一種微生物油脂及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種微生物油脂及其制備方法和應用，其中微生物油脂以經(jīng)過氧降解的堿木質(zhì)素為碳源，經(jīng)渾濁紅球菌（Rhodococcusopacus）DSM1069發(fā)酵后，通過酯交換反應制備得到。微生物油脂的制備方法包括氧降解、混合、發(fā)酵、酯交換反應等步驟，其制備得到的微生物油脂可應用于生物柴油、食品添加劑的制備。本發(fā)明提供的微生物油脂的生產(chǎn)工藝簡單，運行成本低廉，提供了堿木質(zhì)素應用的新途徑，能有效減少堿木質(zhì)素排放所帶來的資源浪費和環(huán)境污染。
【專利說明】一種微生物油脂及其制備方法和應用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物油脂生產(chǎn)【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種微生物油脂，還涉及該微生物油脂的制備方法和應用。

【背景技術(shù)】
[0002]木質(zhì)素是自然界中僅次于纖維素的第二大可再生有機資源。木質(zhì)素是由四種醇單體(對香豆醇、松柏醇、5-羥基松柏醇、芥子醇)形成的一種無定型酚類高聚物，由于其結(jié)構(gòu)的復雜性，迄今為止沒有得到高效的利用。堿木質(zhì)素主要來自于造紙廠黑液，年產(chǎn)量達到I億噸以上,然而,只有1%?2%的堿木質(zhì)素用于商業(yè)化應用，大部分直接排入水體或焚燒作為熱源。因此，如何挖掘木質(zhì)素的潛在價值受到社會的廣泛重視。
[0003]生物柴油是一種可再生的新型清潔能源，主要來自于動物脂肪，植物油脂和微藻，通過其與醇類(如甲醇)在催化劑作用下進行酯交換反應得到脂肪酸酯類物質(zhì)。然而，生物柴油制備過程中油料供給成本大，約占整個生產(chǎn)成本的60?75%。為滿足日益擴大的生物柴油市場的需求，開發(fā)新型的油脂生產(chǎn)方式成為未來重要的發(fā)展方向之一。目前，以氧降解堿木質(zhì)素作為微生物生長及油脂生產(chǎn)潛在碳營養(yǎng)物來源，其研究未見相關(guān)報導。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)中堿木質(zhì)素的利用率不高，生物柴油的原料成本過高的技術(shù)問題，提供一種價格低廉、易于加工的微生物油脂，同時還提供了一種生產(chǎn)工藝簡單，運行成本低廉，易于大規(guī)模連續(xù)生產(chǎn)，以氧降解堿木質(zhì)素為碳源的微生物油脂的制備方法，該微生物油脂可作為原料應用于生物柴油或食品添加劑中的制備。
[0005]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種微生物油脂，前述微生物油脂以經(jīng)過氧降解的堿木質(zhì)素為碳源，經(jīng)渾池紅球菌(熱ot/ococciAs opacus) DSM 1069發(fā)酵后,通過酯交換反應制備得到。
[0006]作為一個總的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明還提供了一種前述的微生物油脂的制備方法，包括以下步驟:
S1:將堿木質(zhì)素進行氧降解處理；
52:將經(jīng)過氧降解處理的堿木質(zhì)素與營養(yǎng)液混合得到培養(yǎng)基；
53:將渾池紅球菌(TSotZococciAs opacus ) DSW 1069添加至前述步驟S2制備得到的培養(yǎng)基中進行發(fā)酵得到發(fā)酵液，將前述發(fā)酵液分離得到菌體；
54:將前述S3步驟中制備得到的菌體進行酯交換反應得到微生物油脂。
[0007]進一步的，前述SI步驟中前述氧降解處理的步驟具體為:將前述堿木質(zhì)素溶于氫氧化鈉溶液中，在80°C?15CTC下以100 psi?150 psi通氧反應30 min?90 min。將經(jīng)過氧降解處理的堿木質(zhì)素溶液的PH調(diào)節(jié)為2?4，使得堿木質(zhì)素沉淀，離心分離出堿木質(zhì)素，經(jīng)冷凍干燥得到堿木質(zhì)素，再與營養(yǎng)液進行混合制備培養(yǎng)基。
[0008]進一步的，前述S2步驟中前述經(jīng)過氧降解處理的堿木質(zhì)素與前述營養(yǎng)液的質(zhì)量體積比為I g?3 g: 200 mL。
[0009]進一步的，前述S3步驟中前述渾濁紅球菌DSM 1069的接種量為1%?5% ;前述發(fā)酵步驟具體為在25°C?37°C下，以150 rpm?250 rpm轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)16 h?60 h。在前述振蕩培養(yǎng)過程中進行通風。
[0010]優(yōu)選的，在前述渾濁紅球菌DSM 1069接種于培養(yǎng)基之前，先將渾濁紅球菌DSM1069置于種子培養(yǎng)基中進行活化培養(yǎng)得到種子液，再將種子液添加至前述步驟S2制備得到的培養(yǎng)基中進行振蕩培養(yǎng)。
[0011]進一步優(yōu)選的，種子培養(yǎng)基的配方為:IL種子培養(yǎng)液中添加30 g大豆胰化蛋白HTrypticase Soy調(diào)節(jié) pH 值為 7 ?7.5。
[0012]進一步的優(yōu)選的，前述步驟S3中經(jīng)過振蕩培養(yǎng)得到的菌體利用調(diào)節(jié)pH值的方法與堿木質(zhì)素基質(zhì)分離，具體為:用2 M NaOH溶液調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH為10?13使堿木質(zhì)素溶解,在4000 rpm?10000 rpm轉(zhuǎn)速下分離得到菌體,將菌體采用生理鹽水洗漆后冷凍干燥，備用。
[0013]進一步的，前述S4步驟中前述酯交換反應具體包括以下步驟:前述S4步驟中前述酯交換反應具體包括以下步驟:將菌體加入含有氯仿和甲醇的混合溶液中，以濃硫酸為催化劑于90°C?100°C條件下反應微生物油脂。優(yōu)選的，前述反應時間為2?3 h。
[0014]進一步優(yōu)選的，前述菌體和甲醇的質(zhì)量體積比為3mg?1mg:1mL?5mL。
[0015]進一步的，前述營養(yǎng)液包括0.5 g/L?I g/L的(NH4)2SO4'0.5 g/L?1.5 g/L的MgSO4.7Η20、0.010 g/L ?0.015 g/L 的 CaCl2.2Η20、0.5 ml/L ?1.5 ml/L 的微量元素液、0.5 ml/L?1.5 ml/L的Stock A溶液和30 ml/L?40 ml/L的磷酸鹽緩沖液。
[0016]進一步的，前述微量元素液包括0.3 g/L?0.6 g/L的FeSO4.7H20、0.3 g/L?0.5 g/L 的 ZnSO4.7Η20、0.01 g/L ?0.02 g/L 的 MnSO4.H2O,0.010 g/L ?0.020 g/L 的H3BO3>0.005 g/L ?0.015 g/L 的 NiCl2.6Η20、0.20 g/L ?0.25 g/L 的 EDTA、0.04 g/L ?0.06 g/L 的 CoCl2.6Η20、0.004 g/L ?0.006 g/L 的 CuCl2.2H20。
[0017]進一步的，前述Stock A 溶液包括 1.5 g/L ?2.5 g/L 的 NaMoO4.2H20 及 4.0 g/L?5.0 g/L的乙二胺四乙酸鐵鈉(FeNa.EDTA)。
[0018]進一步的,前述磷酸鹽緩沖液包括110 g/L?115 g/L的K2HPO4、45 g/L?48 g/L 的 KH2PO4。
[0019]作為一個總的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明還提供了一種前述的微生物油脂或前述的制備方法制備得到的微生物油脂作為原料在制備生物柴油或食品添加劑中的應用。
[0020]本發(fā)明的創(chuàng)新點在于:
基于堿木質(zhì)素結(jié)構(gòu)復雜難以被微生物直接利用的特點，本發(fā)明首次將堿木質(zhì)素進行氧降解，并作為產(chǎn)油微生物的碳源。在氧降解的過程中，堿木質(zhì)素發(fā)生復雜結(jié)構(gòu)變化，脂肪醚及醇類結(jié)構(gòu)(木質(zhì)素單體之間連接鍵)斷裂，同時羧基含量增加，木質(zhì)素溶解性增強。反應過程還伴隨少量縮合結(jié)構(gòu)的形成。另一方面，氧降解后堿木質(zhì)素大分子結(jié)構(gòu)發(fā)生一定程度的破碎，表面積增大，有利于微生物對其進行利用。
[0021]自然界中的產(chǎn)油微生物，如渾濁紅球菌DSM 1069，可降解木質(zhì)素模型物并在體內(nèi)積累油脂。
[0022]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于: (I)本發(fā)明采用微生物發(fā)酵發(fā)制備微生物油脂，與傳統(tǒng)的油脂生產(chǎn)相比，微生物可以利用多種碳源，且生產(chǎn)周期短，不受季節(jié)和地域的影響，易于大規(guī)模連續(xù)生產(chǎn)。
[0023](2)本發(fā)明采用經(jīng)過氧降解處理后的堿木質(zhì)素為碳源，通過廢物回收利用減少了環(huán)境污染，同時為生物油脂的生產(chǎn)提供更廣泛的原料來源，有助于促進生物柴油推廣中成本的降低，解決現(xiàn)有技術(shù)中堿木質(zhì)素的利用率不高、生物柴油的原料成本過高的技術(shù)問題。
[0024](3)本發(fā)明采用(NH4) 2S04、MgSO4.7H20、CaCl2.2H20、微量元素液、Stock A 溶液和磷酸鹽緩沖液作為產(chǎn)油微生物發(fā)酵的營養(yǎng)液，可為細菌生長提供必需的氮源及微量元素，成本低廉，操作簡易。
[0025](4)本發(fā)明微生物油脂為脂肪酸甲酯，以C16和C18為主，可應用于生物柴油的制備；本發(fā)明的微生物油脂與一般植物油類似，可推廣應用于其他領(lǐng)域，如食品添加劑的原料。將本發(fā)明的微生物油脂作為原料在制備生物柴油或食品添加劑中的應用具有工藝簡單，運行成本低，改進空間大，有利于工業(yè)化生產(chǎn)的潛在價值等優(yōu)點。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]為使本發(fā)明實施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整的描述。
[0027]圖1為實施例1中微生物油脂的生產(chǎn)流程圖。
[0028]圖2為實施例1中產(chǎn)油階段的細菌生長，油脂積累及基質(zhì)消耗隨時間的變化情況示意圖。

【具體實施方式】
[0029]以下結(jié)合說明書附圖和具體優(yōu)選的實施例對本發(fā)明作進一步描述，但并不因此而限制本發(fā)明的保護范圍。
[0030]以下實施例中所采用的材料和儀器均為市售，其中渾池紅球菌(Modococcusopacus) DSM 1069,購買于德國微生物及細胞培養(yǎng)中心，DSMZ,www.dsmz.de。堿木質(zhì)素購買于 Sigma-Aldrich 公司。
[0031]實施例1
一種微生物油脂，該微生物油脂以經(jīng)過氧降解的堿木質(zhì)素為碳源，經(jīng)渾濁紅球菌{Rhodococcus opacus) DSM 1069發(fā)酵后,通過酯交換反應制備得到。
[0032]參見圖1，一種上述本實施例的微生物油脂的制備方法，具體包括以下步驟:
S1:將堿木質(zhì)素進行氧降解處理，具體步驟為:稱取3 g堿木質(zhì)素,溶于2.5 wt%的氫氧化鈉溶液中，在高壓釜中以100 psi氧壓，在100°C下通氧反應I小時得到經(jīng)過氧降解處理的喊木質(zhì)素溶液(在80°C?150°C下以10psi?150psi通氧反應30min?90min均可實現(xiàn)氧降解處理)。調(diào)節(jié)堿木質(zhì)素溶液的PH為3，經(jīng)過離心，分離出堿木質(zhì)素沉淀(由于堿木質(zhì)素不溶于酸性溶液中，調(diào)節(jié)堿木質(zhì)素的PH為2?4均可實現(xiàn)堿木質(zhì)素的分離)，將堿木質(zhì)素沉淀洗滌后冷凍干燥得到經(jīng)過氧降解處理的堿木質(zhì)素。
[0033]S2:取1.5g經(jīng)過氧降解處理的堿木質(zhì)素溶于200mL的營養(yǎng)液中得到培養(yǎng)基(堿木質(zhì)素與營養(yǎng)液的質(zhì)量體積比為I g?3 g: 200 mL均可實施)。其中營養(yǎng)液配方為:在I L去離子水中添加 1.0 g 的(NH4) 2S04、1.0 g 的 MgSO4.7Η20、0.015 g 的 CaCl2.2H20、1.0 ml的微量元素液、1.0 ml的Stock A溶液和35.2 ml的磷酸鹽緩沖液。
[0034]在前述營養(yǎng)液配方中，微量元素液包括具有以下成分的去離子水溶液:0.5 g/L的FeSO4.7Η20、0.4 g/L 的 ZnSO4.7Η20、0.02 g/L 的 MnSO4.H2O,0.015 g/L 的 Η3Β03、0.01 g/L 的 NiCl2.6Η20、0.25 g/L 的 EDTA、0.05 g/L 的 CoCl2.6Η20、0.005 g/L 的 CuCl2.2H20。
[0035]Stock A溶液包括具有以下成分的去離子水溶液:2 g/L的NaMoO4.2Η20及5.0 g/L的乙二胺四乙酸鐵鈉(FeNa.EDTA )。
[0036]磷酸鹽緩沖液的配制方法為:取113 g的K2HPO4和47g的KH2PO4溶于IL去離子水中。
[0037]S3:在固體培養(yǎng)基中取渾濁紅球菌DSM 1069接入已經(jīng)過無菌處理的種子培養(yǎng)基中進行活化培養(yǎng)得到種子液；種子培養(yǎng)基的配方為:1L種子培養(yǎng)液中添加30 g大豆胰化蛋白胨Soy調(diào)節(jié)pH值為7.2(7?7.5均可實施)。將種子液用步驟S2中的營養(yǎng)液洗滌三次，按接種量為1%，將渾濁紅球菌DSM 1069接入到步驟S2制得的培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，發(fā)酵條件為:溫度30°C，轉(zhuǎn)速150 rpm，振蕩培養(yǎng)7天，于振蕩培養(yǎng)開始后每間隔12小時取樣，得到發(fā)酵液。
[0038]在制備得到的發(fā)酵液中分離菌體，具體采用調(diào)節(jié)pH值得方法與堿木質(zhì)素基質(zhì)分離:用2 M NaOH溶液調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH為12 (pH為10?13均可實施)使堿木質(zhì)素溶解，6000rpm轉(zhuǎn)速下(轉(zhuǎn)速為4000?10000 rpm均可實施)分離得到菌體,將菌體采用生理鹽水進行洗滌后冷凍干燥，備用。
[0039]S3步驟中渾濁紅球菌DSM 1069的接種量還可以為1%?5% ;發(fā)酵過程在25V?37°C下，以150rpm?250rpm轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)均可實施，振蕩培養(yǎng)的時間優(yōu)選為16 h?60 h。
[0040]S4:將前述S3步驟中制備得到的菌體進行酯交換反應得到微生物油脂，具體步驟為:
收集3 mg菌體，加入2 mL氯仿，1.7 mL甲醇，0.3 mL濃硫酸，于100°C條件下反應140分鐘(菌體和甲醇的質(zhì)量體積比3mg?1mg:1mL?5mL ;反應時間為2h?3h均可實施)，菌體中的甘油三酯與醇發(fā)生酯交換反應生成長鏈脂肪酸甲酯，冷卻后加入2 mL去離子水，振蕩5分鐘，靜置分層后移出有機相部分，真空干燥，得到脂肪酸甲酯。
[0041]取S4步驟中得到的脂肪酸甲酯，加入I mL氯仿完全溶解，進行氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀的分析，分析結(jié)果如圖2所示:細菌油脂的較高含量出現(xiàn)在16 h?60 h，最大含量出現(xiàn)在36 h，為14% (油脂質(zhì)量占細菌干重的百分數(shù))，堿木質(zhì)素降解可達到28%;油脂產(chǎn)量為
0.067 mg/mL，其中棕櫚酸(C16)占46.9 %，硬脂酸(C18)占42.7 %。圖2中，菌體干重表示細胞菌體冷凍干燥后的干重。
[0042]按照本發(fā)明制備方法制備得到微生物油脂為脂肪酸甲酯，以C16和C18為主，與一般植物油類似，可應用于生物柴油的制備以及其他領(lǐng)域，如食品添加劑的原料。
[0043]實施例1所米用的營養(yǎng)液僅為本發(fā)明優(yōu)選的營養(yǎng)液，在本發(fā)明中營養(yǎng)液的成分還可以包括以下組分:0.5 g/L?I g/L 的(NH4)2S04、0.5g/L?1.5g/I^3MgS04*7H20、0.010g/L ?0.015g/L 的 CaCl2.2H20、0.5ml/L ?1.5ml/L 的微量元素液、0.5ml/L ?1.5ml/L 的Stock A溶液和30ml/L?40ml/L的磷酸鹽緩沖液。
[0044]微量元素液包括以下組分:0.3 g/L?0.6 g/L的FeSO4.7Η20、0.3 g/L?0.5 g/L 的 ZnSO4.7Η20、0.01 g/L ?0.02 g/L 的 MnSO4.H20、0.010 g/L ?0.020 g/L 的 H3BO3、0.005 g/L ?(λ 015 g/L 的 NiCl2.6Η20、0.20 g/L ?(λ 25 g/L 的 EDTA、0.04 g/L ?(λ 06g/L 的 CoCl2.6Η20、0.004 g/L ?0.006 g/L 的 CuCl2.2H20。
[0045]Stock A 溶液包括 1.5 g/L ?2.5 g/L 的 NaMoO4.2H20 及 4.0 g/L ?5.0 g/L 的乙二胺四乙酸鐵鈉(FeNa.EDTA)。
[0046]磷酸鹽緩沖液包括以下組分:110 g/L?115 g/L的K2HPO4、45 g/L?48 g/L的KH2PO4。
[0047]以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例而已，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制。雖然本發(fā)明已以較佳實施例揭示如上，然而并非用以限定本發(fā)明。任何熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神實質(zhì)和技術(shù)方案的情況下，都可利用上述揭示的方法和技術(shù)內(nèi)容對本發(fā)明技術(shù)方案做出許多可能的變動和修飾，或修改為等同變化的等效實施例。因此，凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案的內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實質(zhì)對以上實施例所做的任何簡單修改、等同替換、等效變化及修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案保護的范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種微生物油脂，其特征在于，所述微生物油脂以經(jīng)過氧降解的堿木質(zhì)素為碳源，經(jīng)渾池紅球菌(/Soi/ococciAs opacus) DSM 1069發(fā)酵后,通過酯交換反應制備得到。
2.一種如權(quán)利要求1所述的微生物油脂的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 51:將堿木質(zhì)素進行氧降解處理； 52:將經(jīng)過氧降解處理的堿木質(zhì)素與營養(yǎng)液混合得到培養(yǎng)基； 53:將渾池紅球菌(TSotZococciAs opacus) DSM 1069添加至所述步驟S2制備得到的培養(yǎng)基中進行發(fā)酵得到發(fā)酵液，將所述發(fā)酵液分離得到菌體； 54:將所述S3步驟中制備得到的菌體進行酯交換反應得到微生物油脂。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述SI步驟中所述氧降解處理的步驟具體為:將所述堿木質(zhì)素溶于氫氧化鈉溶液中，在80°C?150°C下以100 psi?150 psi通氧反應30 min?90 min。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述S2步驟中所述經(jīng)過氧降解處理的堿木質(zhì)素與所述營養(yǎng)液的質(zhì)量體積比為I g?3 g: 200 mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述S3步驟中所述渾濁紅球菌DSM1069的接種量為1%?5% ;所述發(fā)酵步驟具體為在25°C?37°C下，以150 rpm?250 rpm轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)16 h?60 h。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述S4步驟中所述酯交換反應具體包括以下步驟:將菌體加入含有氯仿和甲醇的混合溶液中，以濃硫酸為催化劑于90°C?100°C下反應得到微生物油脂。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述菌體和甲醇的質(zhì)量體積比為3mg ?1mg ； ImL ?5mL。
8.根據(jù)權(quán)利要求2至7中任一項所述的制備方法，其特征在于，所述營養(yǎng)液包括0.5g/L ?I g/L 的(NH4) 2S04、0.5 g/L ?1.5 g/L 的 MgSO4.7Η20、0.010 g/L ?0.015 g/L 的CaCl2.2Η20、0.5 ml/L ?1.5 ml/L 的微量元素液、0.5 ml/L ?1.5 ml/L 的 Stock A 溶液和30 ml/L?40 ml/L的磷酸鹽緩沖液。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于，所述微量元素液包括0.3 g/L?0.6g/L 的 FeSO4.7Η20、0.3 g/L ?0.5 g/L 的 ZnSO4.7Η20、0.01 g/L ?0.02 g/L 的 MnSO4.H2O、0.010 g/L ?0.020 g/L 的 H3BO3、0.005 g/L ?0.015 g/L 的 NiCl2.6Η20、0.20 g/L ?0.25g/L 的 EDTA、0.04 g/L ?0.06 g/L 的 CoCl2.6Η20、0.004 g/L ?0.006 g/L 的 CuCl2.2Η20 ；所述 Stock A 溶液包括 1.5 g/L ?2.5 g/L 的 NaMoO4.2Η20 及 4.0 g/L ?5.0 g/L 的乙二胺四乙酸鐵鈉；所述磷酸鹽緩沖液包括110 g/L?115 g/L的K2HPO4,45 g/L?48 g/L的KH2PO4。
10.一種如權(quán)利要求1所述的微生物油脂或權(quán)利要求2?9任一項所述的制備方法制備得到的微生物油脂作為原料在制備生物柴油或食品添加劑中的應用。
【文檔編號】C12R1/01GK104357500SQ201410600214
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年10月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月31日
【發(fā)明者】曾光明, 危臻, 黃丹蓮, 賴萃, 黃超, 許飄, 李寧杰, 程敏, 張辰, 劉媛媛 申請人:湖南大學