一種基于實時熒光pcr檢測hla-b*5801等位基因的方法
【專利摘要】本發(fā)明是在使用TaqMan探針檢測法的基礎上，設計了高特異性擴增HLA-B*5801等位基因的引物探針組合：Fp:5’-AGGGGCCGGAGTATTGGGATG-3’，Rp:5’-TTGGCCTCAACTGAAAATGAAAC-3’，MGB probe:5’-HEX/VIC-TCAGGGAGGCGGATCTCGGAC–MGB-3’；同時使用內(nèi)參基因ACTB的引物及探針，將目的基因與內(nèi)參基因加入一管中進行雙通道熒光定量PCR反應，通過擴增曲線分析結(jié)果。本發(fā)明具有簡便、靈活快速、特異性高、高通量、無污染、分辨率高等特點，適用于人體外周血、唾液中全基因組DNA樣本的HLA-B*5801等位基因的檢測。
【專利說明】-種基于實時熒光PCR檢測HLA - B*5801等位基因的方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于藥物基因組學和基因檢測領域，具體涉及一種檢測HLA - B*5801等位 基因的方法。

【背景技術】
[0002] HLA是指人類白細胞抗原，由人類第6號染色體短臂一群密切連鎖的復等位基因 編碼，由360萬個堿基對組成，是當前已知的人類染色體中基因密度最高，也是多態(tài)性最為 豐富的區(qū)域。主要包括HLA - A、HLA - B、HLA - C、HLA - DR、HLA - DQ及HLA - DP。世界衛(wèi)生 組織HLA因子命名委員會命名的相關HLA等位基因已達到5000多個；HLA基因的多態(tài)性決 定了個體間表達的HLA蛋白分子不同，也決定了不同個體處理和呈遞同一種抗原的能力不 同，這是免疫應答誘導和調(diào)節(jié)的最基本點，從而使不同個體對同一種抗原的免疫應答可表 現(xiàn)出個體差異。這種個體差異或產(chǎn)生保護性免疫，或形成免疫耐受，或出現(xiàn)自身免疫傾向， 或表現(xiàn)為HLA相關疾病。如：HLA - B*5801、HLA - B*1502等位基因均與藥物的過敏反應相 關。因此，鑒于HLA系統(tǒng)的高度多態(tài)性和復雜性，決定了 HLA等位基因的檢測方法不同于普 通多態(tài)性位點的檢測。其中已有大量研究證明別嘌呤醇相關的嚴重超敏反應與白細胞抗原 HLA - B*5801密切相關，在服用別嘌呤醇后出現(xiàn)嚴重不良反應的患者中100%存在，而在未 出現(xiàn)不良反應的患者（耐受人群）和正常對照組中，其攜帶率僅為15%和20% ;，中國漢 族、泰國人中HLA - B*5801陽性者比白人高（6 - 8% vs 2% )，發(fā)生超敏反應的風險更大。
[0003] 別嘌醇（Allopurinol)為次黃嘌呤的異構體，是黃嘌呤氧化酶（XO)的抑制劑， 可阻止次黃嘌呤和黃嘌呤代謝為尿酸，從而減少尿酸的生成，是目前唯一能抑制尿酸合成 的藥物，在高尿酸血癥等癥的治療領域發(fā)揮著重要作用。臨床主要用于：①原發(fā)性和繼發(fā) 性高尿酸血癥，尤其是尿酸生成過多而引起的高尿酸血癥；②反復發(fā)作或慢性痛風者；③ 痛風石；④尿酸性腎結(jié)石和（或）尿酸性腎??；⑤有腎功能不全的高尿酸血癥。劑型為片 齊U。然而，隨著藥品的大量應用，其不良反應也日益凸顯，是最易引起嚴重藥疹的藥物之 一。別嘌醇的不良反應主要表現(xiàn)為皮膚、黏膜損害，最常見的是剝脫性皮炎，比較嚴重的有 Stevens - Johnson綜合征、中毒性表皮壞死松解癥、系統(tǒng)性疾?。ㄊ人嵝粤＜毎龆喟Y、脈 管炎、以及主要器官的疾?。Ｓ形墨I報道別嘌呤醇皮膚變態(tài)反應致死率達20 - 40%。
[0004] 臨床上已經(jīng)建議在使用別嘌呤醇前，應該進行HLA -B*5801等位基因的檢測，以判 斷是否屬于高危人群，從而有效降低由別嘌呤醇引起的嚴重不良反應。同時，美國風濕病協(xié) 會發(fā)布指南建議對具有高風險的別嘌呤醇過敏綜合征的亞群體進行HLA -B*5801檢測。因 此，研究一種快速、特異性高的PCR法對HLA - B*5801等位基因進行檢測是非常必要的。
[0005] 傳統(tǒng)檢測HLA等位基因分型檢測的常用方法主要包括PCR - SSOP (Sequence Specific Oligonucleotide Probes)和 PCR-SSP (Sequence-specific primers)，是基于核 酸序列識別的方法，這些方法大多成本低、重復性好，然而需要多次的PCR后處理，即操作 復雜，又容易發(fā)生污染而產(chǎn)生假性結(jié)果。PCR - SBT (Sequence - based Typing)技術很大程 度上彌補了 PCR -凝膠電泳技術的不足之處，可以精確地檢測出樣本是否攜帶HLA -B*5801 等位基因，此方法靈敏度高、特異性強，然而PCR - SBT技術成本昂貴、耗時長、操作繁瑣。
[0006] 基于實時定量TaqMan -MGB探針及ARMS技術已成功應用于基因分型的檢測，并顯 示了其突出的優(yōu)勢。首先，TaqMan -MGB探針相對于普通的TaqMan探針而言，MGB探針的淬 滅基團米用非突光淬滅基團（Non-Fluorescent Quencher),本身不產(chǎn)生突光，可以大大降 低本底信號的強度，同時探針上還連接有MGB(Minor Groove Binder)修飾基團，可以將探 針的Tm值提高KTC左右。因此為了獲得同樣的Tm值，MGB探針可以比TaqMan探針設計得 更短，既降低了合成成本，也使得探針設計的成功率大大提高。此外，在模板DNA堿基組成 不理想的情況下，短的探針比長的探針更容易設計，并且特異性更高，若一個堿基不配對， 則MGB探針都不能與目的基因序列結(jié)合。其次，ARMS方法即擴增阻滯突變系統(tǒng)，這種技術 的基本原理是在引物的3'端倒數(shù)第二位引入一個與模板序列不匹配的堿基，若引物最末端 的堿基也與模板序列不互補，則不能延伸；若引物最末端的堿基與模板鏈互補，則在末端只 有一個堿基不互補的情況下，引物可以進行延伸，這樣就可以大大增加引物擴增的特異性。 在進行樣本檢測時，只需將一個攜帶有HLA - B*5801的樣本作為對照（陽性質(zhì)控品），則可 以很清楚地判斷待測樣本是否攜帶有HLA - B*5801等位基因。
[0007] 然而，相對于HLA等位基因的檢測，該技術至今很少應用于HLA -B*5801等位基因 的檢測；其根本原因是多個HLA - B等位基因與HLA - B*5801具有很高的序列同源性（90% 以上），因而設計一套適宜于熒光PCR反應高特異性擴增HLA -B*5801等位基因的引物探針 組合十分困難。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本申請研發(fā)出一套適宜于熒光PCR反應高特異性擴增HLA -B*5801等位基因的引 物探針組合；在現(xiàn)有的實時熒光PCR檢測HLA分型的技術基礎上，提供了一種更加簡便、快 速、高通量、特異性高的可以定性檢測HLA -B*5801等位基因分型的方法。該檢測方法更易 于在臨床的推廣和應用，從而更加有利于HLA -B*5801基因型指導下的別嘌呤醇安全用藥。
[0009] 本發(fā)明提供的定性HLA - B*5801基因的TaqMan - MGB探針檢測方法，首先通過與 HLA -B中3000個其它等位基因序列的對比，進行HLA -B*5801特異性位點和引物設計區(qū)域 的確定，它們主要位于HLA - B等位基因第2和第3外顯子，然后根據(jù)特異性位點附近的區(qū) 域，結(jié)合等位基因阻滯突變系統(tǒng)（ARMS)的方法，設計TaqMan - MGB探針檢測的特異性引物 以及探針，值得注意的是探針和引物設計的位置能夠排除其它HLA - B等位基因的結(jié)合、識 另Ij，尤其是HLA - B*570101等位基因。采用特異性更高的TaqMan - MGB探針法在熒光定量 PCR儀上擴增DNA片段，通過擴增曲線分析結(jié)果，來判斷未知樣本是否攜帶HLA - B*5801等 位基因。
[0010] 為實現(xiàn)以上發(fā)明目的，本發(fā)明的技術方案如下。
[0011] 本發(fā)明提出的用于熒光PCR反應高特異性擴增HLA-B*5801等位基因的引物探針 組合，包括：
[0012] 上游引物 Fp :5' - AGGGGCCGGAGTATTGGGATG - 3' ；
[0013] 下游引物 Rp: 5，- TTGGCCTCAACTGAAAATGAAAC - 3 ' ；
[0014] MGB 探針：5' - HEX/VIC - TCAGGGAGGCGGATCTCGGAC - MGB - 3' ；
[0015] 其中，HEX 為 6 - carboxy - hexachlorofluorescein。
[0016] 基于實時熒光PCR檢測HLA-B*5801等位基因的方法，主要包括以下環(huán)節(jié)：
[0017] (1)針對HLA -B*5801等位基因設計特異性引物和探針，即權利要求1所述的引物 探針組合；并設計內(nèi)參基因的引物和探針；
[0018] (2)獲得抽提的待測樣本基因組DNA ;
[0019] (3)在同一個反應體系中，將待測樣本基因組DNA與所述引物探針組合以及內(nèi)參 基因的引物和探針按照確定比例混合；
[0020] (4)通過Applied Biosystem 7500或者LightCycler System480進行實時定量突 光PCR檢測，其中分別利用FAM通道和VIC通道進行雙通道熒光采集；
[0021] (6)分析判斷待測樣本是否攜帶HLA - B*5801等位基因。
[0022] 基于上述方案，本發(fā)明還進一步作如下優(yōu)化設計：
[0023] 環(huán)節(jié)（1)中設計內(nèi)參基因 β - actin弓丨物和探針為：
[0024] 上游引物 Act in - F: 5 ' - CAGCAGATGTGGATCAGCAAG - 3 ' ；下游引物 Act in - R: 5 ' - GCA TTTGCGGTGGACGAT - 3' ；探針 probe: 5' - FAM - AGGAGTATGACGAGTCCGGCCCC - BHQ2 - 3' ；其中， FAM 為 6 - carboxyfluorescein ;BHQ2 為 Minor Groove Binder。
[0025] 使用Premix Ex Taq試劑盒（TaKaRa)進行PCR擴增，所述反應體系以20 μ L計， 則包括：10μLPremixExTaq(2X)、HLA-B*5801 特異性上游引物Fp 250nM- 500nM、 下游引物Rp250nM - 500nM、MGB探針I(yè)OOnM - 250ηΜ、以及ACTB特異性上游引物Actin - F IOOnM - 250ηΜ、下游引物 Actin - R IOOnM - 250ηΜ、探針 probe 50nM - 250ηΜ，然后加入待測 樣本基因組DNAlOng - 50ng，補充PCR等級的水至終體積20 μ L ;
[0026] 擴增程序為：95°C預變性 30s ;95°C 5s ?lOsec，64°C 34s ?40sec，共計 35 ?40 個循環(huán)。
[0027] 本發(fā)明的優(yōu)點主要有：
[0028] 1、節(jié)省耗材和時間、簡單易行、高通量
[0029] 基于本實驗設計及PCR反應特點，使得該發(fā)明可以很大程度上節(jié)省實驗時間和耗 材，檢測過程只需要50min - lh，操作也簡單易行，整個實驗可以在2小時內(nèi)全部完成。采 用本發(fā)明方法與HLA等位基因分型"金標準" PCR - SBT測序進行方法學對比，50例樣本結(jié) 果完全吻合；與PCR - SSP進行方法學對比，104例樣本結(jié)果完全吻合。同時，使用本發(fā)明方 法，可一次同時高通量進行96例或者384例樣本的檢測。
[0030] 2、結(jié)果可靠、靈敏度高
[0031] 本發(fā)明中，只需IOng -20ng基因組DNA便可進行準確的HLA -B*5801基因分型檢 測，相比與傳統(tǒng)的PCR -SSP技術，大大提高了檢測的靈敏度。其中，最低檢測樣本量可達到 0· 15ng〇
[0032] 3、檢測方法靈活、無污染
[0033] 本發(fā)明方法較傳統(tǒng)的HLA等位基因分型方法，未涉及多重擴增、重復開蓋等二次 污染的可能。本發(fā)明可直接根據(jù)探針的熒光曲線判斷擴增產(chǎn)物，不涉及任何對人體有毒害 作用的化學試劑，操作簡便、耗時短、安全、無污染。
[0034] 4、成本低、經(jīng)濟適用
[0035] 由于本發(fā)明具有高通量的特點，因此使得本發(fā)明中每個反應管的成本低；同時，所 設計的MGB探針序列更短，成本更低；此外，此技術適用于檢測人類全血、組織等全基因組 DNA樣本，較經(jīng)濟適用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0036] 圖1為利用內(nèi)參基因（ACTB)的引物與探針對人基因組DNA實時擴增結(jié)果。若 出現(xiàn)擴增曲線，則說明該樣本無質(zhì)量問題。曲線1為純合陽性樣本（2條DNA鏈均攜帶 HLA -B*5801等位基因 ），Ct = 26. 517 ;曲線2為雜合陽性樣本（1條DNA鏈攜帶HLA -B*5801 等位基因 ），Ct = 26. 086 ;曲線3為陰性樣本（2條DNA鏈均不攜帶HLA - B*5801等位基 因 ），Ct = 26. 751 ;NTC擴增曲線表明此實驗無污染。
[0037] 圖2為利用目的基因（Targetl)的引物與MGB探針對人基因組DNA實時熒光定量 擴增結(jié)果曲線1為純合陽性樣本（2條DNA鏈均攜帶HLA -B*5801等位基因 ），Ct = 28. 683 ; 曲線2為雜合陽性樣本（1條DNA鏈攜帶HLA -B*5801等位基因 ），Ct = 27. 867 ;曲線3為 陰性樣本（2條DNA鏈均不攜帶HLA -B*5801等位基因），Ct = 35. 610 (>35. 0) ;NTC擴增曲 線表明此實驗及引物和探針無污染。
[0038] 圖3為利用FAM通道和VIC通道進行雙通道熒光采集的實時定量擴增結(jié)果。
[0039] 圖4為SBT測序結(jié)果示意圖。

【具體實施方式】
[0040] 以下結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明進一步詳細說明。
[0041] 具體實施例TaqMan - MGB探針法檢測HLA - B*5801等位基因
[0042] I、DNA樣本的提取及稀釋
[0043] 按常規(guī)方法獲得用乙二胺四乙酸（EDTA)抗凝的真空采血管采集靜脈血后，使用 QIAamp DNA Mini Blood Kit (德國Qiagen公司）試劑盒提取DNA ;將已提取的DNA使用 NanoDrop 2000進行濃度測定（A26CI/28CI = L 95?2. 15)。用上述方法，分別測得104例布依 族DNA樣本濃度，然后使用PCR等級的H20將樣本稀釋至IOng/ μ L。
[0044] 2、設計引物和探針
[0045] 在多態(tài)性位點集中的區(qū)域，利用ARMS方法設計HLA - Β*5801的特異性引物，上游 引物 F :5' - GGGCCGGAGTATTGGGATG - 3'，下游引物 R :5' - TTGGCCTCAACTGAAAATGAAAC - 3'， 以及配套的熒光探針 probe:5' - HEX/VIC - TCAGGGAGGCGGATCTCGGAC - MGB - 3' ；另外在 β -actin 基因上設計內(nèi)參引物，上游引物 Actin -F:5' -CAGCAGATGTGGATCAGCAAG - 3'，下 游引物 Actin -R:5' -GCATTTGCGGTGGACGAT -3'，以及配套的熒光探針 probe:5' -FAM-AGGA GTATGACGAGTCCGGCCCC - BHQ2 - 3'。
[0046] 其 中，F(xiàn)AM 為 6 - carboxyfluorescein ;HEX 為 6 - carboxy - hexachlorofluorescein ；MGB % Minor Groove Binder ;BHQ2 為 Black Hole Quencher - 2 ;
[0047] 委托上海某公司合成。
[0048] 3、樣本檢測
[0049] 在熒光定量PCR儀上，將目的基因和內(nèi)參基因（ACTB)的引物、探針同時加入一 個管中，分別利用FAM通道和VIC通道進行雙通道熒光采集；使用Premix Ex Taq試劑盒 (TaKaRa)進行擴增，反應體系（20 μ L)包括：10 μ L Premix Ex Taq(2X)，HLA - B*5801 特 異性上游引物Fp 250nM - 500nM，下游引物Rp 250nM - 500nM，HLA - B*5801特異性MGB探 針I(yè)OOnM - 250nM，以及ACTB基因特異性上游引物50nM - ΙΟΟηΜ，下游引物50nM - ΙΟΟηΜ，探 針50nM - IOOnM,然后加入被測樣本基因組DNA約IOng - 50ng，補充PCR等級的水至終體 積20μ L ;用于檢測HLA - B*5801基因型的擴增程序：95°C預變性30s ;95°C 5s?lOsec， 62°C 34s?40sec，共計35?40個循環(huán)。
[0050] 4、結(jié)果分析
[0051] 內(nèi)參基因作為質(zhì)控，必須出現(xiàn)熒光擴增曲線；在內(nèi)參基因觀察到擴增曲線的前提 下，特異性探針必須同時擴增到曲線，則判斷待測樣本攜帶HLA-B*5801等位基因。本發(fā)明 中，有熒光擴增曲線達到閾值以上，則代表該目的片段的特異性引物及探針與DNA模板結(jié) 合，并且引物能夠順利延伸，引物覆蓋區(qū)域堿基序列與模板序列一致，且探針覆蓋范圍內(nèi)堿 基也與模板序列一致。
[0052] 驗證實驗：50例樣本進行SBT測序與HLA - B*5801基因檢測方法比較
[0053] 從104例布依族樣本中隨機選取50例樣本，將其進行SBT金標準測序，測序結(jié)果 用峰圖和Excel表格進行展示，以便對本發(fā)明實驗結(jié)果進行復核。將SBT測序結(jié)果與本發(fā) 明的檢測方法結(jié)果進行比對（見表1)，發(fā)現(xiàn)兩者之間的陰、陽性符合率均為1〇〇%。
[0054] 表 1
[0055]

【權利要求】
1. 用于熒光PCR反應高特異性擴增HLA-B*5801等位基因的引物探針組合，包括： 上游引物 Fp :5' - AGGGGCCGGAGTATTGGGATG - 3' ； 下游引物 Rp:5' - TTGGCCTCAACTGAAAATGAAAC - 3' ； MGB 探針：5' - HEX/VIC - TCAGGGAGGCGGATCTCGGAC - MGB - 3' ； 其中，HEX 為 6 - carboxy - hexachlorofluorescein。
2. -種基于實時熒光PCR檢測HLA-B*5801等位基因的方法，用于非疾病診斷目的，主 要包括以下環(huán)節(jié)： (1) 針對HLA -B*5801等位基因設計特異性引物和探針，即權利要求1所述的引物探針 組合；并設計內(nèi)參基因的引物和探針； (2) 獲得抽提的待測樣本基因組DNA ; (3) 在同一個反應體系中，將待測樣本基因組DNA與所述引物探針組合以及內(nèi)參基因 的引物和探針按照確定比例混合； (4) 通過 Applied Biosystem 7500 或者 LightCycler System480 進行實時定量突光 PCR檢測，其中分別利用FAM通道和VIC通道進行雙通道熒光采集； (6)分析判斷待測樣本是否攜帶HLA - B*5801等位基因。
3. 根據(jù)權利要求2所述的基于實時熒光PCR檢測HLA-B*5801等位基因的方法，其特征 在于，環(huán)節(jié)（1)中設計內(nèi)參基因 β - actin引物和探針為： 上游引物 Actin - F:5' - CAGCAGATGTGGATCAGCAAG - 3' ； 下游引物 Actin - R:5' - GCATTTGCGGTGGACGAT - 3' ； 探針 probe:5' - FAM - AGGAGTATGACGAGTCCGGCCCC - BHQ2 - 3' ； 其中，F(xiàn)AM 為 6 - carboxyfluorescein ;BHQ2 為 Minor Groove Binder。
4. 根據(jù)權利要求3所述的基于實時熒光PCR檢測HLA-B*5801等位基因的方法，其特 征在于：使用Premix Ex Taq試劑盒（TaKaRa)進行PCR擴增，所述反應體系以20 μ L計， 則包括：10μLPremixExTaq(2X)、HLA-B*5801 特異性上游引物Fp 250nM- 500nM、 下游引物Rp 250nM - 500nM、MGB探針ΙΟΟηΜ - 250ηΜ、以及ACTB特異性上游引物 Actin - FlOOnM - 250ηΜ、下游引物 Actin - R ΙΟΟηΜ - 250ηΜ、探針 probe 50nM - 250ηΜ，然后 加入待測樣本基因組DNAlOng - 50ng，補充PCR等級的水至終體積20 μ L ; 擴增程序為：95°C預變性30s ;95°C 5s?10sec，64°C 34s?40sec，共計35?40個 循環(huán)。
【文檔編號】C12Q1/68GK104293932SQ201410503857
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年9月26日 優(yōu)先權日:2014年9月26日
【發(fā)明者】康星, 王會娟, 陳融, 劉金輝, 戴鵬高, 陳超 申請人:陜西佰美基因股份有限公司