一株新型高產(chǎn)黑色素的菌株Streptomyces kathirae SC-1的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明成功篩選到一株以酪氨酸為底物，生產(chǎn)黑色素的菌株，通過(guò)16S rRNA鑒定，發(fā)現(xiàn)該菌株與Streptomyces kathirae相似度最高，故將其命名為Streptomyces kathirae SC-1，與國(guó)內(nèi)外已報(bào)道產(chǎn)黑色素鏈霉菌16Sr RNA進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)其最高相似度僅為95.37％，說(shuō)明Streptomyces kathirae SC-1是一株新型產(chǎn)黑色素鏈霉菌，該菌株已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為：CCTCC M 2012432。對(duì)該菌株所產(chǎn)黑色素進(jìn)行了光譜學(xué)鑒定，證明所產(chǎn)黑色物質(zhì)為黑色素，發(fā)現(xiàn)該黑色素可以螯合Cu2+、Al3+、Fe3+，并且對(duì)Al3+的螯合作用尤其顯著。因此，S.kathirae SC-1為一種新型產(chǎn)黑色素菌株。在種子培養(yǎng)基中活化后，接種于最優(yōu)培養(yǎng)基中，28℃，200rpm的搖床上發(fā)酵5d，該菌株的黑色素產(chǎn)量可達(dá)到13.7g/L，達(dá)到領(lǐng)先水平。CCTCC NO：M 201243220121026
【專利說(shuō)明】—株新型高產(chǎn)黑色素的菌株Streptomyces kathirae SC-1

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]從土壤中篩選黑色素高產(chǎn)菌株，屬于生物工程中發(fā)酵【技術(shù)領(lǐng)域】。
技術(shù)背景
[0002]隨著有關(guān)人造黑色素的致癌、致病的報(bào)道不斷增多，人們?nèi)找骊P(guān)注人造色素對(duì)人體造成的危害。人們對(duì)色素的生物安全性的關(guān)注度越來(lái)越高。天然的黑色素是非均質(zhì)多酚類聚合體，以酪氨酸為底物，由酪氨酸酶催化后生成L-多巴、多巴鉻等，而后經(jīng)過(guò)一系列非酶催化的氧化反應(yīng)最終生成黑色素。黑色素廣泛存在于動(dòng)植物和微生物中，與生物自我保護(hù)機(jī)制有關(guān)。有研究表明，天然的黑素色具有紫外吸收、抗氧化、清除自由基、螯合陽(yáng)離子(例如有毒的重金屬)、新型的藥物載體、作為治療某些與黑色素缺乏相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，例如著色性干皮病、帕金森氏癥、老年性癡呆癥、亨廷氏舞蹈病等，有報(bào)道指出，可溶性的黑色素在體外具有抗HIV的活性，為治療艾滋病開辟了一個(gè)新途徑。目前黑色素生產(chǎn)主要為動(dòng)植物提取和采用化學(xué)法以酪氨酸為原料生產(chǎn)，這兩種方法成本高、工藝繁瑣，使黑色素因價(jià)格昂貴而限制其大規(guī)模的生產(chǎn)與應(yīng)用。微生物所產(chǎn)的黑色素是由其體內(nèi)的酪氨酸酶催化酪氨酸形成的多巴類黑色素，是氨基酸的衍生物，具有無(wú)毒、無(wú)害等特點(diǎn)，而且產(chǎn)黑色素的微生物種類繁多，生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，易于操作，不受時(shí)間與地域的限制，因此用微生物來(lái)生產(chǎn)黑色素具有巨大的優(yōu)勢(shì)。
[0003]本實(shí)驗(yàn)室從土壤中篩選到一株新型高產(chǎn)黑色素的鏈霉菌，并且對(duì)其進(jìn)行進(jìn)行了菌株鑒定，確定其為Streptomyces kathirae SC-1,與國(guó)內(nèi)外已報(bào)道產(chǎn)黑色素鏈霉菌16SrRNA進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)其最高相似度僅為95.37%,說(shuō)明Streptomyces kathirae SC-1是一株新型產(chǎn)黑色素鏈霉菌，目前該菌株保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為:CCTCC M2012432，對(duì)其培養(yǎng)基進(jìn)行了響應(yīng)面優(yōu)化，培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定了該菌株產(chǎn)黑色素的最佳培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件，在三角瓶中該菌的黑色素產(chǎn)量可達(dá)13.7g/L，達(dá)到國(guó)內(nèi)領(lǐng)先水平，并且初步研究了該菌所產(chǎn)黑色素的理化性質(zhì)，為微生物法生產(chǎn)黑色素進(jìn)行了有益的探索。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一株新型高產(chǎn)黑色素的菌株Streptomyces kathiraeSC-1，對(duì)其所產(chǎn)黑色素進(jìn)行了理化性質(zhì)的研究，并且通過(guò)響應(yīng)面發(fā)確定了該菌發(fā)酵產(chǎn)黑色素的最適培養(yǎng)基，為該菌發(fā)酵產(chǎn)黑色素進(jìn)行了有益的探索。微生物所產(chǎn)的黑色素是由其體內(nèi)的酪氨酸酶催化酪氨酸生成，是氨基酸的衍生物，具有無(wú)毒、無(wú)害等特點(diǎn)，而且產(chǎn)黑色素的微生物種類繁多，生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，易于操作，不受時(shí)間與地域的限制，因此用微生物來(lái)生產(chǎn)黑色素具有巨大的優(yōu)勢(shì)。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案:
[0006]篩選方法:以土壤中篩選的菌株為出發(fā)菌株，通過(guò)分光光度法測(cè)定發(fā)酵液中黑色素的含量，篩選到一株能以酪氨酸為底物高產(chǎn)黑色素的菌株，通過(guò)16S rDNA鑒定，通過(guò)NCBI進(jìn)行Blast對(duì)比，發(fā)現(xiàn)該菌株與Streptomyces kathirae相似度最高,故將其命名為Streptomyces kathirae SC_1,該菌株已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心,保藏編號(hào)為:2012432。而后對(duì)該菌株所產(chǎn)黑色素進(jìn)行了光譜學(xué)鑒定，金屬螯合研究。并且通過(guò)響應(yīng)面發(fā)確定了該菌發(fā)酵產(chǎn)黑色素的最適培養(yǎng)基。
[0007](I)目的菌株的篩選及鑒定
[0008]目的菌株的篩選:采用涂布平板法進(jìn)行菌株的分離，將從自然界中采取的土樣經(jīng)無(wú)菌蒸餾水稀釋后涂布于初篩培養(yǎng)基(葡萄糖1，蛋白胨10，NaCl 5, CaCl20.1,酪氨酸2，瓊脂20，pH 6.0)，倒置于301:培養(yǎng)，2411后開始觀察，每日一次，第5天結(jié)束。然后分離，純化可以將初篩培養(yǎng)基染黑的菌株(如附圖所示)，通過(guò)復(fù)篩后找到黑色素生產(chǎn)迅速且產(chǎn)量高的菌株。
[0009]產(chǎn)黑色素菌株的鑒定:菌株生理生化鑒定按照《鏈霉菌鑒定手冊(cè)進(jìn)行》；菌株16SrDNA經(jīng)測(cè)序后通過(guò)NCBI進(jìn)行blast對(duì)比，最終確定該菌分類。
[0010](2)黑色素的提取、光譜學(xué)鑒定及金屬螯合研究
[0011]黑色素的提取過(guò)程:采用酸化沉淀提取黑色素的方法.將發(fā)酵液離心，去菌體，上清液用6mol.L-1的HCl調(diào)pH值至2，靜置過(guò)夜，使其充分沉淀，離心后得黑色素的粗提物；粗提物用Imol.Γ1的NaOH溶液充分溶解，離心后，將上清液再次用6mol.Γ1的HCl調(diào)pH值至2，靜置4h離心得絮狀沉淀物重懸于二次蒸餾水中，洗滌至中性后冷凍干燥；干粉在6mol.I/1的HCl中酸解4h后，依次在氯仿、乙酸乙酯、乙醇等有機(jī)溶劑中進(jìn)行抽提，最后得到的固體物用二次蒸餾水清洗3次后，至于70°C的烘箱中24h，使其充分干燥，即為純化的黑色素。
[0012]黑色素的紫外光譜:將少量的黑色素溶解于0.5mol.L4的NaOH溶液，在200-800nm的波長(zhǎng)下進(jìn)行紫外掃描。
[0013]黑色素的紅外光譜:將l_2mg左右的黑色素與干燥的KBr混勻后充分研磨，壓片后在譜域?yàn)?000?400CHT1的范圍內(nèi)進(jìn)行黑色素的紅外分光光譜測(cè)定。
[0014]黑色素的金屬螯合:分別配置似+、1%2+413+、？63+、0&2+1112+、(:112+含量為1\101的適當(dāng)濃度的、pH 8.0的黑色素溶液，在室溫下放置011、2411后分別取樣，5000印111離心101^11，在OD4tltl下測(cè)上清的吸光度。
[0015](3)黑色素高產(chǎn)菌株的發(fā)酵優(yōu)化
[0016]在幾種備選的培養(yǎng)基進(jìn)行該菌株黑色素的發(fā)酵，找到最適合的培養(yǎng)基作為發(fā)酵優(yōu)化的初始培養(yǎng)基，在次培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上通過(guò)Plack-Burman實(shí)驗(yàn),最陸爬坡實(shí)驗(yàn)，中心組合實(shí)驗(yàn)確定最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0017]本發(fā)明的有益效果:以從土壤中篩選的菌株Streptomyces kathirae SC-1作為出發(fā)菌株，而該種菌株產(chǎn)黑色素的研究還未見(jiàn)報(bào)道。在種子培養(yǎng)基中活化后，接種于最優(yōu)培養(yǎng)基中，28°C，200rpm的搖床上發(fā)酵5d后，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算該菌株的黑色素產(chǎn)量可達(dá)到，13.7g/L，達(dá)到較高水平。此外，目前還沒(méi)有利用S.kathirae發(fā)酵生產(chǎn)黑色素的相關(guān)報(bào)道，因此該菌株是一株新型的黑色素生產(chǎn)菌株。目前國(guó)內(nèi)用微生物法發(fā)酵生產(chǎn)黑色素處于初級(jí)階段，本發(fā)明為微生物法發(fā)酵生產(chǎn)黑色素進(jìn)行了有益的探索。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0018]圖1菌株在篩選培養(yǎng)基中產(chǎn)黑色素情況
[0019]具體實(shí)施方法
[0020]實(shí)施例1:菌株的篩選與鑒定
[0021]目的菌株的篩選:采用涂布平板法進(jìn)行菌株的分離，將Ig土樣倒入1ml的無(wú)菌蒸餾水中，置于搖床中30°C、150r/min搖30分鐘，使其充分混勻，取出Iml倒入另外一只9ml的無(wú)菌蒸餾水中依次作10倍系列稀釋，取200 μ I 10_5和10_6的稀釋液涂布于初篩培養(yǎng)基(葡萄糖1，蛋白胨10，NaCl 5，CaCl20.1,酪氨酸2，pH 6.0)，每個(gè)稀釋度涂布的平板為2個(gè)，倒置于30°C培養(yǎng)，24h后開始觀察，每日一次，第5天結(jié)束。然后分離，純化可以將初篩培養(yǎng)基染黑的菌株(如附圖所示)，通過(guò)復(fù)篩后找到黑色素生產(chǎn)迅速且產(chǎn)量高的菌株。
[0022]產(chǎn)黑色素菌株的鑒定:菌株生理生化鑒定按照《鏈霉菌鑒定手冊(cè)進(jìn)行》；16SrDNA鑒定過(guò)程為:提取Streptomyces kathirae SC-1總DNA。使用通用引物(引物1:5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’、引物 2:5’ -GGTTACCTTGTT ACGACTT-3’，上海生物工程公司)擴(kuò)增 Streptomyces kathirae SC-116S rDNA。PCR擴(kuò)增條件:94°C預(yù)變性 5min ;94°C變性50s，58°C退火1.5min，72°C延伸2min，35個(gè)循環(huán)；72°C延伸1min0將擴(kuò)增產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳，Goldview染色，在在紫外燈下觀測(cè)結(jié)果，膠回收后連接PMD-18T載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli JM109經(jīng)過(guò)Amp平板篩選后交送上海生物工程公司進(jìn)行測(cè)序。在NCBI中與數(shù)據(jù)庫(kù)已有序列進(jìn)行比較分析，采用ClustalXl.8進(jìn)行多重序列匹配排列，Mega 4.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。
[0023]實(shí)施例2:黑色素的提取、光譜學(xué)鑒定及金屬螯合研究
[0024]采用酸化沉淀提取黑色素的方法.將發(fā)酵液離心，去菌體，上清液用6mol.Γ1的HCl調(diào)pH值至2?3左右，靜置過(guò)夜，使其充分沉淀，離心后得黑色素的粗提物；粗提物用Imol.L—1的NaOH溶液充分溶解，離心后，將上清液再次用6mol.L—1的HCl調(diào)pH值至2?3左右，靜置4h離心得絮狀沉淀物重懸于二次蒸餾水中，洗滌至中性后冷凍干燥；干粉在6mol.L-1的HCl中酸解4h后，依次在氯仿、乙酸乙酯、乙醇等有機(jī)溶劑中進(jìn)行抽提，最后得到的固體物用二次蒸餾水清洗3次后，至于70°C的烘箱中24h，使其充分干燥，即為純化的黑色素。將提取的黑色素用0.5M的NaOH溶解后配制不同濃度的黑色素堿溶液，以黑色素濃度為橫坐標(biāo)，在400nm處的吸光度為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0025]黑色素的紫外光譜:將少量的黑色素溶解于0.5mol.L-1的NaOH溶液，在200-800nm的波長(zhǎng)下進(jìn)行紫外掃描。
[0026]黑色素的紅外光譜:將l_2mg左右的黑色素與干燥的KBr混勻后充分研磨，壓片后在譜域?yàn)?000?400CHT1的范圍內(nèi)進(jìn)行黑色素的紅外分光光譜測(cè)定。
[0027]黑色素的金屬螯合:分別配置似+、1%2+413+、？63+、0&2+1112+、(:112+含量為1\101的適當(dāng)濃度的、pH 8.0的黑色素溶液，在室溫下放置011、2411后分別取樣，5000印111離心101^11，在OD4tltl下測(cè)上清的吸光度。
[0028]實(shí)施例3:黑色素高產(chǎn)菌株的發(fā)酵優(yōu)化
[0029]在幾種備選的培養(yǎng)基進(jìn)行該菌株黑色素的發(fā)酵，找到最適合的培養(yǎng)基作為發(fā)酵優(yōu)化的初始培養(yǎng)基，在初始培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上通過(guò)Plack-Burman實(shí)驗(yàn)確定影響黑色素產(chǎn)量最顯著因素為可溶性淀粉、酵母膏與硫酸銅，通過(guò)最陡爬坡實(shí)驗(yàn)逼近最大相應(yīng)區(qū)域，中心組合實(shí)驗(yàn)確定最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基。挑取平板單菌落接種于種子培養(yǎng)基(葡萄糖1，蛋白胨10，NaCl5，CaCl20.1, pH 6.0)，28°C，200rpm的搖床培養(yǎng)12h，按照10%的接種量轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基(可溶性淀粉4，酵母膏37，NaCl 5，CaCl20.1，CuSO4L 341 X 10_2，酪氨酸4，抗壞血酸2，pH6.0)，28°C，200rpm的搖床上發(fā)酵5d。收集發(fā)酵液離心取上清液，按照適當(dāng)?shù)谋稊?shù)進(jìn)行稀釋，以水為空白對(duì)照測(cè)其在400nm下的吸光度，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出該菌株的黑色素產(chǎn)量為
13.7g/L。
【權(quán)利要求】
1.一株產(chǎn)黑色素的鏈霉菌Streptomyces kathirae SC_1,以酪氨酸為底物產(chǎn)黑色素，由中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號(hào)為CCTCC Μ 2012432。
2.權(quán)利要求1所述的鏈霉菌菌株在生產(chǎn)黑色素的應(yīng)用，挑取平板單菌落接種于種子培養(yǎng)基 g/L:葡萄糖 1，蛋白胨 10，NaCl 5，CaCl2 0.1，瓊脂 20，pH 6.0,28。。，200rpm 的搖床培養(yǎng)12h，按照10%的接種量轉(zhuǎn)接于最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):可溶性淀粉4，酵母膏37，NaCl.5，CaC12 0.1, CuS04 1.341 X 1(Γ2，酪氨酸 4，抗壞血酸 2，pH 6.0，28°C，200rpm 的搖床上發(fā)酵5d ;收集發(fā)酵液離心取上清液，按照適當(dāng)?shù)谋稊?shù)進(jìn)行稀釋，以水為空白對(duì)照測(cè)其在400nm下的吸光度，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出該菌株的黑色素產(chǎn)量為13.7g/L。
【文檔編號(hào)】C12R1/465GK104403975SQ201410749202
【公開日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2014年12月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月9日
【發(fā)明者】饒志明, 郭靜, 楊套偉, 徐美娟, 張顯, 滿在偉 申請(qǐng)人:江南大學(xué)