四吡咯化合物的制備方法及四吡咯化合物的制作方法
【專利摘要】在培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌，所述大腸桿菌的基因ypjD(b2611)由于突變而無法表達(dá)，并從該培養(yǎng)基中得到具有卟啉環(huán)結(jié)構(gòu)的四吡咯化合物。
【專利說明】四吡咯化合物的制備方法及四吡咯化合物
[0001] 本申請是申請?zhí)枮?00880118147. 3、申請日為2010年5月28日的同名申請的分 案申請。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明涉及四吡咯化合物的制備方法及四吡咯化合物。

【背景技術(shù)】
[0003] 卟啉或葉綠素等四吡咯化合物，作為抗癌劑等藥品是重要的化合物，另外作為食 品添加劑或電子學(xué)領(lǐng)域中的氧化還原催化劑等而被使用。這樣的四吡咯化合物，一般通過 化學(xué)合成法制備得到。但化學(xué)合成法有需要使用特定的制備裝置及催化劑等的問題，另外， 化學(xué)合成法中使用的溶劑也會對環(huán)境造成不良影響。
[0004] 基于上述原因，提出了使用微生物制備四吡咯化合物的方法。已知例如，培養(yǎng)作 為光合作用細(xì)菌的屬于織線藻屬的突變株微生物，并從培養(yǎng)物中提取原葉綠素酸酯的方法 (例如參考專利文獻(xiàn)1)。其次已知有通過培養(yǎng)光合作用細(xì)菌來回收四吡咯化合物的方法 (例如參考專利文獻(xiàn)2和3)。此外還知有通過在含特定化合物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)節(jié)桿菌屬微 生物，并從培養(yǎng)物中提取尿卟啉的方法（例如參考專利文獻(xiàn)4)。
[0005] 專利文獻(xiàn)1 :特開平5-91866號公報(bào)
[0006] 專利文獻(xiàn)2 :特開平5-244937號公報(bào)
[0007] 專利文獻(xiàn)3 :特開2000-23691號公報(bào)
[0008] 專利文獻(xiàn)4 :特開平5-38295號公報(bào)


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 發(fā)明擬解決的技術(shù)課題
[0010] 但是專利文獻(xiàn)1的方法中，必須從菌體中提取原葉綠素酸酯，具體包括，破碎菌體 細(xì)胞后，通過萃取等方法進(jìn)行分離、純化。此外在專利文獻(xiàn)2?4記載的方法中，培養(yǎng)基中 必須含有四吡咯化合物的前體（5-氨基酮戊酸）。
[0011] 本發(fā)明的課題，可解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，提供一種簡便制備方法，即利 用大腸桿菌，不使用四吡咯化合物的前體而制備四吡咯化合物。
[0012] 解決課題的技術(shù)方案
[0013] 本發(fā)明的四吡咯化合物的制備方法，其特征在于，
[0014] ?在培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌，所述大腸桿菌的基因 ypjD(b2611)由于突變而無法 表達(dá)；及
[0015] ?從所述培養(yǎng)基得到具有卟啉環(huán)結(jié)構(gòu)的四吡咯化合物。
[0016] 本發(fā)明的制備方法，其特征在于，
[0017] 將化合物作為原料添加到培養(yǎng)基中，所述化合物含有在所述培養(yǎng)基中：
[0018] ?作為離子的金屬元素、或
[0019] ?作為離子而解離的金屬元素，
[0020] 由此得到含所述金屬的四吡咯化合物。
[0021] 上述四吡咯化合物，其特征在于，是卟啉環(huán)中含有4個(gè)甲基、4個(gè)乙酯或乙酸基（丙 酸基）的化合物。
[0022] 本發(fā)明的四吡咯化合物的制備方法，其特征還在于，
[0023] ?在培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌，所述大腸桿菌的基因 ypjD(b2611)由于突變而無法 表達(dá)，所述培養(yǎng)基中作為原料添加有化合物，所述化合物含有在培養(yǎng)基中：
[0024] 作為離子的Μη、或
[0025] 作為離子而解離的Mn ;及
[0026] ?從所述培養(yǎng)基得到具有以Mn為中心配位的卟啉環(huán)結(jié)構(gòu)的四吡咯化合物。
[0027] 本發(fā)明的四吡咯化合物，其具有式：[C36H36O 8N4 · Mn (III)]+。
[0028] 發(fā)明效果
[0029] 通過本發(fā)明可達(dá)到以下效果：在培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌，尤其是基因 ypjD(b2611)由于突變而無法表達(dá)的大腸桿菌；由于能夠從所述培養(yǎng)基中回收具有卟啉環(huán) 結(jié)構(gòu)的四吡咯化合物，所以即使不使用前體也能很簡便的提供四吡咯化合物。
[0030] 實(shí)施方式
[0031 ] 根據(jù)本發(fā)明涉及的四批咯化合物制備方法的實(shí)施方式，優(yōu)選在貧營養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng) 大腸桿菌，再從所述貧營養(yǎng)培養(yǎng)基中分離、回收四吡咯化合物，從而制備得到具有卟啉環(huán)結(jié) 構(gòu)的四吡咯化合物。即，本發(fā)明是在培養(yǎng)基中培養(yǎng)、增殖大腸桿菌的過程中，使大腸桿菌產(chǎn) 生四吡咯化合物，通過回收分泌到培養(yǎng)基中的四吡咯化合物來制備四吡咯化合物。為了防 止培養(yǎng)基中的某些天然物質(zhì)等成分妨礙四吡咯化合物的分離，因此作為培養(yǎng)基優(yōu)選使用貧 營養(yǎng)培養(yǎng)基。作為貧營養(yǎng)培養(yǎng)基，優(yōu)選含有葡萄糖或乳糖的培養(yǎng)基，但并不限定于此。
[0032] 在本發(fā)明中使用的大腸桿菌優(yōu)選基因 ypjD(b2611)由于突變而無法表達(dá)的大 腸桿菌?？膳e例源于K12株及BL21株的大腸桿菌等。例如，優(yōu)選源于K12株的基因 ypjD(b2611)由于突變而無法表達(dá)的大腸桿菌。作為基因 ypjD(b2611)由于突變而無法 表達(dá)的大腸桿菌，可舉例插入了基因 ypjD(b2611)的轉(zhuǎn)座子的突變株。在所述突變株中， 基因 ypjD(b2611)的表達(dá)處于部分或完全缺失的狀態(tài)。其次，K12株可以從國家生物資源 中心（National BioResource)得到，BL21株可以從例如Takara Bio得到。另外，作為插 入了基因 ypjD(b2611)的轉(zhuǎn)座子的突變株，可舉例為，能從國家生物資源中心（National BioResource)獲得的 JD23504 等。
[0033] 在本實(shí)施方式中，首先，將大腸桿菌在貧營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。此時(shí)優(yōu)選將大腸桿菌 在貧營養(yǎng)培養(yǎng)基以外的適當(dāng)培養(yǎng)基（例如LB培養(yǎng)基等）中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，再將得到的預(yù)培養(yǎng) 物接種到貧營養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。
[0034] 大腸桿菌的培養(yǎng)條件，采用大腸桿菌常規(guī)培養(yǎng)條件即可。當(dāng)將大腸桿菌進(jìn)行預(yù)培 養(yǎng)后，變換培養(yǎng)基，而在貧營養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，這對無論何種培養(yǎng)條件都是相同的。 例如，使用LB培養(yǎng)基在15°C?40°C的溫度下預(yù)培養(yǎng)6小時(shí)?24小時(shí)后，將得到的細(xì)胞懸 池液再于貧營養(yǎng)培養(yǎng)基中在20°C?40°C的溫度下培養(yǎng)12小時(shí)?96小時(shí)。由此，培養(yǎng)基中 的細(xì)胞增殖，就可以得到目標(biāo)四吡咯化合物帶有特有色調(diào)的培養(yǎng)物（產(chǎn)物）。
[0035] 其次，可如下從上述培養(yǎng)物中分離目標(biāo)四吡咯化合物。
[0036] 具體而言，培養(yǎng)物通過離心分離得到上清液，將其過濾后采用例如離子交換樹脂 色譜柱或反相色譜柱從濾液中吸附、分離四吡咯化合物。例如，培養(yǎng)物用離心機(jī)使細(xì)胞沉 淀，得到含有培養(yǎng)物（產(chǎn)物）的上清液。接著，將上述上清液用一定孔徑（如〇. 22 μ m)的濾 膜過濾后，再利用上述色譜柱吸附于離子交換樹脂。隨后可用例如20%乙腈-0. 1%三氟醋 酸溶液等從離子交換樹脂洗脫出產(chǎn)物后，進(jìn)行冷凍干燥。另外，此情況中的洗脫也可使用含 有酸或堿的溶液的有機(jī)溶劑。根據(jù)本實(shí)施方式可以得到1種或2種以上的四吡咯化合物， 例如，從500mL的細(xì)胞懸濁液中可得數(shù)?數(shù)十mg的四吡咯化合物。
[0037] 將由上述操作分離的產(chǎn)物經(jīng)NMR(Nuclear Magnetic Resonance,核磁共振）等分 析，可以證實(shí)含有四吡咯化合物。此外，對該產(chǎn)物進(jìn)行吸光度分析，可知是在染料的特定波 長范圍內(nèi)有吸收的化合物。很多情況下是顯示出與葉綠素、血紅素或酞菁類似的雙吸收峰 的染料化合物。這類染料化合物可作為由光激發(fā)電子的光催化劑或電子傳遞物而使用。另 夕卜，由于其在水溶液中或經(jīng)由細(xì)胞膜參與氧化還原反應(yīng)，因此認(rèn)為其在電池中也能發(fā)揮作 用。
[0038] 如上所述，根據(jù)本發(fā)明，使用大腸桿菌可以制備卟吩、嚇啉及卟啉絡(luò)合物等卟啉 類四吡咯化合物及含有金屬的四吡咯化合物或絡(luò)合物，不需要像化學(xué)合成法那樣，根據(jù)目 標(biāo)化合物的種類選擇制備裝置、催化劑，且不需要使用溶劑，對環(huán)境產(chǎn)生不良影響的危險(xiǎn)較 少。另外，在培養(yǎng)大腸桿菌時(shí)，也不需要向培養(yǎng)基中添加5-氨基酮戊酸等四吡咯化合物的 前體，并且只需回收分泌到培養(yǎng)基中的四吡咯化合物，不需要從菌體中提取。即，根據(jù)本發(fā) 明培養(yǎng)大腸桿菌或回收四吡咯化合物由于不需要特定的化合物或裝置，可以簡便地制備四 吡咯化合物。這樣獲得的四吡咯化合物可以在醫(yī)療、食品及電子學(xué)等各種產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域使用。
[0039] 在本實(shí)施方式中，向貧營養(yǎng)培養(yǎng)基中添加含有在所述培養(yǎng)基中作為離子的金屬元 素或作為離子而解離的金屬元素的化合物，由此得到含該金屬的四吡咯化合物或絡(luò)合物。 作為金屬，只要在培養(yǎng)基中成為離子的金屬即可。而所述含金屬的化合物需可溶于酸性、堿 性或中性水溶液。作為上述金屬元素可舉例選自金（Au)、銅（Cu)、鉀（K)、錳（Μη)、鋅（Zn) 及釕（Ru)中的至少1種金屬。此外，金屬可以以無機(jī)金屬化合物或有機(jī)金屬化合物的狀態(tài) 添加。作為無機(jī)金屬化合物，可舉例上述金屬的硫酸鹽、碳酸鹽、硝酸鹽、硫代硫酸鹽、氧化 物、氮化物或鹵化物。而作為有機(jī)金屬化合物，可舉例金硫蘋果酸鈉及蘋果酸鋅等。
[0040] 由上所述，通過向貧營養(yǎng)培養(yǎng)基中添加含有在所述培養(yǎng)基中的作為離子的金屬元 素或作為離子而解離的金屬元素的化合物，可得到色調(diào)與金屬種類相對應(yīng)的四吡咯化合物 或絡(luò)合物。即，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌，則被攝入大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的金屬元素或金屬化合 物，通過大腸桿菌基因的作用，被轉(zhuǎn)化成帶有各種金屬所賦予的色調(diào)的化合物。之后，所述 化合物在細(xì)胞中作為產(chǎn)物被吐出，通過從培養(yǎng)基中回收就可得到作為染料有用的化合物。 為了得到所需色調(diào)的化合物，選擇與該色調(diào)對應(yīng)的金屬即可，不必像化學(xué)合成法那樣，為每 種目標(biāo)化合物開發(fā)新的方法。此外，得到的化合物除可在光催化劑、電池等領(lǐng)域以外，還可 在光記憶介質(zhì)、信息記憶介質(zhì)、電子傳遞介質(zhì)、半導(dǎo)體元件及電極等領(lǐng)域適用。
[0041] 此外，本發(fā)明并不限于上述實(shí)施方式，可以在不脫離本發(fā)明宗旨的范圍內(nèi)實(shí)施各 種變形。
[0042] 以下說明本發(fā)明的實(shí)施例。 實(shí)施例
[0043] 實(shí)施例I :
[0044] 將插入了基因 ypjD(b2611)的轉(zhuǎn)座子的突變株（National BioResource JD23504) 在2mL LB培養(yǎng)基（細(xì)菌用胰蛋白胨：1%、細(xì)菌用酵母提取物：0· 5%，NaCl :0.5%)中于 37°C的溫度預(yù)培養(yǎng)12小時(shí)。得到的細(xì)胞懸濁液取ImL接種到水溶液（9g KH2P04、21g Κ2ΗΡ04、 2g(NH4)2S0 4、Ig檸檬酸二水合物、3. 6g葡萄糖及IOOmg MgSO4溶解于IL去離子水中制得） 中，于37°C的溫度下培養(yǎng)24小時(shí)。
[0045] 經(jīng)過24小時(shí)的培養(yǎng)，培養(yǎng)液的顏色由開始培養(yǎng)時(shí)的無色轉(zhuǎn)為粉紅色。該培養(yǎng)液離 心分離后使細(xì)胞沉淀，得到的上清液用孔徑〇. 22 μ m的濾膜過濾。接著使濾液通過填充陰 離子交換樹脂的柱后，將樹脂吸附的培養(yǎng)物用20%乙腈-0. 1%三氟醋酸溶液洗脫，對洗脫 物進(jìn)行冷凍干燥。由此，就可得到帶有粉紅色的產(chǎn)物。
[0046] 對該產(chǎn)物進(jìn)行下述各儀器分析，可以證實(shí)是具有圖1所示結(jié)構(gòu)的四吡咯化合物。 圖1中的標(biāo)記A?G與圖4所示 13C NMR譜的標(biāo)記對應(yīng)，其他圖中也一樣。接著，對產(chǎn)物進(jìn) 行NMR分析，證實(shí)含有四吡咯化合物。之后，用ICP(電感耦合等離子體）質(zhì)量分析檢測出 了鉀（K)，因此回收到鉀與離子結(jié)合或形成絡(luò)合物的化合物。接著進(jìn)一步對其進(jìn)行吸光度分 析，如圖2所示，可以證實(shí)是含索雷帶的卟啉所特有的雙吸收峰。圖2中在波長395nm及波 長549nm處分別有峰。由此證實(shí)，產(chǎn)物為游離電子可傳遞的有機(jī)染料。
[0047] 上述得到的四吡咯化合物溶于不同溶劑中（樣品1及2)、進(jìn)行二維NMR測定 (COSY、NOESY、HSQC、HMBC)，解析譜，進(jìn)行結(jié)構(gòu)解吸。
[0048] 對于樣品1，將樣品用⑶30D溶解，按以下條件進(jìn)行NMR測定。
[0049] ?裝置：IN0VA500 型（varian 公司制）
[0050] ?共振頻率：4". 8MHz (1H)
[0051] ?基準(zhǔn)：3. Slppm(CD2HC)DjH NMR)
[0052] 49. 42 Ippm (CD3OD、13C NMR)
[0053] ?累計(jì)次數(shù)：? NMR(16 次）、13C 匪1?(53428)、〇)5￥(16次）4(^5￥(8次）、邯0(：(32 次）、HMBC(128 次）
[0054] ?其他：NOESY的混合時(shí)間設(shè)定為400毫秒。
[0055] 其次，對于樣品2,將樣品用溶劑CD3CN : D2O : CD3COOD = 90 : 10 : 0. 1溶解， 按以下條件進(jìn)行NMR測定。
[0056] ?裝置：IN0VA600 型（varian 公司制）
[0057] ?共振頻率：599. 8MHz (1H)
[0058] ?基準(zhǔn)：I. 92ppm(CD2HCNjH NMR)
[0059] I. 28ppm(CD3CN、13C NMR)
[0060] ?累計(jì)次數(shù)：? NMR(64次）、13C NMR(50000)、C0SY(16次）、N0ESY(16次）、HSQC(32 次）、HMBC(128 次）
[0061] ?其他：NOESY的混合時(shí)間設(shè)定為400毫秒。
[0062] 關(guān)于樣品1的結(jié)構(gòu)解析：
[0063] 圖 3 示1H NMR 譜（溶劑：CD30D)。結(jié)果為，在 10. 0 ?10. 5ppm 附近（d)、4. 3ppm 附 近（f)、3. 6ppm附近（g)及3. 2ppm附近（e)觀測到推測為源于目的成分的信號。各信號強(qiáng) 度比約為I : 2 : 3 : 2。這里的d?g在其他圖中也是相同的。
[0064] 圖4示13C NMR譜。由B、C的信號推定為芳香族化合物。
[0065] 該圖中，從化學(xué)位移值來看，1H NMR的d信號為通常不可見的特征信號，且考慮到 是芳香族化合物，則嚇啉骨架作為候選被考慮到。如下所述，將二維NMR譜（圖5?9)解 析為卟啉并不矛盾。另外，在J.org. Chem. Vol. 164, No. 21，1999(7973-7982)中記載了與圖 1的推定結(jié)構(gòu)類似的化合物，其1H NMR化學(xué)位移值顯示相當(dāng)好的一致性，因此推斷為卟啉結(jié) 構(gòu)是合理的。
[0066] 以下說明二維NMR解析。
[0067] 圖5示HSQC譜。HSQC譜是檢測J1ai的測定法。解析結(jié)果如圖所示。關(guān)于質(zhì)子信 號，進(jìn)行直接結(jié)合的碳的編號的大寫字母編號。
[0068] 圖6示COSY譜。COSY譜是檢測1H-1H間自旋結(jié)合的測定法。由解析結(jié)果可知f和 e自旋結(jié)合，從信號強(qiáng)度比及F與E的化學(xué)位移值來看，是-CH2-CH2-X的可能性極高。其中， X為結(jié)構(gòu)不明的未確定成分。
[0069] 圖7示HMBC譜。HMBC譜是檢測JnaiOi=約2?4)的測定法，可以得到異核遠(yuǎn)隔 結(jié)合相關(guān)譜。解析該譜的結(jié)果，得到（e，A)、（e，B)、（e，F(xiàn))、（g，B)、（g，C)、（f，A)、（f，B)、 (f，C)、（f，E)等的相關(guān)。這些相關(guān)與圖I所示推定結(jié)構(gòu)不矛盾。
[0070] 圖8及圖9示NOESY譜。NOESY譜是檢測磁化交換的測定法，從由交叉馳豫引起的 磁化傳遞可以得到有關(guān)核自旋間距離的信息。解析該譜得到的結(jié)果，在（g，e)、（f，g)、（f， e)、（d，f)、（d，e)、（d，g)觀測到NOE相關(guān)。這些NOE相關(guān)支持圖I所示的推定結(jié)構(gòu)。
[0071] 關(guān)于樣品2的結(jié)構(gòu)分析：
[0072] 圖 10 示1H NMR 譜，圖 11 示 13C NMR 譜（溶劑：CD3CN : D2O : CD3COOD = 90 : 10 : 0.1)。圖10中方框圍起來的信號為雜質(zhì)。與上述樣品1的譜進(jìn)行比較的結(jié)果， 推測主成分結(jié)構(gòu)相同。這也可從COSY、NOESY、HSQC及HMBC各譜的分析結(jié)果得到支持。
[0073] 圖12為樣品2的NOESY譜的放大圖。觀測到d質(zhì)子分離成4種，按磁場由小到大 的順序（從數(shù)字小的一方開始）進(jìn)行編號：dl?d4。其NOE相關(guān)匯總?cè)缦隆?br> [0074] · dl 及 d4 與甲基和-CH2-CH2-X 有 NOE 相關(guān)。
[0075] · d2 與僅-CH2-CH2-X 有 NOE 相關(guān)。
[0076] · d3與僅甲基有NOE相關(guān)
[0077] 這里沒有明確觀測到甲基間或-CH2-CH2-X間的NOE相關(guān)，由此得到了圖1側(cè)鏈的 配置。
[0078] 對于13C信號及1H信號的編號而言，將在幾乎相同的區(qū)域中觀測到的信號統(tǒng)一進(jìn) 行編號。這是由于卟啉骨架是重復(fù)結(jié)構(gòu)，從而詳細(xì)歸屬困難。至于重復(fù)的個(gè)數(shù)而言，由于觀 測到的甲基（g)有4個(gè)，因此推斷為4。
[0079] 綜上所述，由樣品1及2的分析結(jié)果能夠得到圖1的結(jié)構(gòu)。只是作為側(cè)鏈的甲基 及-CH 2-CH2-X各共4個(gè)即可，附加位置只要是圖1所示8個(gè)位置中的任一個(gè)就不與數(shù)據(jù)矛 盾，因此不限于圖1所示的附加位置。
[0080] 以下，對于-CH2-CH2-X中相當(dāng)于X的部分進(jìn)行探討。
[0081] 對上述得到的產(chǎn)物進(jìn)行以下分析。
[0082] (1)由熱分解GC/MS的定性分析
[0083] 為了去除TFA，將樣品于加熱爐內(nèi)280°C加熱IOmin后在600°C進(jìn)行熱分解，將分解 產(chǎn)物用下述氣相色譜/質(zhì)量分析裝置（以下簡稱"GC/MS"）進(jìn)行分離分析。
[0084]

【權(quán)利要求】
1. 四吡咯化合物的制備方法，其特征在于， ?在培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌，所述大腸桿菌的基因ypjD(b2611)由于突變而無法表 達(dá)；及 ?從所述培養(yǎng)基得到具有卟啉環(huán)結(jié)構(gòu)的四吡咯化合物。
2. 權(quán)利要求1的四吡咯化合物的制備方法，其特征在于， 將化合物作為原料添加到培養(yǎng)基中，所述化合物含有在所述培養(yǎng)基中： 籲作為離子的金屬元素、或 ?作為離子而解離的金屬元素， 由此得到含所述金屬的四吡咯化合物。
3. 權(quán)利要求1或2的四吡咯化合物的制備方法，其特征在于，所述四吡咯化合物是卟啉 環(huán)中含有4個(gè)甲基、4個(gè)乙酯或乙酸基（丙酸基）的化合物。
4. 四吡咯化合物的制備方法，其特征在于， ?在培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌，所述大腸桿菌的基因ypjD(b2611)由于突變而無法表 達(dá)，所述培養(yǎng)基中作為原料添加有化合物，所述化合物含有在培養(yǎng)基中： 作為離子的Mn、或 作為離子而解離的Mn ;及 ?從所述培養(yǎng)基得到具有以Mn為中心配位的卟啉環(huán)結(jié)構(gòu)的四吡咯化合物。
5. 權(quán)利要求3的四吡咯化合物，其具有式：[C36H3608N4 ? Mn(III)]+。
【文檔編號】C12P17/10GK104372047SQ201410616365
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2008年12月1日 優(yōu)先權(quán)日:2007年11月30日
【發(fā)明者】石橋徹 申請人:福留裕文