增加，第一反應(yīng)時(shí)間依次減少，吞食數(shù)量依次增加，誘食效果逐漸增強(qiáng)。當(dāng)添加量超過50ml/kg時(shí)，誘食效果增加不明顯。因此約氏乳桿菌制劑在南美白對(duì)蝦誘食中的最適劑量為50ml/kg。
以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù) 范圍。