缺失d-乳酸產(chǎn)生的約氏乳桿菌菌株cncm i-1225的天然衍生物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明一般地涉及益生菌領(lǐng)域。特別地，本發(fā)明涉及缺失D-乳酸產(chǎn)生的約氏乳桿菌（Lactobacillus?johnsonii）菌株CNCM?I-1225的天然衍生物。
【專利說(shuō)明】缺失D-乳酸產(chǎn)生的約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的天然衍
生物
[0001]本發(fā)明一般地涉及益生菌領(lǐng)域。特別地，本發(fā)明涉及缺失D-乳酸產(chǎn)生的約氏乳桿菌(Lactobacillus johnsonii)菌株 CNCM 1-1225 的天然衍生物。
[0002]人分離株約氏乳桿菌CNCM 1-1225也稱為約氏乳桿菌NCC533或者嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus) La1、或者約氏乳桿菌 Ljl (Bernet-Camard, M.F.，等人，(1997) Appl.Environ.Microbiol.63，2747-2753)是目前非常成功地以商標(biāo)Lcl商品化的益生菌。
[0003]約氏乳桿菌CNCM 1-1225具有幾種明確記錄的健康益處，例如，免疫調(diào)節(jié)或病原體抑制的活性(Haller，D.，等人，2000，Infect.1mmun.68:752-759 ；Haller, D.，等人，2000，Gut47:79-87 ;或 Ibnou-Zekri, N.，等人，2003，Infect.1mmun.71:428-436)和長(zhǎng)期的安全
使用歷史。
[0004]限制約氏乳桿菌CNCM 1-1225在一些產(chǎn)品種類，例如在用于幼兒和嬰兒的產(chǎn)品中的應(yīng)用的一個(gè)方面是從糖的發(fā)酵中主要地產(chǎn)生了 D-乳酸同分異構(gòu)體。例如，如果在MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，那么約氏乳桿菌CNCM1-1225將乳糖發(fā)酵成60%: 40%比例的D-和L-乳酸。
[0005]由于3歲以下嬰兒有限的D-乳酸消除(這可能導(dǎo)致D-乳酸中毒)，所以CODEXInfant Formula Directive對(duì)3歲以下嬰兒消費(fèi)的D-乳酸和產(chǎn)生D-乳酸的細(xì)菌給出了建議。
[0006]支持該結(jié)論的證據(jù)是有限的，并且所述證據(jù)主要是基于食物中D-乳酸的存在，并且沒(méi)有基于產(chǎn)生D-乳酸細(xì)菌(其是胃腸道的天然寄居菌)的施用。
[0007]因此，幾篇文獻(xiàn)對(duì)該觀點(diǎn)`提出了質(zhì)疑(Connolly，E.等人，NTRAfoods3 (3),37-49,2004 ；Haschke-Becher, E.，等人，2008, Ann.Nutr.Metab.53:240-244, Mack, D.R.,2004,Can.J.Gastroenterol.18:671-675),但到目前為止，CODEX Infant Formula Directive的建議仍沒(méi)有改變。
[0008]CODEX基本上排除了將產(chǎn)生D-乳酸的益生菌作為嬰兒配方食品中的補(bǔ)充劑，但鼓勵(lì)只產(chǎn)生L-乳酸的菌株的遺傳改造。此類研發(fā)的實(shí)例是產(chǎn)生經(jīng)遺傳修飾的生物(GM0)，特別是經(jīng)遺傳修飾的約氏乳桿菌菌株，其中分離了 d-乳酸脫氫酶(D-LDH)基因(ldhD)，并通過(guò)基因替換，將IdhD基因體外截短的克隆拷貝用于失活基因組拷貝(Lapierre，L.，等人，1999, Appl.Environ.Microbiol.65:4002-4007)。
[0009]產(chǎn)生的這種經(jīng)遺傳改造的菌株僅用于實(shí)驗(yàn)室目的，并且從未用于食品中，因?yàn)槭褂弥亟MDNA技術(shù)，已經(jīng)改變了所述菌株的遺傳物質(zhì)，因此認(rèn)為該菌株是GM0。
[0010]然而，期望存在這樣的可能性，允許約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的大量健康益處也可用于目前并不建議消費(fèi)D-乳酸或者產(chǎn)生D-乳酸的細(xì)菌的個(gè)體。
[0011]因此，本領(lǐng)域存在天然益生菌菌株，特別是約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物的強(qiáng)烈需求，所述約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物缺失了 D-乳酸產(chǎn)生，但盡管如此仍可存活。
[0012]本發(fā)明人處理了這些需求。[0013]因此，本發(fā)明的目的是為本領(lǐng)域提供約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的衍生物，其還可以應(yīng)用于嬰幼兒產(chǎn)品，同時(shí)考慮CODEX Infant Formula Directive的當(dāng)前規(guī)則,所述約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的衍生物是天然的且不會(huì)被認(rèn)為是GM0。
[0014]本發(fā)明人驚訝地發(fā)現(xiàn)，他們可以通過(guò)獨(dú)立權(quán)利要求的主題實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的。從屬權(quán)利要求進(jìn)一步發(fā)展了本發(fā)明的理念。
[0015]本發(fā)明人研究了分離天然的(非GM0)、活的和遺傳上穩(wěn)定的約氏乳桿菌Lal的變體的可能性，所述約氏乳桿菌Lal的變體只產(chǎn)生L-乳酸。
[0016]基因組序列的改變以相對(duì)低的頻率天然地發(fā)生，例如由于損傷DNA的錯(cuò)誤修復(fù)或者DNA復(fù)制錯(cuò)誤而發(fā)生。
[0017]為了尋找約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的此類天然衍生物，本發(fā)明人篩選了大約21-000個(gè)約氏乳桿菌CNCM 1-1225菌落，并且已經(jīng)鑒定了兩個(gè)可以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的的天然D-乳酸缺失變體。
[0018]本發(fā)明人還測(cè)定了 MRS培養(yǎng)上清液中的D-和L-乳酸濃度，并且顯示與培養(yǎng)上清液中總的乳酸濃度相比，相對(duì)的D-乳酸濃度低于4% ;特別地，在一種情況下3.7%，并且在第二種情況下0%。
[0019]DNA序列分析鑒定了乳酸脫氫酶基因中主要的點(diǎn)突變，所述點(diǎn)突變改變了酶的氨基酸序列，因此改變了酶的催化性質(zhì)。
[0020]兩種天然衍生物都顯示是可存活的并且穩(wěn)定的，并且沒(méi)有回復(fù)突變至D-乳酸產(chǎn)生的實(shí)例。
[0021]因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物，其中所述約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的衍生物缺失D-乳酸產(chǎn)生。
[0022]據(jù)本發(fā)明人了解，這是第一次提供了缺失D-乳酸產(chǎn)生的約氏乳桿菌菌株CNCM1-1225的天然衍生物。
[0023]對(duì)于本發(fā)明的目的，“缺失D-乳酸產(chǎn)生”指的是與總?cè)樗嵘a(chǎn)量相比，菌株產(chǎn)生少于5%，優(yōu)選地少于4%，和理想地0%的D-乳酸?？梢栽跓o(wú)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中測(cè)量D-和L-乳酸濃度。
[0024]由約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物產(chǎn)生的乳酸的總量最初與細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)。當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入穩(wěn)定期并停止分裂時(shí)，它們繼續(xù)代謝糖并產(chǎn)生更多的乳酸。然而，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生的D-和L-乳酸的比例是恒定的。
[0025]約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的“天然”衍生物指的是不認(rèn)為是GMO的菌株。例如可以通過(guò)篩選經(jīng)歷了天然發(fā)生的基因組序列改變(例如，由于損傷DNA的錯(cuò)誤修復(fù)或者DNA復(fù)制錯(cuò)誤)的菌落，來(lái)獲得此種天然衍生物。通過(guò)使菌落經(jīng)歷脅迫條件，例如通過(guò)應(yīng)用甲磺酸乙酯，EMS可以增加這種錯(cuò)誤的天然發(fā)生。
[0026]對(duì)于本申請(qǐng)的目的，術(shù)語(yǔ)“GM0”應(yīng)當(dāng)根據(jù)2001年3月12日的DIRECTIVE2001/18/EC OF THE EUROPEAN PARLIAMENT AND OF THE COUNCIL對(duì)于故意將經(jīng)遺傳修飾的生物釋放到環(huán)境中和撤銷的Council Directive90/220/EEC定義。因此，‘經(jīng)遺傳修飾的生物(GM0)’指的是除人類之外的這樣的生物，其中遺傳物質(zhì)已經(jīng)通過(guò)非天然發(fā)生(交配和/或非天然重組)的方式而改變。 [0027]就該定義而言，至少通過(guò)使用以下技術(shù)發(fā)生遺傳修飾:[0028](I)重組核酸技術(shù)，其涉及通過(guò)將以生物之外的任一種方法產(chǎn)生的核酸分子插入到任一種病毒、細(xì)菌質(zhì)?；蚱渌d體系統(tǒng)中來(lái)形成遺傳物質(zhì)的新組合，并且將所述遺傳物質(zhì)的組合摻入到它們并非天然存在，但能繼續(xù)增殖的宿主生物中；
[0029](2)涉及將在生物之外制備的可遺傳物質(zhì)直接引入到生物中的技術(shù)，其包括顯微注射法、巨量注射法和微囊化作用；或
[0030](3)細(xì)胞融合(包括原生質(zhì)體融合)或雜交技術(shù)，其中使用并非天然存在的方法，通過(guò)融合兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞形成具有可遺傳的遺傳物質(zhì)的新組合的活細(xì)胞。
[0031]如果菌株具有至少99.95%，例如至少99.99%，優(yōu)選地至少99.995%的核酸同一性，那么認(rèn)為菌株是約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的“衍生物”。例如，如果與約氏乳桿菌CNCM1-1225的核酸序列相比，菌株具有不超過(guò)500個(gè)，例如不超過(guò)100個(gè)，優(yōu)選地不超過(guò)50個(gè)的核酸改變，那么認(rèn)為菌株是約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的衍生物。
[0032]本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物在負(fù)責(zé)D-乳酸缺失表型的d-ldh基因中顯示出突變。
[0033]因此，約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物可能具有改變的D-乳酸脫氫酶序列。例如，約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物可以包含在D-乳酸脫氫酶序列的氨基酸位置153處甘氨酸至天冬氨酸的氨基酸改變和/或在氨基酸位置204處絲氨酸至亮氨酸的氨基酸改變。
[0034]這種改變明顯地改變了 D-乳酸脫氫酶的功能，以致產(chǎn)生了極少的D-乳酸或者不會(huì)產(chǎn)生D-乳酸。
[0035]D-乳酸脫氫酶蛋白質(zhì)序列的改變基于D-乳酸脫氫酶基因的核酸序列的改變。
·[0036]使得到的酶失活的D-乳酸脫氫酶基因的核酸序列的任何天然改變都可以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的主題。此外，野生型序列或者一部分或整個(gè)D-乳酸脫氫酶基因內(nèi)一個(gè)或多個(gè)連續(xù)核苷酸的一個(gè)或多個(gè)缺失均可以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的主題。
[0037]本發(fā)明人分析了本發(fā)明約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物中D-乳酸脫氫酶基因的核酸序列。
[0038]因此，本發(fā)明還涉及約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物，其中在約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物中D-乳酸脫氫酶基因的核酸序列在核酸位置498處包含G至A的轉(zhuǎn)變和/或在核酸位置651處包含C至T的轉(zhuǎn)變。
[0039]盡管導(dǎo)致D-乳酸脫氫酶失活的此種改變?cè)诖笞匀恢锌梢砸缘皖l率自發(fā)地發(fā)生，但其是隨機(jī)的，并且可以以相同的頻率修復(fù)回親本序列(野生型)。
[0040]如果失活的基因賦予了變體生長(zhǎng)缺陷，那么這種修復(fù)頻率可以甚至更高?？紤]到從培養(yǎng)物保藏到最終產(chǎn)物之間的多次傳代，重要的是此種改變是穩(wěn)定的，特別地因?yàn)閱螇A基對(duì)改變?cè)谶z傳上比缺失更不穩(wěn)定。
[0041 ] 有利地，還發(fā)現(xiàn)這些改變是穩(wěn)定的。
[0042]實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物的兩個(gè)實(shí)例是分離的、純化的，并且詳細(xì)表征的菌株。
[0043]因此，本發(fā)明涉及約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物，其選自約氏乳桿菌CNCM 1-4434 和約氏乳桿菌 CNCM 1-4441。
[0044]約氏乳桿菌CNCM 1-4434和約氏乳桿菌CNCM 1_4441都在布達(dá)佩斯條約下于2011年 2 月 8 日保藏于 Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM),Institut Pasteur, 25Rue du Docteur Roux, F_75724Paris Cedexl5,法國(guó)。
[0045]兩株菌株都是被完全測(cè)序的。
[0046]約氏乳桿菌CNCM 1-1225在布達(dá)佩斯條約下于1992年6月30日保藏于CNCM。
[0047]約氏乳桿菌CNCM 1-4434含有總共37個(gè)核酸改變，其包括單堿基對(duì)缺失。這包括D-乳酸脫氫酶基因序列的期望改變(推測(cè)其負(fù)責(zé)該菌株缺失的D-乳酸產(chǎn)生)和原噬菌體Lj965中可以認(rèn)為是‘自私’ DNA的基因的兩個(gè)改變(不可能影響細(xì)菌的生理)。剩余的基因/預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)在大體上僅是不精確注釋的，但幾種改變影響對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)更加重要的基因。存在經(jīng)預(yù)測(cè)其功能對(duì)生長(zhǎng)是必需的6個(gè)基因的改變，所述基因即LJ1108-DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶1、LJl 197 -青霉素結(jié)合蛋白1A、LJ1283 -乳清酸磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶、LJ1492-DNA聚合酶IIIa亞基、LJ1493-脯氨酰-tRNA合成酶和LJ1600 -肽鏈釋放因子3。全部這些功能對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)都是必需的，因?yàn)榭赡艹齃J1283外，不能通過(guò)生長(zhǎng)培養(yǎng)基補(bǔ)充它們。通過(guò)在MRS肉湯中，CNCM 1-4434以與Lal相似的速率生長(zhǎng)，以及CNCM 1-4434在MRS和工業(yè)培養(yǎng)基中也達(dá)到的相似的最終CFU，證實(shí)各個(gè)以及積累的改變的作用對(duì)生長(zhǎng)沒(méi)有顯著的不利影響。值得注意的最后第二個(gè)改變是LJ0854 - β_半乳糖苷酶小亞基，其不會(huì)影響乳糖發(fā)酵。
[0048]約氏乳桿菌CNCM 1-4441含有總共27個(gè)核酸改變，其包括D-乳酸脫氫酶基因的期望改變(在該菌株中負(fù)責(zé)缺失D-乳酸產(chǎn)生)，在原噬菌體Lj965和Lj928中的各一個(gè)改變和插入序列ISLjo5的轉(zhuǎn)座酶的改變。存在經(jīng)預(yù)測(cè)其功能對(duì)生長(zhǎng)重要的3個(gè)基因的改變，所述基因即LJ1009 -延伸因子Tu、LJ1516 -信號(hào)識(shí)別顆粒蛋白和LJ1600 -肽鏈釋放因子
3。盡管這些單個(gè)以及組合的改變，在MRS和工業(yè)培養(yǎng)基中，與Lal相比，約氏乳桿菌CNCM1-4441達(dá)到了相似的最終CFU。
[0049]本發(fā)明還擴(kuò)展至根據(jù)本發(fā)明的`約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物，其中約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物以在生物學(xué)上純的培養(yǎng)物存在。
[0050]根據(jù)本發(fā)明的約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物可以根據(jù)任何合適的方法培養(yǎng)，并可以通過(guò)例如冷凍干燥或者噴霧干燥另外地制備以添加至本發(fā)明的組合物中。
[0051]益生菌菌株約氏乳桿菌CNCM 1-1225提供了許多明確記錄的健康益處，其中一些在上文中進(jìn)行了詳述。
[0052]“益生菌”指的是對(duì)宿主的健康或安康具有有益作用的微生物細(xì)胞制備物或者微生物細(xì)胞的組分。(Salminen S,等人“Probiotics:how should they be def ined”TrendsFood Sc1.Technol.1999:10107_10)。
[0053]就提供的健康益處而言，基本上可以把根據(jù)本發(fā)明的約氏乳桿菌菌株CNCM1-1225的天然衍生物看作生物等效物(bioequivalent)。
[0054]科學(xué)工作顯示，從約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的生物學(xué)上純的培養(yǎng)物分離的無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)上清液也具有幾種健康益處(參見(jiàn)例如，Bernet-Camard, M._F.，等人，1997，APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY，第 2747 - 2753 頁(yè))。
[0055]因此，本發(fā)明還擴(kuò)展至從根據(jù)本發(fā)明的約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的生物學(xué)上純的天然衍生物的培養(yǎng)物分離的無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)上清液。
[0056]由于本發(fā)明約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物和無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)上清液具有大量健康益處，因此可以將它們用于治療或預(yù)防人體或動(dòng)物體的病癥。
[0057]因此，本發(fā)明涉及包含根據(jù)本發(fā)明的約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物和無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)上清液的組合物，其用于制備在通過(guò)治療處理人體或動(dòng)物體的方法中使用的組合物。
[0058]本發(fā)明還涉及包含根據(jù)本發(fā)明的約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物和無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)上清液的組合物的用途，其用于制備藥物組合物或者藥物。
[0059]已經(jīng)對(duì)約氏乳桿菌CNCM 1-1225的益生菌相關(guān)活性進(jìn)行了大量的研究，所述益生菌相關(guān)活性包括免疫調(diào)節(jié)(Haller, D.，等人，2000, Infect.Tmmun.68, 752-759 ；Haller,
D.，等人，2000，Gut47,79-87 ；Ibnou-Zekri, N.，等人，2003，Infect.1mmun.71，428-436)、病原體抑制(Bernet，M.F.，等人，1994，Gut35，483-489)和上皮細(xì)胞附著(Neeser，J.R.，等人,2000, GlycobiologylO, 1193-1199 ；Granato, D.，等人，1999, Appl.Environ.Microbiol.65，1071-1077)。
[0060]由于生物等效性，根據(jù)本發(fā)明的約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物和/或其無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)上清液提供了相同的健康益處。
[0061]因此，本發(fā)明涉及包含根據(jù)本發(fā)明的約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物和/或無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)上清液的組合物，其用于治療或預(yù)防與減弱的免疫系統(tǒng)相關(guān)的疾病。
[0062]本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物和/或無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)上清液的用途，其用于制備用于治療或預(yù)防與減弱的免疫系統(tǒng)相關(guān)的疾病的組合物。
[0063]與減弱的免疫系統(tǒng)·相關(guān)的疾病是本領(lǐng)域熟知的，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，哪些疾病與減弱的免疫系統(tǒng)相關(guān)。
[0064]與減弱的免疫系統(tǒng)相關(guān)的疾病的一般實(shí)例可以選自流感、鼻炎、普通感冒及其組
口 ο
[0065]還可以將包含根據(jù)本發(fā)明的約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物和/或無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)上清液的組合物用于治療或預(yù)防與腸道毒性細(xì)菌(enterovirulent bacteria)或病毒的細(xì)胞附著和細(xì)胞入侵相關(guān)的疾病。
[0066]本發(fā)明還擴(kuò)展至根據(jù)本發(fā)明的約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物和/或無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)上清液的用途，其用于治療或預(yù)防與腸道毒性細(xì)菌或病毒的細(xì)胞附著和細(xì)胞入侵相關(guān)的疾病的組合物的制備。
[0067]腸道毒性細(xì)菌或病毒是本領(lǐng)域熟知的。歐洲食品安全局(European Food SafetyAuthority) (EFSA)已經(jīng)在2010年11月公布了此種病原體的列表。
[0068]例如，腸道毒性細(xì)菌或病毒可以選自沙門氏菌屬(Salmonella);彎曲桿菌屬(Campylobacter);利斯特氏菌屬(Listeria);大腸桿菌菌株，例如如ETEC、EHEC> EPEC或EIEC菌株；耶爾森氏菌屬(Yersinia);志賀氏菌屬(Shigella);產(chǎn)毒素細(xì)菌，如金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肉毒梭狀芽胞桿菌(Clostridium botulinum)或臘狀芽抱桿菌(Bacillus cereus) ；Vibrio vulnifucus/parahaemoIyticus (副溶血弧菌)；輪狀病毒屬(rotavirus);諾瓦克病毒(norovirus);腸出血型大腸桿菌(verotoxigenic
E.coli )；阪崎腸桿菌(Enterobacter sakazakii );產(chǎn)毒的產(chǎn)氣莢膜梭菌(toxigenicC.perfringens) (A型和B型)；食源性寄生蟲(chóng)，如棘球蝴(Echinococcus)、弓形體(Toxoplasma)或賈第蟲(chóng)屬(Giardia);幽門螺桿菌(Helicobacter pylori);艱難梭菌(Clostridium difficile);破傷風(fēng)梭菌(Clostridium tetani)及其組合。
[0069]本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚，哪種病癥與哪種腸道毒性細(xì)菌或病毒物種相關(guān)。
[0070]例如，與腸道毒性細(xì)菌或病毒物種的細(xì)胞附著和細(xì)胞入侵相關(guān)的疾病可以選自下呼吸道感染、胃腸道感染、中耳炎及其組合。
[0071]本發(fā)明組合物可以是任何類型的組合物，只要其適合于施用給人類或動(dòng)物。
[0072]特別地，本發(fā)明組合物可以口服地、腸內(nèi)地、胃腸外地或者局部地施用?？梢砸酝ǔＳ糜谶x定的施用模式的任何植物制劑形式提供組合物。
[0073]可以將本發(fā)明組合物施用給任何年齡組。
[0074]優(yōu)選地，可以在寒冷的季節(jié)，例如從秋天至春天期間，施用本發(fā)明組合物。
[0075]還可以在任何時(shí)間消費(fèi)本發(fā)明組合物。優(yōu)選地，在早晨消費(fèi)本發(fā)明組合物，例如以增強(qiáng)一天的免疫系統(tǒng)。
[0076]組合物可以例如選自食品組合物、寵物食品組合物、飲料、乳制品、營(yíng)養(yǎng)制劑、嬰兒配方食品、食品添加劑、營(yíng)養(yǎng)制品、藥物組合物、食品成分和/或化妝品組合物。
[0077]例如，組合物可以選自酸化的乳產(chǎn)品，例如酸奶或酸奶飲料；或者基于乳的粉末。
[0078]如果以貨架穩(wěn)定粉末的形式提供組合物，那么特別優(yōu)選的是粉末狀產(chǎn)品。為了獲得貨架穩(wěn)定性，并且確保益生菌的存活，可以以少于0.2，例如0.19-0.05，優(yōu)選地少于0.15的水活度提供組合物。水活度或aw是系統(tǒng)中水的能量狀態(tài)的測(cè)量。它定義為來(lái)源于粉末/產(chǎn)品的水的蒸汽壓除以在相同溫度下純水的蒸汽壓；因此，純蒸餾水具有準(zhǔn)確地為I的水活度。`
[0079]本發(fā)明組合物可以是清潔劑、保護(hù)劑、治療或護(hù)理乳膏、護(hù)膚洗液、凝膠或泡沫，如清潔或消毒洗液、沐浴組合物或除臭組合物。
[0080]更特別地，對(duì)于用于體外局部施用的組合物，它們可以是水溶液、水-醇溶液或油性溶液、洗液或血清類型的溶液或分散劑、通過(guò)分散水相中的脂肪相(0/W)或反過(guò)來(lái)(W/0)獲得的液體或半液體稠度的乳型乳劑或者軟的、半固體或固體稠度(solid consistency)的乳膏性混懸劑或乳劑、水凝膠或無(wú)水凝膠、微乳劑、微膠囊、微?；蛘唠x子和/或非離子型的多孔分散劑。
[0081]根據(jù)本發(fā)明的局部組合物可以有利地以適合于護(hù)發(fā)的任何植物制劑形式，特別地以洗發(fā)劑、香波，特別地去頭屑洗發(fā)劑、護(hù)發(fā)素、薰衣草洋甘菊護(hù)發(fā)素(detangler)、發(fā)乳或凝膠、造型漆(styling lacquer)、卷發(fā)藥水、治療洗液、染色組合物(特別地氧化染料)的形式，任選地以染色香波、頭發(fā)重構(gòu)洗液、電燙組合物(permanent-waving composition)、抗脫發(fā)洗液或凝膠、抗寄生蟲(chóng)香波或藥用香波，特別地低抗-皮脂溢香波、頭皮護(hù)理產(chǎn)品(其特別地抗刺激、抗老化或者重構(gòu)，或者活化血液循環(huán))的形式配制。
[0082]當(dāng)本發(fā)明組合物是乳劑時(shí)，相對(duì)于組合物的總重量，脂肪相以重量計(jì)可以為5%至80%，優(yōu)選地以重量計(jì)10%至50%。在組合物中以乳劑形式使用的油、乳化劑和輔助乳化劑可以選自在化妝品和/或皮膚病領(lǐng)域中常規(guī)使用的那些油、乳化劑和輔助乳化劑。相對(duì)于組合物的總重量，在組合物中，乳化劑和輔助乳化劑以重量計(jì)可以以0.3%至30%，優(yōu)選地以重量計(jì)0.5%至20%的比率存在。
[0083]當(dāng)本發(fā)明的組合物是油性凝膠或溶液時(shí)，脂肪相可以以超過(guò)組合物的總重量的90%存在。
[0084]用于局部施用的植物制劑形式還可以含有在化妝品、藥物和/或皮膚病領(lǐng)域中常用的輔助劑，例如親水性或親脂性膠凝劑、親水性或親脂性活性劑、防腐劑、抗氧化劑、溶劑、香料、填料、防曬劑、吸味劑和染料。這些多種輔助劑的量為所考慮領(lǐng)域使用的常規(guī)量，并且例如為組合物的總重量的0.01%至20%。取決于輔助劑的性質(zhì)，可以將它們引入到脂肪相中和/或水相中。
[0085]提及的可以用于本發(fā)明的脂肪物質(zhì)可以由這樣的物質(zhì)制備，所述物質(zhì)例如是礦物油例如氫化聚異丁烯和液體的礦脂、植物油例如牛油樹(shù)脂的液體部分、向日葵油和杏仁油、動(dòng)物油例如鯊?fù)?、合成油，特別地鴨子尾脂腺油(Purcellin oil)、肉豆蘧酸異丙酯和乙基己基棕櫚酸酯、不飽和脂肪酸和氟代油例如聚全氟聚醚。還可以使用脂肪醇、脂肪酸例如硬脂酸和例如蠟，特別地石蠟、巴西棕櫚蠟和蜂蠟。還可以將硅酮化合物例如硅酮油、環(huán)狀甲基硅酮和二甲硅油，以及硅酮蠟、樹(shù)脂和樹(shù)膠制備用于本發(fā)明的脂肪物質(zhì)。
[0086]提及的可以用于本發(fā)明的乳化劑可以由這樣的物質(zhì)制備，所述物質(zhì)例如是甘油硬脂酸酯、聚山梨醇60、由公司Henkel以名稱Sinnowax AO?銷售的包含33摩爾環(huán)氧乙燒的十六/十八醇/十六/十八烷基氧乙烯醚(cetylstearyl alcohol/oxy ethylenatedcetylstearyl alcohol)的混合物、由公司 Gattefosse 以名稱Tefose? 63銷售的 PEG-6/PEG-32/硬脂酸乙二醇酯的混合物、肉豆寇醚、硅酮乳化劑例如鯨蠟基二甲基硅氧烷共聚醇和山梨糖醇酐單硬脂酸 酯或三硬脂酸酯、PEG-40硬脂酸酯或者氧乙烯化山梨糖醇酐單硬脂酸酯(20E0)。
[0087]提及的可以用于本發(fā)明的溶劑，可以由這樣的物質(zhì)制備，所述物質(zhì)是例如低級(jí)醇，特別地乙醇、異丙醇和丙二醇。
[0088]本發(fā)明組合物還可以有利地含有泉水和/或礦泉水，特別地選自Vittel水、來(lái)自Vichy 流域(basin)的水和 la Roche Posay 水。
[0089]提及的親水性膠凝劑，可以由這樣的物質(zhì)制備，所述物質(zhì)例如是羧基聚合物如卡波姆、丙烯酸共聚物如丙烯酸酯/丙烯酸烷基酯共聚合物、聚丙烯酰胺，以及特別地由公司SEPPIC以名稱Sepigel 305?銷售的聚丙烯酰胺、C13-14異鏈烷烴和Laureth-7的混合
物、多糖例如衍生物如羥烷基纖維素，特別地羥丙基纖維素和羥乙基纖維素、天然樹(shù)膠如瓜爾豆膠、豆角膠、角豆膠和黃元膠，以及粘土。
[0090]提及的親脂性膠凝劑，可以由這樣的物質(zhì)制備，所述物質(zhì)例如是改良的粘土如膨潤(rùn)土、脂肪酸的金屬鹽如硬脂酸鋁、疏水性二氧化硅、乙基纖維素和聚乙烯。
[0091 ] 根據(jù)本發(fā)明的組合物還可以是構(gòu)成清潔皂或棒的固體制備物。
[0092]還可以將它們以溶液、乳膏、凝膠、乳劑或摩絲形式或者備選地以還含有壓力下的推進(jìn)劑的氣溶膠組合物形式用于頭皮。
[0093]在根據(jù)本發(fā)明的口服施用的情況下，優(yōu)選的是使用可消化的支持體或運(yùn)載體。取決于所考慮的組合物的類型，可消化的支持體或運(yùn)載體可以具有不同的性質(zhì)。
[0094]乳、酸奶、干酪、發(fā)酵乳、基于乳的發(fā)酵產(chǎn)品、冰淇淋、基于谷物的產(chǎn)品或者基于發(fā)酵的谷物的產(chǎn)品、早餐谷物、谷物或燕麥棒、基于乳的粉末、嬰幼兒配方食品、糖果食品、巧克力或谷物類型、特別地用于家畜的動(dòng)物飼料、片劑、凝膠膠囊或錠劑、液體細(xì)菌混懸劑、以干物質(zhì)形式的口服補(bǔ)充劑或以液體形式的口服補(bǔ)充劑都特別適合作為可吸收的支持體或運(yùn)載體。
[0095]根據(jù)本發(fā)明待口服施用的組合物可以例如以包衣片、凝膠膠囊、凝膠、乳劑、片劑、膠囊、水凝膠、食物棒、壓縮的或者松散的粉末、液體懸浮液或溶液、糖果產(chǎn)品、發(fā)酵乳、發(fā)酵乳酪、口香糖、牙膏或噴霧溶液或者食物運(yùn)載體的形式配制。
[0096]干物質(zhì)形式的藥片或錠劑、口服補(bǔ)充劑，以及液體形式的口服補(bǔ)充劑適合用作飲食或藥物支持體或者食物運(yùn)載體。
[0097]特別地，可以通過(guò)產(chǎn)生糖衣片劑、凝膠膠囊、凝膠、乳劑、片劑、膠囊和允許緩釋的水凝膠的常用方法配制組合物，例如食品補(bǔ)充劑。
[0098]特別地，可以將根據(jù)本發(fā)明的微生物摻入到所有形式的食品補(bǔ)充劑或強(qiáng)化食品，例如食物棒或者壓縮的或未壓縮的粉末中。粉末可以稀釋于水、蘇打水、乳制品或大豆衍生物中，或者可以摻入到食物棒中。
[0099]此外，可以將本發(fā)明的微生物、其部分和/或其代謝物與下述物質(zhì)一起配制，所述物質(zhì)是此類口服組合物或食品補(bǔ)充劑的常用的賦形劑和組分，特別地即脂肪和/或含水組分、濕潤(rùn)劑、增稠劑、防腐劑、質(zhì)地改進(jìn)劑(texturing agent)、增味劑和/或涂布劑、抗氧化劑、防腐劑和食品領(lǐng)域(sector)中常規(guī)使用的染料。
[0100]用于口服組合物，以及特別地用于食品補(bǔ)充劑的制劑和賦形劑是本領(lǐng)域已知的，且不是本文中詳細(xì)描述的主題。
[0101]在治療應(yīng)用中，以足以至少部分治愈或者抑制疾病及其并發(fā)癥的癥狀的量施用組合物。將足夠?qū)崿F(xiàn)該目的的量定義為“治療有效劑量”。用于該目的有效量取決于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多因素，例如疾病的嚴(yán)重性和患者的體重和一般狀態(tài)。
·[0102]在預(yù)防性應(yīng)用中，以足以至少部分降低發(fā)展成疾病的風(fēng)險(xiǎn)的量將根據(jù)本發(fā)明的組合物施用給對(duì)易感染特定疾病或者另外地處于特定疾病風(fēng)險(xiǎn)的患者。將此種量定義為“預(yù)防有效劑量”。同樣，精確的量取決于患者特異的多種因素，例如患者的健康狀態(tài)和體重。
[0103]本發(fā)明組合物以治療或預(yù)防有效量包含本發(fā)明約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的至少一種天然衍生物和/或無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)上清液。
[0104]本領(lǐng)域技術(shù)人員能相應(yīng)地調(diào)整劑量。
[0105]例如，組合物可以以每日劑量106_1012cfu，例如108_1010cfu的量包含根據(jù)本發(fā)明的約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225。
[0106]以前的工作還顯示，可以將非復(fù)制性約氏乳桿菌CNCM 1-1225用于治療或預(yù)防與免疫系統(tǒng)相關(guān)的疾病包括感染，參見(jiàn)WO 2010/133475，將其全部并入本文作為參考。發(fā)現(xiàn)，約氏乳桿菌CNCM 1-1225強(qiáng)烈地誘導(dǎo)了組成型hBDl表達(dá)，并且與約氏乳桿菌CNCM 1-1225活的對(duì)應(yīng)物相比，經(jīng)熱處理的約氏乳桿菌CNCM 1-1225更強(qiáng)烈地上調(diào)hBDl。
[0107]因此，根據(jù)本發(fā)明的約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225還可以以非復(fù)制的形式存在。
[0108]約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的“非復(fù)制性”天然衍生物包括已經(jīng)受到熱處理的衍生物。這包括滅活的、死的、無(wú)生活力的和/或以碎片如DNA、代謝物、胞質(zhì)化合物和/或細(xì)胞壁物質(zhì)存在的約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物。
[0109]“非復(fù)制性”指的是通過(guò)經(jīng)典的平板接種方法可以檢測(cè)的無(wú)生活力的細(xì)胞和/或菌落形成單位。在微生物書(shū)中概述了這些經(jīng)典的平板接種方法:James Monroe Jay, MartinJ.Loessnerj David A.Golden.2005.Modern food microbiology.7th edition, SpringerScience, New York, N.Y.790p。通常地,存活細(xì)胞的缺失可以按照以下顯示:用不同濃度細(xì)菌制備物(“非復(fù)制”的樣品)接種并且在適合的條件(有氧和/或厭氧空氣中持續(xù)至少24小時(shí))下培育后，在瓊脂平板上沒(méi)有可見(jiàn)的菌落或者在液體生長(zhǎng)培養(yǎng)基中沒(méi)有增加的濁度。顯而易見(jiàn)，非復(fù)制性微生物不會(huì)形成菌落，因此，應(yīng)將該術(shù)語(yǔ)理解為從106-1012cfu/g可復(fù)制的細(xì)菌獲得的的非復(fù)制的微生物的量。
[0110]組合物還可以以每日劑量0.005mg - 5000mg,例如0.5mg-50mg的量包含根據(jù)本發(fā)明的約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物。
[0111]本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，在不背離所公開(kāi)的本發(fā)明范圍的情況下，他們可以自由地組合本文中所述的本發(fā)明的全部特征。特別地，可以將用于描述本發(fā)明的用途的特征應(yīng)用于本發(fā)明的食品，反之亦然。
[0112]本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)和特征從以下實(shí)施例和附圖中是顯而易見(jiàn)的。
[0113]圖1顯示了用甲磺酸乙酯處理的約氏乳桿菌CNCM 1-1225的‘存活曲線’。
[0114]圖2顯示了從G堿基的氧化到DNA鏈的分離的天然突變的分子過(guò)程，其產(chǎn)生了親本和經(jīng)修飾的DNA類型的混合物，以及混合的親本和經(jīng)修飾的克隆。
[0115]圖3顯示約氏乳桿菌CNCM 1-1225D-乳酸脫氫酶基因的基因序列(SEQ ID N0:1),并圈出了經(jīng)鑒定的在約氏乳桿菌CNCM 1-4434和約氏乳桿菌CNCM 1-4441中的相應(yīng)基因中的改變。還顯示了由于約氏乳桿菌CNCM 1-4434和約氏乳桿菌CNCM 1-4441的相應(yīng)改變而翻譯的D-乳酸脫氫酶(SEQ ID NO:2)。
[0116]圖4A顯示約氏乳桿菌CNCM 1-4434D-乳酸脫氫酶基因的基因序列(SEQ IDN0:6)，框出位置611處的堿基并且與親本菌株約氏乳桿菌CNCM 1-1225相比所述堿基(C)發(fā)生改變。`
[0117]圖4B顯示約氏乳桿菌CNCM 1-4434D-乳酸脫氫酶基因的蛋白質(zhì)序列(SEQ IDNO:8)，框出位置204處的氨基酸并且與親本菌株約氏乳桿菌CNCM 1-1225相比所述氨基酸
(S)發(fā)生改變。
[0118]圖5A顯示約氏乳桿菌CNCM 1-4441D-乳酸脫氫酶基因的基因序列(SEQ IDNO:7)，框出位置458處的堿基并且與親本菌株約氏乳桿菌CNCM 1-1225相比所述堿基(G)發(fā)生改變。
[0119]圖5B顯示約氏乳桿菌CNCM 1-4441D-乳酸脫氫酶基因的基因序列(SEQ IDNO: 9)，框出位置153處的氨基酸并且與親本菌株約氏乳桿菌CNCM 1-1225相比所述氨基酸發(fā)生改變(G)。
[0120]實(shí)施例1.用甲磺酸乙酯處理約氏乳桿菌CNCM 1-1225培養(yǎng)物。用Dulbecco’s磷酸緩沖鹽水洗滌100 μ I含大約108個(gè)菌落形成單位的16個(gè)小時(shí)的約氏乳桿菌CNCM 1-1225培養(yǎng)物的樣品3次。最后，將細(xì)胞懸浮在Iml PBS中，加入O、10 μ I甲磺酸乙酯并在37°C，在沒(méi)有振蕩的情況培養(yǎng)。在PBS中洗滌經(jīng)處理的細(xì)胞2次，測(cè)定經(jīng)處理的和未處理培養(yǎng)物的CFU，并對(duì)存活者作圖，以產(chǎn)生圖1中所述的‘存活曲線’。最初靶向了產(chǎn)生1%存活者的條件并包括(bracket)之前和之后的時(shí)間點(diǎn)，稀釋細(xì)胞，并在MRS平板上將細(xì)胞接種為單個(gè)菌落。然后，剩余的經(jīng)處理的細(xì)胞用于接種10ml MRS肉湯，并在37°C培養(yǎng)16小時(shí)。然后，稀釋培養(yǎng)物，并鋪展在MRS平板上，以產(chǎn)生用于篩選的單個(gè)菌落。[0121]如圖2中所示，當(dāng)通過(guò)DNA復(fù)制解析時(shí)，在細(xì)菌中，主要通過(guò)雙鏈DNA中鳥(niǎo)苷(G)殘基的氧化，天然地發(fā)生突變，通常產(chǎn)生單堿基對(duì)改變。取決于所測(cè)序的DNA鏈，這導(dǎo)致G至腺苷(A)和胞苷(C)至胸苷(T)改變的天然突變譜。甲磺酸乙酯起著化學(xué)氧化G堿基的作用，導(dǎo)致與天然突變相同的突變譜，即取決于所測(cè)序的DNA鏈，產(chǎn)生G至A和C至T的突變。這隨后通過(guò)D-乳酸脫氫酶基因和基因組序列的DNA測(cè)序進(jìn)行了確證，其中大多數(shù)觀察到的改變都是G至A或C至T。
[0122]實(shí)施例2.篩選缺失D-乳酸產(chǎn)生菌株的各個(gè)菌落。將經(jīng)甲磺酸乙酯處理的各個(gè)菌落接種到含200 μ I MRS肉湯的96孔板中，并在37°C培養(yǎng)24小時(shí)，以形成最小的培養(yǎng)物。使用Tecan sunrise酶標(biāo)儀(microplate reader),通過(guò)620nm處的吸光度估計(jì)培養(yǎng)物的生長(zhǎng)。將10 μ I的培養(yǎng)上清液與190 μ I反應(yīng)混合物混合，在室溫溫育I小時(shí)，所述反應(yīng)混合物含IOOmM Tris HCl pH9,2.5mM EDTA pH8.0，20U/ml D-乳酸脫氫酶(來(lái)自腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroide)), lmg/ml NAD ( β -煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)加上 3% 水合肼(hydrazinium hydroxide)。然后使用 Tecan sunrise 酶標(biāo)儀測(cè)量 320nm(形成 β-NADH)的吸光度，并將數(shù)據(jù)輸出至excel用于分析。在每一平板上，將僅含MRS的對(duì)照和含5%、25%、50%或100%濃度的約氏乳桿菌CNCM 1-1225培養(yǎng)上清液作為歸一化數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)。
[0123]進(jìn)行分離的菌落的表型分析，以確定培養(yǎng)后培養(yǎng)基中D-乳酸的存在或者不存在。當(dāng)篩選各個(gè)菌落中的D-乳酸的存在時(shí)，還清楚的是含有50%的D-乳酸產(chǎn)生者和50%的非D-乳酸產(chǎn)生者的‘混合’培養(yǎng)物將導(dǎo)致培養(yǎng)物為D-乳酸存在的‘陽(yáng)性’。因此，認(rèn)為我們靶向的D-乳酸缺失表型為D-乳酸產(chǎn)生表型的‘隱性’。這是重要的，當(dāng)我們將圖2中所示的誘變的示意圖考慮為單個(gè)氧化的G堿基時(shí)，會(huì)導(dǎo)致最終的菌落為親本和改變個(gè)體的混合物，因此在表型上為D-乳酸陽(yáng) 性。在這種情況下，對(duì)于分離缺失D-乳酸產(chǎn)生的菌株，在甲磺酸乙酯處理后在MRS肉湯中的培養(yǎng)是必要的。篩選了大約21，000個(gè)經(jīng)甲磺酸乙酯處理的單個(gè)菌落后，分離了 15個(gè)缺失D-乳酸產(chǎn)生的菌落，并進(jìn)行了進(jìn)一步分析。
[0124]實(shí)施例3.測(cè)定培養(yǎng)基中D-乳酸水平。在37°C，在MRS肉湯中培養(yǎng)培養(yǎng)物16個(gè)小時(shí)，并通過(guò)離心去除細(xì)菌。為了測(cè)定D-乳酸濃度，將無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)上清液稀釋于水中，如上所述進(jìn)行分析，并將所述結(jié)果與用D-乳酸鈉稀釋液制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較。通過(guò)用兔肌肉L-乳酸脫氫酶交換D-乳酸脫氫酶，并使用L-乳酸鈉作為標(biāo)準(zhǔn)，以相同的方式測(cè)定L-乳酸濃度。對(duì)CNCM 1-4431和CNCM 1-4434進(jìn)行的這種分析的結(jié)果顯示于表1中，并且包括了對(duì)照:約氏乳桿菌CNCM 1-1225、具有GMO失活的D-乳酸脫氫酶基因的約氏乳桿菌NCC9006，以及認(rèn)為是L-乳酸產(chǎn)生菌株的類干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei )NCC2461和鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)NCC4007。
[0125]類干酪乳桿菌NCC2461 (登記號(hào)=CNCM 1-2116)于1999年I月12日在布達(dá)佩斯條約下保藏于CNCM (地址已經(jīng)提及)。鼠李糖乳桿菌NCC4007 (登記號(hào):CGMCC1.3724)于2004年10月在布達(dá)佩斯條約下保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(China GeneralMicrobiological Culture Collection Center)(CGMCC),微生物學(xué)研究所(Institute ofMicrobiology),中國(guó)科學(xué)院(Chinese Academy of Sciences),北辰西路(West BeichenRoad) I 號(hào)，朝陽(yáng)區(qū)(Chaoyang District),北京 100101,中國(guó)。如在 Lapierre 等人，標(biāo)題為“D-Lactate Dehydrogenase Gene (IdhD) Inactivation and Resulting MetabolicEffects in the Lactobacillus johnsonii Strains Laland N312:(Appl.Environ.Microbiol.1999,65 (9):4002)的文章中所述，約氏乳桿菌NCC9006是來(lái)源于約氏乳桿菌Lal的菌株。
[0126]表1.從無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)物中測(cè)定的CNCM 1-1225、CNCM 1-4431和CNCM 1-4434的D-和L-乳酸的值。對(duì)照包括菌株NCC9006 (具有GMO失活的D-乳酸脫氫酶基因的約氏乳桿菌菌株)、認(rèn)為是L-乳酸產(chǎn)生菌株的類干酪乳桿菌NCC2461和鼠李糖乳桿菌NCC4007。實(shí)驗(yàn)一式三份地進(jìn)行，并表示為平均值加上括號(hào)內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)差。
[0127]
【權(quán)利要求】
1.約氏乳桿菌菌株CNCM1-1225的天然衍生物，其中所述約氏乳桿菌菌株CNCM1-1225的衍生物缺失D-乳酸產(chǎn)生。
2.權(quán)利要求1的約氏乳桿菌菌株CNCM1-1225的天然衍生物，其中所述約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物的D-乳酸脫氫酶序列在氨基酸位置153處包含甘氨酸至天冬氨酸的氨基酸改變和/或在氨基酸位置204處包含絲氨酸至亮氨酸的氨基酸改變。
3.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的約氏乳桿菌菌株CNCM1-1225的天然衍生物，其中所述約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物中的D-乳酸脫氫酶基因的核酸序列在核酸位置498處包含G至A的轉(zhuǎn)變和/或在核酸位置651處包含C至T的轉(zhuǎn)變。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的約氏乳桿菌菌株CNCM1-1225的天然衍生物，其選自約氏乳桿菌菌株CNCM 1-4434和約氏乳桿菌菌株CNCM 1-4441。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的約氏乳桿菌菌株CNCM1-1225的天然衍生物，其中所述約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物以生物學(xué)上純的培養(yǎng)物存在。
6.無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)上清液，其分離自權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的約氏乳桿菌菌株CNCM1-1225的天然衍生物的生物學(xué)上純的培養(yǎng)物。
7.包含權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的約氏乳桿菌菌株CNCM1-1225的天然衍生物和/或權(quán)利要求6的無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)上清液的組合物的用途，用于制備在通過(guò)治療處理人體或動(dòng)物體的方法中使用的組合物。
8.包含權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的約氏乳桿菌菌株CNCM1-1225的天然衍生物和/或權(quán)利要求6的無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)上清液的組合物的用途，用于治療或預(yù)防與減弱的免疫系統(tǒng)相關(guān)的病癥。
9.權(quán)利要求8的組合物的用途，其中所述與減弱的免疫系統(tǒng)相關(guān)的病癥選自流感、鼻炎、普通感冒及其組合。
10.包含權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的約氏乳桿菌菌株CNCM1-1225的天然衍生物和/或權(quán)利要求6的無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)上清液的組合物的用途，用于治療或預(yù)防與腸道毒性細(xì)菌或病毒的細(xì)胞附著和細(xì)胞入侵相關(guān)的疾病。
11.權(quán)利要求10的組合物的用途，其中所述與腸道毒性細(xì)菌或病毒物種的細(xì)胞附著和細(xì)胞入侵相關(guān)的疾病選自下呼吸道感染、胃腸道感染、中耳炎及其組合，并且其中所述腸道毒性物種優(yōu)選地選自沙門氏菌屬(Salmonella);彎曲桿菌屬(Campylobacter);利斯特氏菌屬(Listeria);大腸桿菌菌株，如ETEC、EHEC, EPEC或EIEC菌株；耶爾森氏菌屬(Yersinia);志賀氏菌屬(Shigella);產(chǎn)毒素細(xì)菌，如金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、肉毒梭狀芽胞桿菌(Clostridium botulinum)或臘狀芽抱桿菌(Bacilluscereus) ；Vibrio vulnifucus/parahaemoIyticus (副溶血弧菌);輪狀病毒屬(rotavirus);諾瓦克病毒(norovirus)；腸出血型大腸桿菌(verotoxigenic E.coli)；阪崎腸桿菌(Enterobacter sakazakii);產(chǎn)毒的產(chǎn)氣莢膜梭菌(toxigenic C.perfringens) (A 型和B型)；食源性寄生蟲(chóng)，如棘球蝴(Echinococcus)、弓形體(Toxoplasma)或賈第蟲(chóng)屬(Giardia);幽門螺桿菌(Helicobacter pylori);艱難梭菌(Clostridium difficile);破傷風(fēng)梭菌(Clostridium tetani)及其組合。
12.權(quán)利要求7-11中任一項(xiàng)的組合物的用途，其中所述組合物選自食品組合物、寵物食品組合物、飲料、乳制品、營(yíng)養(yǎng)制劑、嬰兒配方食品、食品添加劑、營(yíng)養(yǎng)制品、藥物組合物、食品成分和/或化妝品組合物。
13.權(quán)利要求7-12中任一項(xiàng)的組合物的用途，其中所述組合物選自酸化的乳制品，例如酸奶或酸奶飲料；或者基于乳的粉末。
14.權(quán)利要求7-13中任一項(xiàng)的組合物的用途，其中所述組合物以每日劑量IO6-1O12Cfu的量包含權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物。
15.權(quán)利要求7-14中任一項(xiàng)的組合物的用途，其含有每日劑量約0.005mg - 5000mg權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的約氏乳桿菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物。
【文檔編號(hào)】C12N1/20GK103582698SQ201280025966
【公開(kāi)日】2014年2月12日 申請(qǐng)日期:2012年3月29日 優(yōu)先權(quán)日:2011年3月29日
【發(fā)明者】R-D·普里德莫爾, F·法塔, M·戴雷, I·揚(yáng)科維奇 申請(qǐng)人:雀巢產(chǎn)品技術(shù)援助有限公司