一種人參鑒定方法及專用試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種人參鑒定方法及專用試劑盒。本發(fā)明所提供的方法包括如下步驟：a)從待測樣品中提取基因組DNA作為模板，采用引物對A(序列1和序列2)進行PCR擴增；b)向擴增后的反應體系中加入熒光染料SYBR Green I，按照如下方法確定待測樣品中是否含有人參：若觀察到所述反應體系產(chǎn)生綠色熒光，則所述待測樣品中含有或候選含有人參；若觀察不到所述反應體系產(chǎn)生綠色熒光，則所述待測樣品不含有或候選不含有人參。實驗證明，采用本發(fā)明方法實現(xiàn)了人參與西洋參、三七、竹節(jié)參、珠子參、羽葉三七的快速、準確鑒別，并引入了熒光染料法對真?zhèn)舞b別結(jié)果進行檢測，為實現(xiàn)藥材分子鑒別的現(xiàn)場運用提供技術支撐。
【專利說明】一種人參鑒定方法及專用試劑盒

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學領域，涉及一種人參鑒定方法及專用試劑盒。

【背景技術】
[0002] 人參屬植物藥材的鑒定方法主要有形態(tài)鑒定、理化鑒定、細胞鑒定等，這些傳統(tǒng)的 鑒定手段由于易受環(huán)境條件的影響或植物本身的限制，人為干擾因素較多，無法直接體現(xiàn) 種質(zhì)的遺傳特征，有時難以得到準確的結(jié)果（周延清.DNA分子標記技術在植物研究中的應 用.北京：化學工業(yè)出版社，2005.)。
[0003] DNA分子標記技術是近二十年來興起并不斷發(fā)展和完善的新檢測技術。近年來， DNA分子標記技術在人參屬植物的許多研究中均有應用，如中藥鑒定、遺傳多樣性與種質(zhì) 資源、物種進化與親緣關系、野生類型與栽培品種的鑒別、道地性等。而就DNA分子標記 技術在人參屬植物鑒定中的應用而言，DNA分子標記則是從分子水平上客觀地反映待測 材料基因片段之間的差異，鑒別結(jié)果不受環(huán)境因素、樣品形態(tài)和材料來源的影響，一般通 過雜交或電泳等方式就能直觀地體現(xiàn)出來，結(jié)果更為準確可靠。因此，中藥鑒定也就成 為DNA分子標記在人參屬植物中應用最早且最多的領域。在DNA分子標記技術中應用最 多的是隨機擴增多態(tài)性（RAPD)技術。Shaw和But于1995年首先采用RAPD方法明顯地 區(qū)分開人參屬的3種藥材人參、西洋參、三七和桔梗、紫茉莉、護蘭Talinum paniculatum 及商陸 Phytolacca Acinosa 4 種偽品（Shaw PC, But PP. Authentication of Panax species and their adulterants by random-primed polymerase chain reaction. Planta Med，1995, 61 (5) :466.)。Kim等的研究表明RAH)標記可以方便有效地將韓國人參和其他人 參屬植物鑒別開（Kim HJ, Lim CJ, Cho JH, et al. Molecular differentiation of panax species by RAPD analysis.Arch Pharm Res，2003,26(8):601.)。除RAPD 技術外，隨機 引物PCR(AP-PCR)、聚合酶鏈式反應（PCR)直接測序、rRNA和特征性片斷擴增區(qū)域（SCAR) 等技術也被應用在人參屬植物藥材的鑒定中。1994年，Cheung等首次將AP-PCR技術應用 在人參與西洋參的藥材鑒別中（Cheung KS, Kwan HS, But PP, el al. Pharmacognostical identification of American and Oriental ginseng roots by genomic fingerprinting using arbitrarily primed polymerase chain reaction (AP-PCR). Journal of Ethnop harmacology, 1994, 42 (I) : 67.)。崔光紅等利用多重等位基因特異PCR鑒別人參與西洋參 (崔光紅，唐曉晶，黃璐琦.利用多重等位基因特異PCR鑒別人參、西洋參，中國中藥雜志， 2006, 31 (23) : 1940)。詹鑫婕等依據(jù)人參和西洋參ITS2條形碼的專屬性鑒別位點，建立利 用聚合酶鏈反應-單鏈構(gòu)象多態(tài)性技術（PCR-SSCP)鑒別人參和西洋參的方法（詹鑫婕， 田程，張媛，等.基于ITS2條形碼SNPs的人參和西洋參PCR-SSCP分子鑒別研究，中國 中藥雜志，2012, 37 (24) : 3748)。
[0004] 綜上所述，不同研究學者分別采用RAro法、AP-PCR法、PCR-SSCP法、多重PCR法等 對人參與人參屬中其它藥材進行鑒定研究，但這些方法測試時間較長，且均需要電泳檢測 才可完成，因此相比較熒光染色方法繁瑣，不利于現(xiàn)場快速鑒別的應用與推廣。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種人參鑒定方法及專用試劑盒。
[0006] 本發(fā)明所提供的人參鑒定方法為鑒定或輔助鑒定待測樣品中是否含有人參的方 法，具體包括如下步驟：
[0007] (a)從待測樣品中提取基因組DNA作為模板，采用引物對A進行PCR擴增；所述引 物對A為由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對；
[0008] (b)向步驟（a)擴增后的反應體系中加入熒光染料SYBR Green I，得到含有熒光 染料的體系，按照如下方法確定待測樣品中是否含有人參：若觀察到所述含有熒光染料的 體系產(chǎn)生綠色熒光，則所述待測樣品中含有或候選含有人參；若觀察不到所述含有熒光染 料的體系產(chǎn)生綠色熒光，則所述待測樣品不含有或候選不含有人參。
[0009] 在所述方法的步驟（b)中，確定所述含有熒光染料的體系是否產(chǎn)生綠色熒光具體 是在365nm紫外波長下進行觀察的。
[0010] 在所述方法的步驟（b)中，向所述反應體系中加入所述熒光染料SYBR Green I時，所述熒光染料SYBR Green I的加入量為：每20 ii L所述反應體系中加入Iii L 100XSYBR Green I。在本發(fā)明中，所述100XSYBR Green I具體為Invitrogen公司產(chǎn)品， 其產(chǎn)品目錄號為1135054。
[0011] 在所述方法的步驟（a)中，進行所述PCR擴增時采用的退火溫度具體為65°C。
[0012] 在本發(fā)明中，進行所述PCR擴增時采用的具體反應條件如下：88 °C Imin ; 88°C 10s、65°C 15s、31 個循環(huán)。
[0013] 在所述方法的步驟（a)中，在進行所述PCR擴增的反應體系中，所述引物對中每條 單鏈DNA分子的終濃度均為125nM。
[0014] 在本發(fā)明中，進行所述PCR擴增時采用的具體反應體系如下：2. OiiL IOXbuffer 緩沖液，I. 6 ii L濃度為2. 5mM的dNTP，0. 5 ii L濃度為5 ii M的序列1所示的引物F1，0. 5 ii L 濃度為5iiM的序列2所示的引物F2,0.2iiL rTaq DNA聚合酶（Takara公司，5U/iiL)， 0. 5 ii L模板DNA，無菌雙蒸水補足至20 ii L。
[0015] 本發(fā)明所提供的試劑盒為用于鑒定或輔助鑒定人參的試劑盒，該試劑盒中含有引 物對A、dNTP、DNA聚合酶和熒光染料SYBR Green I ;所述引物對A為由序列表中序列1和 序列2所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對。
[0016] 所述試劑盒中還可含有記載有如上所述方法的說明書。
[0017] 所述試劑盒的制備方法也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0018] 所述試劑盒的制備方法，具體可包括如下A)或B)的步驟：
[0019] A)將組成所述引物對A的兩條單鏈DNA分子分別單獨包裝后，與分別單獨包裝的 dNTP、DNA聚合酶和SYBR Green I包裝于同一個試劑盒內(nèi)；
[0020] B)將組成所述引物對的兩條單鏈DNA分子分別單獨包裝后，與分別單獨包裝的 dNTP、DNA聚合酶、SYBR Green I和所述說明書包裝于同一個試劑盒內(nèi)。
[0021] 所述試劑盒在鑒定或輔助鑒定人參中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0022] 在上述方法中，所述人參可為基原植物，也可為藥材人參。相應的，所述待測樣品 可為植株，也可為單一或混合的中藥材成品。
[0023] 實驗證明，采用本發(fā)明所提供的快速PCR及熒光染色的方法實現(xiàn)了人參與西洋 參、三七、竹節(jié)參、珠子參、羽葉三七的快速、準確鑒別，為實現(xiàn)藥材分子鑒別的現(xiàn)場運用提 供技術支撐。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024] 圖1為人參與西洋參、三七、竹節(jié)參、珠子參、羽葉三七PCR鑒別結(jié)果。其中，泳道 1為陰性對照；泳道2-7為人參（吉林集安市）；泳道8-12為人參（吉林省白山市）；泳道 13為西洋參（吉林長春）；泳道4為三七（云南文山州）；泳道15為竹節(jié)參（湖北省宣恩 縣）；泳道16為珠子參（湖北省恩施市）；泳道17為羽葉三七（云南昭通市）；泳道M為 DNA 分子量標準：從上至下依次為 2000bp、IOOObp、750bp、500bp、250bp、IOObp。

【具體實施方式】
[0025] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0026] 下述實施例中所用的試劑如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0027] 下述實施例中所用材料如表1所示：
[0028] 表1樣品來源表
[0029]

【權利要求】
1. 鑒定或輔助鑒定待測樣品中是否含有人參的方法，包括如下步驟： (a) 從待測樣品中提取基因組DNA作為模板，采用引物對A進行PCR擴增；所述引物對 A為由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對； (b) 向步驟（a)擴增后的反應體系中加入熒光染料SYBR Green I，得到含有熒光染料 的體系，按照如下方法確定待測樣品中是否含有人參：若觀察到所述含有熒光染料的體系 產(chǎn)生綠色熒光，則所述待測樣品中含有或候選含有人參；若觀察不到所述含有熒光染料的 體系產(chǎn)生綠色熒光，則所述待測樣品不含有或候選不含有人參。
2. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于：在步驟（b)中，確定所述含有熒光染料的 體系是否產(chǎn)生綠色熒光是在365nm紫外波長下進行觀察的。
3. 根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其特征在于：在步驟（a)中，進行所述PCR擴增時 采用的退火溫度為65°C。
4. 根據(jù)權利要求3所述的方法，其特征在于：進行所述PCR擴增時采用的擴增程序為： 88°C lmin ;88°C 10s、65°C 15s、31 個循環(huán)。
5. 用于鑒定或輔助鑒定人參的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒中含有引物對A、 dNTP、DNA聚合酶和熒光染料SYBR Green I ; 所述引物對A為由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對。
6. 根據(jù)權利要求5所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒中還含有記載有權利要求 1-4中任一所述方法的說明書。
7. 制備權利要求5或6所述試劑盒的方法，包括如下A)或B)的步驟： A) 將組成所述引物對A的兩條單鏈DNA分子分別單獨包裝后，與分別單獨包裝的 dNTP、DNA聚合酶和SYBR Green I包裝于同一個試劑盒內(nèi)； B) 將組成所述引物對的兩條單鏈DNA分子分別單獨包裝后，與分別單獨包裝的dNTP、 DNA聚合酶、SYBR Green I和所述說明書包裝于同一個試劑盒內(nèi)。
8. 權利要求5或6所述的試劑盒在鑒定或輔助鑒定人參中的應用。
【文檔編號】C12Q1/68GK104450938SQ201410827967
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月25日 優(yōu)先權日:2014年12月25日
【發(fā)明者】黃璐琦, 袁媛, 崔占虎, 蔣超 申請人:中國中醫(yī)科學院中藥研究所