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用于增強免疫功能的乳桿菌的制作方法

文檔序號:833232閱讀:636來源:國知局
專利名稱:用于增強免疫功能的乳桿菌的制作方法
技術領域
本發(fā)明是關于免疫功能增強劑,其可以增加人體干擾素的產生并增強人體免疫功能。
干擾素(IFN)由多種細胞產生,如白細胞、成纖維細胞和T淋巴細胞,它在受病毒感染時產生并保護其它細胞不受病毒感染。因此,干擾素具有抑制病毒繁殖的作用。
幾種干擾素中,據(jù)報道IFN-α的產量在患癌癥、糖尿病、結核病等的病人中降低,產IFN-α的能力與對感染的敏感性成負性相關。
另外,還報道了IFN-γ的產量在癌癥病人中降低,而在患橋本氏病和自身免疫病等的病人中產量增高。
還已知IFN-γ的產生對人體免疫功能的貢獻不同于IFN-α的產生所反映的貢獻。
因此,產生IFN-α和IFN-γ的能力被作為評價人體免疫功能的有用參數(shù)。
增強這些免疫功能被認為可改善免疫功能缺陷病人的一般狀況和生活質量。
為了增強免疫功能,已建議服用IFN或使用強免疫增效劑如OK432。
已知自然殺傷細胞(NK)活性與癌癥病人狀況相關,眾所周知服用IFN可增強NK細胞的活性。
但是,重復使用IFN或免疫增效劑如OK432發(fā)現(xiàn)會引起副作用。如內環(huán)境紊亂、發(fā)熱和不適。
因此,不是服用IFN,而是發(fā)展了免疫功能增強劑,其可以提高人體內干擾素的產生并增強免疫功能。實際上,已建議雙螺旋RNA、吡喃共聚物、陰離子高聚物和多種多糖(見日本專利公開No.Hei.3-9882)作為免疫功能增強劑。
但是,因為這些熟知的免疫功能增強劑不是人體中自然存在的,所以這些增強劑有毒性,當用來治療感染或腫瘤時,在人體中可產生副作用。
本發(fā)明的一個目的是提供一種免疫功能增強劑,它可增加干擾素的產生并增強人體免疫功能。使用免疫功能增強劑可治療或預防感染和腫瘤。
在這一點上,本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)了一種包括短乳桿菌凝結亞種(Lactobacillusbrevissubsp.coagulans)菌粉的免疫功能增強劑。
短乳桿菌凝結亞種菌粉可用例如以下步驟產生首先,作為乳桿菌(Lactobacillus)來源的起始菌種在25-35℃、100rpm速度攪拌下在下述培養(yǎng)基A、B或C中培養(yǎng)18-40小時。
然后,濃縮或離心培養(yǎng)液,再冷凍干燥為短乳桿菌凝結亞種菌粉。
培養(yǎng)基A①酵母膏0.5%②葡萄糖1.5%③磷酸二氫鉀0.5%④磷酸氫鈉2.0%⑤氯化鈉0.425%⑥氫氧化鈉0.0375%⑦脫脂黃豆提取物8.75%⑧碳酸鈣沉淀0.1%培養(yǎng)基B蛋白胨(polypeptone)0.5-1.0%酵母膏0.5-1.0%葡萄糖0.5-1.0%pH6.5-7.0培養(yǎng)基C酵母膏0.55%葡萄糖1.10%蛋白胨1.25%
磷酸二氫鈉0.025%磷酸氫鈉0.025%硫酸鎂0.01%硫酸錳0.0005%pH6.5-7.0制備培養(yǎng)基A時,組分①-⑦加熱下溶解在水中。然后,溶液中加入組分⑧后,調節(jié)溶液pH為6.8-7.0,再在121℃高壓蒸氣滅菌15分鐘。另外,脫脂黃豆提取物用下述步驟制備脫脂后,將黃豆浸在稀鹽酸(約0.25N)中,加入胃蛋白酶,然后混合物在不時攪拌下在37℃保持40-48小時消化。消化后,加入氫氧化鈉中和此溶液。然后離心此溶液,取出上清液作為脫脂黃豆提取物。
起始菌種最好從食物如乳桿菌(Tsukemono)發(fā)酵的蔬菜中得到。每種培養(yǎng)基A、B和C50l產生100-500g細菌粉末,其中每g含20-500億個細菌(2×109-5×1010/g)。
菌粉最好以粉末、片劑、膠囊或粒化粉末的形式口服給藥。
制備片劑時,菌粉可與L-谷氨酸鈉(10%)或與作為分散介質的脫脂奶粉(10%)和L-谷氨酸鈉的混合物、及作為賦形劑的干馬鈴薯淀粉混合。
下面詳細描述本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。
起始菌種得自乳桿菌發(fā)酵的日本蕓苔屬Suigukina變種(Bras-sicaJaponicaVar.Suigukina)。起始菌種在25°-35℃下、在100rpm攪拌下,在培養(yǎng)基A中培養(yǎng)細菌30小時。然后約10000rpm離心培養(yǎng)液,并冷凍干燥成為細菌粉末,稱其為短乳桿菌PK。
用這種方法得到的細菌粉末具有下列乳桿菌特征的特性(1)-(6),基于它具有示于下表1的酵解特征,此細菌粉末還被鑒定為短乳桿菌凝結亞種。
(1)它為革蘭氏陽性桿菌。
(2)它分解培養(yǎng)基中的碳酸鈣。
(3)它用培養(yǎng)基中的葡萄糖產生乳酸。
(4)還原硝酸鹽的能力為陰性。
(5)液化明膠的能力為陰性。
(6)消化酷蛋白的能力為陰性。
然后,將干馬鈴薯粉加到上述方法得到的菌粉中,并調節(jié)菌粉使其每g含108-109個細菌。再加入無水乳糖作為賦形劑。由此制備250mg的片劑。
每天年齡在25-65歲的4名健康男性和6名健康女性口服6個片劑,計4周。給藥前及給藥后2周和4周采外周血液于含肝素試管中。測定IFN-α和IFN-γ的產量、自然殺傷細胞(NK)活性和2-5A(2′,5′寡腺苷酸)合成活性,測定結果示于表2和表3。
IFN-α和-γ利用FL-細胞(來自人羊膜)和Sindobis病毒用50%CPE(細胞致病作用)的生物檢測方法進行測定。
用于測定IFN-α的方法的一個例子描述如下肝素化外周血液用全血方法處理以產生IFN。然后離心管中收集2ml全血。加入HVJ(Sendai病毒),其最終濃度為500HA/ml。37℃培養(yǎng)20小時,然后3,000rpm離心。收集上清液以測量IFN-α的產量。
下面描述用于測定IFN-γ的方法的一個例子肝素化外周血液在Eagle'sMEM中稀釋4倍,加入PHA-P(購自Sigma)使終濃度為25μg/ml。37℃培養(yǎng)48小時后,3,000rpm離心,收集上清液作為IFN-γ樣品。
在測定NK細胞活性時,用Ficoll-Paque方法從外周血中分離出外周單核細胞,這樣得到了效應細胞。用Cr51標記的K562細胞作為靶細胞與效應細胞以E/T(效/靶)比為20∶1進行混合。用常規(guī)方法測定細胞毒性。
無刺激血漿中2-5A合成酶活性太低,檢測不出,用HVJ(Sendai病毒)刺激血漿20小時后測其2-5A合成酶活性,以評價IFN-α的產生能力。用放射免疫測定試劑盒(EikenChemicalCo.Tokyo生產)測定2′,5′-寡腺苷酸(2-5A)合成酶活性。
從表2和表3所示結果可清楚看出,上述方法制備的菌粉提高了IFN-α的產量、NK細胞活性和2-5A合成酶活性。
另外,菌粉在給藥后,血液測試表明在任何個體中與標準值沒有大的差異。
表1
表2
表3
權利要求
1.組合物,其含有短乳桿菌凝結亞種菌粉。
2.權利要求1的組合物,其中所述短乳桿菌凝結亞種菌粉每克含有2×109-5×1010個細菌。
3.權利要求1或2的組合物,其形成粉劑、片劑、膠囊或?;蹌?。
4.權利要求1或2的組合物,其中短乳桿菌凝結亞種得自乳桿菌發(fā)酵的日本蕓苔屬Suigukina變種。
5.權利要求3的組合物,其中短乳桿菌凝結亞種得自乳桿菌發(fā)酵的日本蕓苔屬Suigukina變種。
6.增強病人免疫力的方法,其包括給需要這種治療的病人服用增強免疫力有效量的權利要求1的組合物。
7.增加人體內IFN-α的產量的方法,其包括給人服用增加IFN-α產量有效量的權利要求1的組合物。
8.提高人體自然殺傷細胞活性的方法,其包括給人服用提高自然殺傷細胞活性有效量的權利要求1的組合物。
9.提高人體內2-5A合成酶活性的方法,其包括給人服用提高2-5A合成酶活性有效量的權利要求1的組合物。
全文摘要
含有短乳桿菌凝結亞種的組合物用于增強病人的免疫功能,特別是關于增加干擾素的產生、2—5A合成酶活性和自然殺傷細胞活性。
文檔編號A61K39/02GK1105883SQ94101198
公開日1995年8月2日 申請日期1994年1月31日 優(yōu)先權日1994年1月31日
發(fā)明者岸田綱太郎 申請人:財團法人京都巴斯德研究所, 信和藥品株式會社, 日東藥品工業(yè)株式會社
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