本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)領(lǐng)域中的水產(chǎn)養(yǎng)殖技術(shù)領(lǐng)域和生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種利用枯草芽孢桿菌制備的微生物脂肽-表面素(surfactin)的生產(chǎn)方法及其在水產(chǎn)飼料中的應用。

背景技術(shù)：

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)生產(chǎn)的二次代謝產(chǎn)物有β-內(nèi)酰胺(β-lactams)、胺基糖苷(aminoglycoside)、聚乙酰胺衍生物(polyketides)和小型多勝肽(small polypeptides)，其中以脂肽與脂蛋白類(lipopeptides and lipoproteins)較受到矚目，因為脂肽與脂蛋白類具有抗菌效果，又被稱為抗菌勝肽(Antimicrobial Peptide，AMP)。

目前發(fā)現(xiàn)的抗菌勝肽可分為三家族，其一為豐原素(Fengycin)，分子中由十個胺基酸分子組成環(huán)狀勝肽鏈，在勝肽鏈N端接上14到18個不等的脂肪酸支鏈，具有良好的抗真菌能力，但對于酵母菌與細菌沒有明顯的效果(Schneider et al.,1999)；另一個為伊枯草芽孢桿菌素(Iturin)，含有七個α-胺基酸環(huán)接耦合至β-胺基酸與烷基鏈，在勝肽鏈上接有14到17個不等的脂肪酸支鏈，分子量大小約1044～1081kD，功能為對抗真菌及細菌，具有生物降解性、高表面活性與低毒性等優(yōu)點(Bonmatin,Laprevote,&Peypoux,2003)；第三個則為本發(fā)明所探討的表面素(Surfactin)，其含有7個環(huán)狀胺基酸與13到16個不等的脂肪酸支鏈，枯草芽孢桿菌在生產(chǎn)表面素時，通常會伴隨著一枯草芽孢桿菌素出現(xiàn)，當兩種抗菌勝肽共同存在時，會因為混合微胞對細胞擁有高親和力，使得紅血球溶血率增加，因此也會增加抗真菌的活性(Feignier,Besson,&Michel,1995；R Maget-Dana,Thimon,Peypoux,&Ptak,1992；Sandrin,Peypoux,&Michel,1990)。

Arima等人于1968年在枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)一個白色針狀結(jié)晶，因其具有界面活性故將其命名為表面素(Kakinuma,Hori,Isono,Tamura,&Arima,1969)。在過去的研究指出，當在水中含有20μM的表面素，其可將水溶液的表面張力由72mN/m降至27mN/m，是目前發(fā)現(xiàn)界面活性最佳的生物界面活性劑(Arima,Kakinuma,&Tamura,1968)。表面素是一個環(huán)型的脂勝肽，其含有7個環(huán)狀胺基酸與13到16個不 等的脂肪酸支鏈(Kakinuma,Sugino,Isono,Tamura,&Arima,1969)。在溶液中，脂肪酸碳鏈呈疏水特性，而環(huán)狀的胺基酸則為親水端，胺基酸中的天門冬胺酸(aspartic acid)及麩胺酸(glutamic acid)皆帶負電，兩個帶負電的胺基酸會形成鉗狀，使表面素分子形成帶負電的馬鞍結(jié)構(gòu)，屬于陰離子生物界面活性劑的一員(Tsan,Volpon,Besson,&Lancelin,2007)，根據(jù)胺基酸序列的不同，可將表面素分四種類型：A、B、C、D。其主要差別在于環(huán)狀胺基酸后所接的脂肪酸碳鏈數(shù)的不同(Shaligram&Singhal,2010；Singh&Cameotra,2004)。

由于表面素的非專一性的生物活性，使它可以藉由降低表面張力來破壞細菌的細胞膜，且不會造成抗藥性，因此被認為具有抗菌的潛力，而被歸類為抗菌脂肽的一員(Cho,Lee,Cha,Kim,&Shin,2003)。在過去的研究指出表面素可以抑制真菌、霉?jié){菌、格蘭氏陰性菌與革蘭氏陽性菌的生長(P.Das,Mukherjee,&Sen,2008；Singh&Cameotra,2004)；Heiko等人發(fā)現(xiàn)當表面素濃度在12～50μg/ml即具有殺菌能力(Heerklotz&Seelig,2001)；海洋中的Bacillus circulans所產(chǎn)生的脂肽生物界面活性劑(lipopeptide biosurfactant)，對于少數(shù)的抗多種藥物菌株(multidrug-resistant strain，MDR)以及抗青霉素金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)具有抑制的效果(Pan et al.,2007)；表面素也具有抗霉?jié){菌的特性，可恢復被霉?jié){菌污染的細胞的型態(tài)特征，且對于細胞新陳代謝和增殖不會產(chǎn)生傷害(Vollenbroich,Pauli,Ozel,&Vater,1997)；經(jīng)由電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)表面素會使霉?jié){菌的膜形成穿孔現(xiàn)象，此時會導致霉?jié){菌內(nèi)外滲透壓不平衡而死亡(Régine Maget-Dana&Ptak,1995)。

目前的研究認為表面素的抗病毒機制是藉由病毒的脂質(zhì)外套膜和表面素的物理化學作用后，造成病毒外套膜及蛋白質(zhì)外殼結(jié)構(gòu)崩裂，并且抑制病毒核酸物質(zhì)進行復制(Vollenbroich,,Vater,Kamp,&Pauli,1997)。過去研究指出表面素能對抗好幾種病毒，包括人類后天免疫不全病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)、豬皰疹病毒第一型(Suid Herpes virus type 1，SHV-1)、單純皰疹病毒第一型(Herpes Simplex Virus 1，HSV-2)、濾泡性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus，VSV)、猿猴免疫缺陷病毒(Simian Immunodeficiency Virus，SIV)、貓流感病毒(Feline Calicivirus，F(xiàn)CV)、鼠腦心肌炎病毒(Murine Encephalomyocarditis Virus，MECV)、偽狂犬病毒(Pseudorabies Virus，PRV)、豬細小病毒(Porcine Parvovirus，PPV)、新城雞瘟病毒(Newcastle Disease Virus，NDV)、傳染性法式囊癥病毒(Infectious Bursal Disease Virus，IBDV)(Huang et al.,2006；Itokawa et al.,1994； Vollenbroich,,et al.,1997)。

抗生素抗菌機制是抗生素與病原體特定部位的受體結(jié)合，使病原體的正常架構(gòu)遭到破壞或阻礙某些生物合成，以達到抑菌或殺菌的作用。目前有研究朝著抗菌勝肽的角度來探討表面素，由于表面素和抗菌勝肽皆為兩性分子，但表面素的結(jié)構(gòu)為環(huán)型，而抗菌勝肽依據(jù)結(jié)構(gòu)的不同，分為四類：α-helix,β-sheet,β-turn loop,Boat-shaped。抗菌勝肽與細胞膜作用機制是利用勝肽脂質(zhì)交互作用(Peptide-lipid interaction)，分為四個模式：聚集模式(Aggregate model)、環(huán)形孔洞模式(Toroidal pore model)、筒狀穿鑿式(Barrel-Stave model)及地毯覆蓋式(Carpet model)，其中這些作用模式大多是經(jīng)由勝肽脂質(zhì)的交互作用，造成膜內(nèi)外滲透壓不平衡，使菌體死亡。目前表面素與細胞膜之間的作用機制尚無定論，但主要有幾種假說：1.類清潔劑(detergent-like):此種機制為勝肽鏈的一部份插入膜的中間層進而引起膜的狀態(tài)極不穩(wěn)定(stronger destabilization)進而造成膜產(chǎn)生裂縫(leak)以及分離(partitioning)(Lohner and Epand,1997；Heeklotz et al.,2004)；2.孔洞(vesicle)的形成:此機制可分為三個部分，(1)表面素藉由和膜之間的疏水作用力(hydrophobic interaction)而插入膜表面；(2)表面素結(jié)構(gòu)中，帶負電的胺基酸會和帶負電的脂質(zhì)頭部(lipid headgroups)產(chǎn)生電荷排斥(charge repulsions)，進而造成膜彎曲；(3)膜體極不穩(wěn)定而產(chǎn)生類似微胞(micelle)的結(jié)構(gòu)造成膜崩解(Sebastien Buchoux et al.,2008；Huang et al.,2009)。目前的研究認為表面素的非極性端可與有套膜(envelope)的病毒作用，并在膜上形成孔洞(pore)，進而產(chǎn)生離子通道(ion channels)破壞整個病毒的膜體(Vollenbroich et al.,1997)；有關(guān)表面素破壞不具套膜的病毒的外鞘蛋白(capsid)研究較少，但Vollenbroich等人認為表面素主要是藉由勝肽部分(peptide moiety)而非脂肪酸碳鏈與病毒外鞘作用而造成病毒的傷害(Vollenbroich et al.,1997)。此兩種理論的差異在于一者主張裂縫的產(chǎn)生，而另一者主張孔洞的形成。綜合以上的說法可以得知表面素的確是可以造成膜本身的受損，進而影響到細胞正常的生理功能。目前研究發(fā)現(xiàn)，抗菌勝肽可以對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌及原生動物都有破壞的能力(Powers and Hancock,2003)；另外有文獻指出，抗菌勝肽與原核生物的核酸結(jié)合后，可抑制蛋白質(zhì)的產(chǎn)生(Powers and Hancock,2003)。與傳統(tǒng)的抗生素相比，抗菌勝肽的活性具有廣效性、高效性、穩(wěn)定性、快速殺菌能力和免疫系統(tǒng)的相互作用等特點。

報導指出，抗生素添加劑的使用嚴重破壞動物腸道的微生物平衡，并易在動物體內(nèi)殘留，嚴重影響畜產(chǎn)品的質(zhì)量和人類的健康，而使用抗菌勝肽作為飼料添加劑 能夠解決上述問題，這也是抗菌勝肽在畜牧業(yè)上最直接的應用。高等動物腸道內(nèi)的抗菌勝肽能抑制外源性病原菌，而對動物腸道存在的正常菌群和細胞無殺傷作用?？咕鷦匐某煞譃橐紫盏陌坊?，可作為畜禽飼料添加劑和取代或部分取代目前動物所用的抗生素，減少抗生素對動物體的危害。抗菌勝肽可代替?zhèn)鹘y(tǒng)抗生素，治療仔豬腹瀉、豬瘟、雞新城疫和奶牛乳房炎等各種棘手的疾病，不會產(chǎn)生抗藥性的細菌，無毒無殘留，在畜禽疾病治療與預防中具有廣闊的應用前景?？咕鷦匐淖鳛轱暳咸砑觿┑谋姸鄡?yōu)點，正引起人們的廣泛關(guān)注，有望成為替代抗生素的產(chǎn)品之一。目前，國內(nèi)外作為飼料添加劑生產(chǎn)應用的主要是天蠶抗菌勝肽AD-酵母制劑，大多數(shù)的畜禽試驗也是圍繞這種抗菌勝肽進行的。

飼料及飼料原料受到霉菌污染是一個全球性問題。為了減少霉菌污染發(fā)生，對已被污染的飼料采取適當?shù)奶幚聿⒁宰畲笙薅葴p少霉菌毒素對動物健康的危害，是多年來國際畜牧、獸醫(yī)、飼料科技界研究的重要課題。最初人們透過控制飼料中含水量、環(huán)境溫度、濕度等手段而減少霉變的量。隨著化學和微生物學的發(fā)展，人們研發(fā)出化學防腐劑，目前使用較多的主要有︰有機酸、有機酸鹽(酯)和復合防霉劑三大類，但它們對食用都具有毒性。而抗菌勝肽類防腐劑是一種蛋白質(zhì)，在消化系統(tǒng)中容易降解成胺基酸，對人類副作用小、食用安全，如乳酸鏈球菌肽(Nisin)，已在全世界50多個國家廣泛應用于食品防腐保鮮。來源天然、無毒副作用的抗菌勝肽類防腐劑漸漸有取代傳統(tǒng)化學防腐劑的趨勢，相信未來抗菌勝肽在飼料行業(yè)及相關(guān)的一些行業(yè)產(chǎn)品的防腐中將會擔當重要的角色。

由于抗生素在畜禽和水產(chǎn)動物中的大量使用，藥物在畜禽和水產(chǎn)動物體內(nèi)嚴重殘留及抗藥性細菌的產(chǎn)生使得動物性食品的安全問題越來越嚴重，威脅著人類的身體健康和養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，并且對于畜產(chǎn)品出口貿(mào)易帶來巨大的損失?？咕鷦匐囊驗榫哂袕V效性抗菌活性、快速殺菌、不易產(chǎn)生抗藥性菌株并且能與傳統(tǒng)抗生素有協(xié)同作用等特點，而被認為將有廣闊的應用前景。更重要的是，抗菌勝肽在序列和架構(gòu)上具有多樣性，為新藥設(shè)計提供了很大的想象和發(fā)揮空間，能生產(chǎn)出性能穩(wěn)定的產(chǎn)品。

抗菌勝肽作為飼料添加劑時，可以耐飼料制粒時的高溫，滿足飼料添加劑生產(chǎn)流程的要求?？咕鷦匐淖鳛榭股貢r，其殺菌機制獨特，具有廣效性抗菌作用，對水產(chǎn)養(yǎng)殖動物與畜禽具有加速生長、保健和治療疾病的功能，并且無毒副作用、無殘留、無抗藥性產(chǎn)生等問題，且生產(chǎn)成本低也不受季節(jié)和氣候變化等外在環(huán)境的影響。產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)含天然活性的水生微生物的抗菌勝肽，可以滿足水產(chǎn)與畜牧業(yè)發(fā)展 的需求，推展綠色飼料添加劑行業(yè)的發(fā)展。

抗菌勝肽作為飼料添加劑的研究是最近幾年才發(fā)展起來，還處于探索階段，距離形成成熟的技術(shù)、大規(guī)模的應用到生產(chǎn)中還有很多問題需要解決︰1.抗菌勝肽的天然資源有限，化學合成和基因工程便成為獲取抗菌勝肽的主要手段；2.合成的成本昂貴，目前還無法大規(guī)模的生產(chǎn)；3.透過基因工程，在微生物中直接表達抗菌肽基因，可能會造成微生物死亡，或產(chǎn)物表達量過少的問題。目前一般抗菌勝肽的量產(chǎn)模式大多是利用合成菌株進行液態(tài)發(fā)酵所生產(chǎn)，其缺點為︰1.初期液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)設(shè)備與投資費用非常高，投資回報慢；2.若不經(jīng)過純化程序，直接將合成菌株做為飼料添加劑，會有GMO基改添加劑的疑慮。故研發(fā)天然、可廣效性殺(抗)菌、價格低廉且非GMO的替代抗生素的抗菌勝肽為醫(yī)藥、飼料添加劑研發(fā)的重要課題。

本發(fā)明是利用具表面素產(chǎn)量的枯草芽孢桿菌突變株，以黃豆為發(fā)酵基質(zhì)，進行半固態(tài)發(fā)酵，再將發(fā)酵后的黃豆經(jīng)干燥和粉碎后，將所得的黃豆粉做為飼料添加劑。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種制備含表面素的飼料添加劑的方法。

該方法包括以下步驟，

A、將高產(chǎn)表面素的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)突變株的菌液接種至無機鹽液體培養(yǎng)基與黃豆的混合物中，進行半固態(tài)發(fā)酵，得到一發(fā)酵過的黃豆，其中，所述的高產(chǎn)表面素的枯草芽孢桿菌突變株，命名為B.S.surfactin 1，分類命名為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址在北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，其菌種保藏編號為CGMCC No.10270，保藏日期為2014年12月31日。

B、將該發(fā)酵過的黃豆烘干、磨碎與過篩，得到一黃豆粉末；該黃豆粉末即為含有表面素(surfactin)的飼料添加劑。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟A的高產(chǎn)表面素的枯草芽孢桿菌突變株的菌液的接種體積與該混合物中黃豆體積的比例為5:100-10:100。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟A中無機鹽液體培養(yǎng)基的體積與該混合物中黃豆體積的比例為25:100-35:100。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟A的半固態(tài)發(fā)酵是于溫度30-40℃，濕度80-90％下，發(fā)酵2-3天。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟B的烘干是于溫度50-60℃下，時間2-3小時，進行 烘干。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟B的黃豆粉末，其表面素含量為6-7克/公斤。

本發(fā)明的目的是提供一種制備含表面素飼料添加劑的方法，該飼料添加劑是應用于水產(chǎn)生物(如：石斑魚或南美白蝦)的飼料，具有促進水產(chǎn)生物的生長率、增加免疫力及抗細菌、抗真菌與抗病毒的活性。

附圖說明

圖1是利用不同濃度的表面素處理病毒感染細胞株的中和效價分析。

圖2的圖2A是表面素對神經(jīng)壞死病毒顆粒造成的型態(tài)影響，(A)1％L-15處理組；(B)1％L-15+100μg/ml表面素混合處理組；(C)1％L-15神經(jīng)壞死病毒混合處理組，箭頭指出表示正常的病毒顆粒；(D)40μg/ml表面素+神經(jīng)壞死病毒混合處理組，箭頭指出表示不正常的病毒顆粒；(E)100μg/ml表面素和神經(jīng)壞死病毒混合處理組，箭頭指出表示不正常的病毒顆粒。圖2B是表面素對虹彩病毒顆粒造成的型態(tài)影響，(A)正常的虹彩病毒顆粒組；(B)10μg/ml表面素+虹彩病毒混合處理組，該病毒顆粒外觀變形；(C)40μg/ml表面素+虹彩病毒混合處理組，表面素與病毒顆粒的間有沾黏現(xiàn)象。

圖3是含表面素飼料添加劑促進南美白蝦成長試驗。

圖4是含表面素飼料添加劑促進石斑魚成長試驗。

圖5是含表面素飼料添加劑增加免疫型基因的表達量。

圖6的圖6A是含表面素飼料添加劑降低感染神經(jīng)壞死病毒后石斑魚的死亡率。圖6B是含表面素飼料添加劑降低感染虹彩病毒后石斑魚的死亡率。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例和附圖來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。

實施例一.以半固態(tài)發(fā)酵方式制備含表面素的飼料添加劑。

本發(fā)明是采用高產(chǎn)表面素的枯草芽孢桿菌突變株(寄存編號CGMCC No.10270) 以黃豆為基底，進行半固態(tài)發(fā)酵，該發(fā)酵過的黃豆表面富含二次代謝產(chǎn)物─表面素；發(fā)酵基質(zhì)也可采用其他價格更為低廉的發(fā)酵基質(zhì)如菜仔粕、棕櫚粕、椰仔粕、農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品或下腳料(馬鈴薯皮、木薯皮、蘋果皮)。

將有機黃豆(美國產(chǎn))浸泡16小時，以黃豆量的10％水量為添加量的比例于121℃蒸煮30分鐘，待冷卻至常溫后接種黃豆體積10％的高產(chǎn)表面素的枯草芽孢桿菌突變株(CGMCC No.10270)的菌液，并分別添加黃豆體積30％的無機鹽液體培養(yǎng)基，進行半固態(tài)發(fā)酵，其條件為溫度30℃，濕度80％，發(fā)酵時間為48小時，再將發(fā)酵后的黃豆經(jīng)過55℃烘干2-3小時、粉碎后經(jīng)60目篩網(wǎng)，置于4℃保存，其中每公斤黃豆粉含有6-7克的表面素。

該無機鹽液體培養(yǎng)基包括2-6％(v/v)葡萄糖、35-45mM磷酸氫鈉(Na₂HPO₄)、25-35mM磷酸二氫鉀(KH₂PO₄)、45-55mM硝酸銨(NH₄NO₃)、5-10mM氯化鈣(CaCl₂)、2-6mM乙二胺四乙酸鈉(Sodium EDTA)、750-850mM含水硫化鎂(MgSO₄.7H₂O)、1-3mM含水硫化鐵(FeSO₄.7H₂O)。

實施例二.表面素的抑菌試驗

為了探討表面素是否具有抗細菌的活性，因此進行體外敏感性試驗。

細菌菌液制備分別將大腸桿菌(Escherichia coli DH5α)、哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)、溶澡弧菌(Vibrio alginolyticus)、鰻弧菌(Vibrio anguillarum)、鮭弧菌(Vibrio salmonicida)、產(chǎn)氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)培養(yǎng)于LBA(E.coli□DH5α)或TSA(+1.5％NaCl)上，于37℃培養(yǎng)16小時后，刮下菌落并溶于指定培養(yǎng)液；使OD₅₄₀為1時(濃度約為1×10⁹/c.c.菌數(shù))，取100μl菌液加入900μl的LB或TSB(+1.5％NaCl)，使菌液濃度達到5×10⁵CFU/ml。

霉菌菌液制備

將黑曲霉(Aspergillus niger)培養(yǎng)于MEAIII平板上，于25℃培48小時后，刮下菌落溶于指定培養(yǎng)液。經(jīng)由連續(xù)稀釋并涂于MEAIII平板上，計算菌落數(shù)推算原液濃度為1×10⁶CFU/ml，之后取500μl菌液加入500μl的MEB，將菌液濃度稀釋至5×10⁵CFU/ml。

敏感性試驗(Susceptibility test)

在96孔培養(yǎng)皿在每個凹槽加入130μl的菌液，菌液濃度為5×10⁵CFU/ml，再加入20μl由滴定方式稀釋成不同濃度的表面素，于37℃培養(yǎng)16小時后，使用分光亮度計計算菌體生長濃度，所得數(shù)據(jù)對照于原先起始值(OD₅₄₀為1時)，以等于起始值(菌體 沒有增生)的實驗組為最小抑菌濃度(Minimun inhibiting concentration，MIC)，每個實驗組各有三次重復及對照組。

試驗結(jié)果如表一所示：與枯草芽孢桿菌ATCC21332所生產(chǎn)的表面素比較，由高產(chǎn)表面素的枯草芽孢桿菌突變株，所生產(chǎn)的表面素其最小抑菌濃度為96.5μΜ。

表一、枯草芽孢桿菌ATCC21332與高產(chǎn)表面素的枯草芽孢桿菌突變株所生產(chǎn)的表面素的最小抑菌濃度(μΜ)比較。

實施例三.表面素與神經(jīng)壞死病毒中和反應試驗

為了探討表面素是否具有抗病毒活性，因此進行中和反應試驗。于實驗前一天，將GF-1細胞培養(yǎng)在96孔微量平底培養(yǎng)盤，每一孔接種5×10³個細胞，待隔日(16小時)細胞生長成八分滿時，及可以進行力價測定。首先先將待測定的病毒液，以1％FBS-L15做連續(xù)十倍稀釋，稀釋倍數(shù)由10¹～10¹⁰，再將稀釋過的病毒液分別接種至96孔盤中，每一孔接種100μl，均勻搖晃培養(yǎng)盤讓病毒液均勻分散，共8重復；將培養(yǎng)盤放在28℃培養(yǎng)箱中，讓病毒吸附90分鐘后，換掉舊有的培養(yǎng)液，補入200μl的1％FBS-L15培養(yǎng)液，將培養(yǎng)盤放回28℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)9天后觀察細胞變情形。病毒效價(50％tissue culture infection dose,TCID50)是依據(jù)Reed-Muench Method的方法計算，以TCID50表示，計算中和指數(shù)Neutralization index(NI＝病毒原力價/經(jīng)表 面素中和后的病毒效價NI)，NI值愈高，表示表面素得的中和效價愈高。中和反應操作為系列10倍稀釋，中和效價的判定方式，當中和指數(shù)小于10(即Log10NI值小于1)，為無中和效力；中和指數(shù)介于10～50之間(Log10NI值介于1～1.6)為中和效力不顯著，屬于存疑范圍；而當中和指數(shù)大于50(Log10NI值大于1.7)，則判定為具有顯著的中和效力(Grace,1979)。試驗結(jié)果如圖1所示。

實施例四.表面素與病毒作用機制

將表面素溶于滅菌水中，以0.2μm過濾膜過濾后，再利用1％FBS-L15稀釋至40μg/ml和100μg/ml。表面素處理組：以1：1體積比例將表面素與神經(jīng)壞死病毒液混合；對照組：1％FBS-L15培養(yǎng)液與神經(jīng)壞死病毒液混合，兩組分別混合后于28℃下培養(yǎng)一天，再以穿透式電子顯微鏡(Transmission electron microscope，Hitachi H-600)觀察。取6μl表面素處理組滴于銅網(wǎng)上并使病毒沉降約10分鐘，再以pH 7.4的1％phosphotungstic acid(PTA，Sigma)染色10分鐘，染色完成后，以濾紙吸去多余的混合液并放置室溫30分鐘，使銅網(wǎng)陰干后隨即觀察。穿透式電子顯微鏡使用電壓為75KV，底片曝光時間為4秒鐘。底片沖洗于海洋大學電顯中心暗房，將取出的底片放置于沖片架上以顯影劑D19顯影4分鐘，顯影完成后再以0.33％的冰醋酸停止顯影2分鐘，接著浸泡固定劑10分鐘，最后再以流水的方式洗去多余的藥劑60分鐘后，陰干底片。試驗結(jié)果如圖2所示。

實施例五.含表面素的飼料添加劑提升南美白蝦成長試驗

將發(fā)酵豆粉與市售蝦飼料粉碎，添加無菌水混合均勻后，利用飼料擠壓器制成顆粒狀，放置烘箱于70℃干燥3小時，將飼料中的水分降至10％，并將干燥后的飼料置于4℃冰箱保存。成長試驗分四個飼料處理組，分別為1.添加發(fā)酵豆粉其表面素含量為10ppm；2.添加發(fā)酵豆粉其表面素含量為20ppm；3.添加水洗過后發(fā)酵豆粉2％；4.添加水洗過后發(fā)酵豆粉5％與對照組：市售飼料。每組為25只白蝦蝦苗，濕重約為0.6g，實驗水槽為30公分×24公分×60公分的透明玻璃缸，內(nèi)含水量約為45公升，實驗期間不控溫，持續(xù)打氣，每次換水量約為1/3。每天投喂量約為蝦重量的5％，投喂時間為每日早上8點及下午5點，每星期秤其濕重，記錄并計算其成長率。試驗結(jié)果如圖3所示。

實施例六.含表面素的飼料添加劑提升石斑魚成長試驗

飼料蛋白質(zhì)與脂質(zhì)含量參考Shiau和Lan(1996)試驗配制而成，試驗飼料配方為一般飼料，其粗蛋白為47％，脂質(zhì)為10％。紅魚粉、玉米筋蛋白、小麥筋蛋白及烏賊粉，經(jīng)由粉碎機研磨并過篩(35mesh篩網(wǎng))，藉此增加飼料黏結(jié)性，所有飼料經(jīng)由擠粒機擠粒、切粒并烘干后，添加2-5％表面素，冰存于-20℃冰箱以確保飼料質(zhì)量。試驗結(jié)果如圖4所示。

實施例七.含表面素的飼料添加劑可誘導動物先天免疫基因表達量

連續(xù)對石斑魚投喂含有0％、2％及5％表面素的飼料，可在第七天后誘發(fā)石斑魚免疫型基因AMP(Antimicrobial peptide)、MX(MX蛋白為干擾素(interferon)誘發(fā)的一種GTPase)、干擾素誘導蛋白(INF-inducted protein)的表達。試驗結(jié)果如圖5所示。

實施例八.含表面素的飼料添加劑增加動物抗病能力

點帶石斑魚苗經(jīng)連續(xù)投喂7天含有表面素的飼料，對于石斑魚感染神經(jīng)壞死病毒或虹彩病毒后，死亡率的變化。實驗共分為4組，1.陰性對照組：喂食一般飼料+注射PBS；2.陽性對照組：喂食一般飼料+注射病毒；3.實驗組：喂食含2％表面素的飼料+注射病毒；4.實驗組：喂食含5％表面素的飼料+注射病毒。試驗結(jié)果如圖6所示。

以上實施例揭露本發(fā)明方法所產(chǎn)生的表面素得應用于水產(chǎn)養(yǎng)殖投喂飼料，并且適應于水中環(huán)境變化與多種病原，具有耐酸堿、耐高溫、廣譜性殺菌效果(革蘭氏陽性與陰性、真菌、寄生蟲、病毒)，不會造成抗藥性，且可以被微生物降解，是一種環(huán)境友善、綠色飼料添加劑，不會有藥物殘留問題，非常適合作為新型抗生素與抗病型飼料添加劑。

本發(fā)明方法采用固態(tài)發(fā)酵法，發(fā)酵完直接干燥粉碎，即成飼料添加劑，得替代一般抗生素，此方法生產(chǎn)工藝簡單、生產(chǎn)成本低廉。

上述多項功效，實屬充分符合新穎性及進步性的法定發(fā)明專利要件，爰依法提出申請，懇請貴局核準本件發(fā)明專利申請案以勵發(fā)明。