一種水酶法提取植物油脂用復(fù)合酶的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及通過解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)復(fù)合酶的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]出于對食品安全、環(huán)境保護(hù)和油料資源綜合利用等方面的深度需求，水酶法提取植物油脂技術(shù)已成為國內(nèi)外研宄前沿。水酶法提取植物油脂的原理是:油料經(jīng)過機(jī)械破碎后，加入生物酶充分破壞油料細(xì)胞組織釋放油脂，最后經(jīng)離心分離得到植物油脂和水解蛋白質(zhì)。能夠破壞植物油料細(xì)胞組織的生物酶(如蛋白酶、纖維素酶、果膠酶、葡聚糖酶、淀粉酶等)都可應(yīng)用于水酶法提取植物油脂，多種生物酶的復(fù)合水解更有利于植物油脂的釋放。目前水酶法使用的復(fù)合酶基本上都是由幾種純種酶制劑按一定比例配置而成，該方法制得的復(fù)合酶生產(chǎn)工藝復(fù)雜、成本高。因此，研宄選育酶系豐富、產(chǎn)酶量大且不產(chǎn)脂肪酶的菌株，并由該菌株生產(chǎn)成本低、酶系全面、酶活力較高的復(fù)合酶制劑是當(dāng)前水酶法提取植物油脂技術(shù)實用化的迫切任務(wù)。
[0003]本發(fā)明使用解淀粉酶芽孢桿菌發(fā)酵來生產(chǎn)復(fù)合酶。該菌株分離自樟樹籽仁油生產(chǎn)廢渣，易于培養(yǎng)，對人畜無毒無害，由解淀粉酶芽孢桿菌制成的菌制劑已獲得我國農(nóng)業(yè)部的認(rèn)可。我們將該菌株生產(chǎn)的酶制劑用于水酶法提取樟樹籽仁油工藝中，可顯著提高樟樹籽仁油與水解蛋白的得率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提出一種水酶法提取植物油脂用復(fù)合酶的制備方法。
[0005]本發(fā)明所使用的菌株為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)Z16-1CGMCC N0.10727，已于2015年4月21日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研宄所)，其簡稱為CGMCC，保藏編號為 CGMCC N0.10727。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案:通過解淀粉芽孢桿菌液體發(fā)酵生產(chǎn)復(fù)合酶，其過程包括菌種活化培養(yǎng)、種子培養(yǎng)、搖床發(fā)酵培養(yǎng)和復(fù)合酶制劑的制備。
[0007]本發(fā)明的具體步驟為:
[0008](I)菌株活化培養(yǎng):將保存好的解淀粉芽孢桿菌Z16-1接種到營養(yǎng)瓊脂培基中，36?38°C培養(yǎng)24?42h。
[0009](2)種子培養(yǎng):挑取一環(huán)活化好的菌株，接種到肉湯培養(yǎng)基中，36?38°C、200?240r/min搖瓶培養(yǎng)22?26h，制得種子液。
[0010](3)發(fā)酵培養(yǎng)及酶液制備:以2%?4%的接種量將種子液加入到發(fā)酵培養(yǎng)中，36?38°C、200?240r/min搖瓶培養(yǎng)42?46h，制得發(fā)酵液。將發(fā)酵液6000?8000r/min離心8?12min，所得上清液即為復(fù)合酶酶液，可用于制作水酶法提取植物油脂用的復(fù)合酶制劑。
[0011]本發(fā)明制得的復(fù)合酶酶液中:中性蛋白酶活力為8594±2% U/mL，淀粉酶活力為19 ± 2 % U/mL,糖化酶活力為9017 ± 2 % U/mL,果膠酶活力為1644土 2 % U/mL,纖維素酶活力為5±2% U/mL，無脂肪酶活力，最適酶解溫度為40°C。
[0012]蛋白酶活力的定義:lmL酶液，在40°C、pH為7.0條件下，Imin水解酪蛋白產(chǎn)生I Ug酪氨酸，定義為一個蛋白酶活力單位。采用GB/T 23527-2009蛋白酶制劑酶活力測方法測定。
[0013]果膠酶活力定義:lmL酶液，在40°C、pH為7.0條件下，Ih分解果膠產(chǎn)生Img半乳糖醛酸為一個果膠酶酶活力單位。采用輕工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB1502-92中規(guī)定的碘量法測定。
[0014]糖化酶活力定義:lmL酶液，在40°C、pH為7.0條件下，Ih水解可溶性淀粉產(chǎn)生Img葡萄糖，即為I個糖化酶活力單位。采用國標(biāo)GB 8276-2006中規(guī)定的碘量法測定。
[0015]纖維素酶活力定義:lmL酶液，在40°C、pH為7.0條件下，每分鐘水解濾紙片，產(chǎn)生
1.0 μ g的葡萄糖，即為I個纖維素酶活單位。采用國標(biāo)GB 23881-2009中規(guī)定的濾紙片法測定。
[0016]淀粉酶活力定義:lmL酶液，在40°C、pH為7.0條件下，Ih液化Ig可溶性淀粉，即為I個淀粉酶活力單位。采用國標(biāo)GB 24401-2009中規(guī)定的碘比色法測定。
[0017]脂肪酶活力定義:lmL酶液，在40°C、pH為7.0條件下，Imin水解底物產(chǎn)生I μπιο?可滴定脂肪酸，即為I個酶活力單位。采用國標(biāo)GB 23535-2009中規(guī)定的酸堿滴定法測定。
[0018]本發(fā)明制備水酶法提取植物油脂用復(fù)合酶的優(yōu)點:本發(fā)明方法制備水酶法提取植物油脂用復(fù)合酶具有生產(chǎn)工藝簡單、生產(chǎn)周期短、節(jié)能環(huán)保等優(yōu)點，而且獲得的復(fù)合酶，酶系豐富、中性蛋白酶活力高、無脂肪酶活力，能有效提高水酶法提取植物油脂工藝中的油脂提取率和水解蛋白提取率。
【具體實施方式】
[0019]本發(fā)明通過一下實施例作進(jìn)一步說明。
[0020]以下實施例所用的營養(yǎng)瓊脂配方為:牛肉膏0.3g，蛋白胨1.0g，氯化鈉0.5g，瓊脂
2.0g，去離子水 10mL, pH 7.0 ?7.2，121°C 滅菌 20min。
[0021]肉湯培養(yǎng)基配方為:牛肉膏0.3g，蛋白胨1.(^，氯化鈉0.58，去離子水100mL，pH7.0?7.2，121°C高壓蒸汽滅菌20min。
[0022]發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化配方為:玉米粉45g，麩皮25g，豆柏40g，CaCl2 3g，KH2PO40.3g，Na2HPO4.12H20 4g，水 1000mL，pH 7.5，，121°C 滅菌 20min。
[0023]實施例1。
[0024]1、從菌斜面上取一環(huán)解淀粉芽孢桿菌Z16-1接種到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，36°C劃線培養(yǎng)42h，選取生長良好的單菌落用于種子液培養(yǎng)。
[0025]2、將活化好的菌株接種到肉湯培養(yǎng)基(50mL肉湯培養(yǎng)基裝在250mL的錐形瓶中)，36°C、240r/min搖瓶培養(yǎng)26h，制得種子液。
[0026]3、以4% (v/v)的接種量將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中(10mL發(fā)酵培養(yǎng)基裝在500mL錐形瓶中)，36°C、240r/min搖瓶培養(yǎng)46h。
[0027]4、將獲得的發(fā)酵液6000r/min離心12min，上清液即為適用于水酶法提取樟樹籽仁油的復(fù)合酶酶液。該酶液中:中性蛋白酶活力為9027±2% U/mL，淀粉酶活力為15.6 ± 2 % U/mL,糖化酶活力為8535 ± 2 % U/mL,果膠酶活力為1506 ± 2 % U/mL,纖維素酶活力為3.4±2% U/mL，無脂肪酶活力，最適酶解溫度為40°C。
[0028]實施例2。
[0029]1、從菌斜面上取一環(huán)解淀粉芽孢桿菌Z16-1接種到固體培養(yǎng)基中，37°C劃線培養(yǎng)36h，選取生長良好的單菌落用于種子液培養(yǎng)。
[0030]2、將活化好的菌株接種到肉湯培養(yǎng)基(50mL肉湯培養(yǎng)基裝在250mL的錐形瓶中)，37°C、220r/min搖瓶培養(yǎng)24h，制得種子液。
[0031]3、以3% (v/v)的接種量將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中(10mL發(fā)酵培養(yǎng)基裝在500mL錐形瓶中)，37°C、220r/min搖瓶培養(yǎng)44h。
[0032]4、將獲得的發(fā)酵液7000r/min離心lOmin，上清液即為適用于水酶法提取樟樹籽仁油的復(fù)合酶酶液。該酶液中:中性蛋白酶活力為8594±2% U/mL，淀粉酶活力為19±2%U/mL，糖化酶活力為9017±2% U/mL，果膠酶活力為1644±2 % U/mL，纖維素酶活力為5±2% U/mL，無脂肪酶活力，最適酶解溫度為40°C。
[0033]實施例3。
[0034]1、從菌斜面上取一環(huán)解淀粉芽孢桿菌Z16-1接種到固體培養(yǎng)基中，38°C劃線培養(yǎng)24h，選取生長良好的單菌落用于種子液培養(yǎng)。
[0035]2、將活化好的菌株接種到肉湯培養(yǎng)基(50mL肉湯培養(yǎng)基裝在250mL的錐形瓶中)，38°C、200r/min搖瓶培養(yǎng)22h，制得種子液。
[0036]3、以2% (v/v)的接種量將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中(10mL發(fā)酵培養(yǎng)基裝在500mL錐形瓶中)，38°C、200r/min搖瓶培養(yǎng)42h。
[0037]4、將獲得的發(fā)酵液6000r/min離心12min，上清液即為適用于水酶法提取樟樹籽仁油的復(fù)合酶酶液。該酶液中:中性蛋白酶活力為7411±2% U/mL，淀粉酶活力為29±2%U/mL，糖化酶活力為10727±2% U/mL，果膠酶活力為1411±2 % U/mL，纖維素酶活力為6.3±2% U/mL，無脂肪酶活力，最適酶解溫度為40°C。
【主權(quán)項】
1.一種水酶法提取植物油脂用復(fù)合酶的制備方法，其特征是按以下步驟: (1)將保存好的解淀粉芽孢桿菌Z16-1接種到營養(yǎng)瓊脂培基中，36?38°C培養(yǎng)24?42h ； (2)從營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中挑取一環(huán)活化好的菌株，接種到肉湯培養(yǎng)基中，36?38°C、200?240r/min搖瓶培養(yǎng)22?26h，制得種子液； (3)以2%?4%的接種量將種子液加入到發(fā)酵培養(yǎng)中，36?38°C、200?240r/min搖瓶培養(yǎng)42?46h，制得發(fā)酵液；將發(fā)酵液6000?8000r/min離心8?12min，所得上清液即為復(fù)合酶酶液。
【專利摘要】一種水酶法提取植物油脂用復(fù)合酶的制備方法，按以下步驟：(1)將保存好的解淀粉芽孢桿菌Z16-1接種到營養(yǎng)瓊脂培基中，36～38℃活化培養(yǎng)24～42h；(2)從營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中挑取一環(huán)活化好的菌株，接種到肉湯培養(yǎng)基中，36～38℃、200～240r/min搖瓶培養(yǎng)22～26h，制得種子液；(3)以2％～4％的接種量將種子液加入到發(fā)酵培養(yǎng)中，36～38℃、200～240r/min搖瓶培養(yǎng)42～46h，制得發(fā)酵液；將發(fā)酵液6000～8000r/min離心8～12min，所得上清液即為復(fù)合酶酶液。本發(fā)明具有生產(chǎn)工藝簡單、生產(chǎn)周期短、節(jié)能環(huán)保等優(yōu)點，而且獲得的復(fù)合酶，酶系豐富、中性蛋白酶活力高、無脂肪酶活力，能有效提高水酶法提取植物油脂工藝中的油脂提取率和水解蛋白提取率。CGMCC No.1072720150421
【IPC分類】C12N9/88, C12N9/54, C12N9/26, C12N9/18, C12N9/34, C12N9/28, C12N9/00, C12N9/42
【公開號】CN104928262
【申請?zhí)枴緾N201510280426
【發(fā)明人】曾哲靈, 肖彥駿, 曾誠, 余平
【申請人】南昌大學(xué)
【公開日】2015年9月23日
【申請日】2015年5月28日