一種檢測(cè)HLA-B*5801等位基因的TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光PCR方法
【專利摘要】本發(fā)明在使用TaqMan探針檢測(cè)法的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了高特異性擴(kuò)增HLA-B*5801等位基因的引物探針組合：上游引物Fp：5’‐AGGGGCCGGAGTATTGGGATG‐3’下游引物Rp:5’‐TTGGCCTCAACTGAAAATGAAAC‐3’探針probe：5’‐HEX‐TCAGGGAGGCGGATCTCGGAC–BHQ2‐3’；同時(shí)使用內(nèi)參基因ACTB的引物及探針，將目的基因與內(nèi)參基因加入一管中進(jìn)行雙通道熒光定量PCR反應(yīng)，通過(guò)擴(kuò)增曲線分析結(jié)果。本發(fā)明具有簡(jiǎn)便、靈活快速、特異性高、高通量、無(wú)污染、分辨率高等特點(diǎn)，適用于人體外周血、唾液中全基因組DNA樣本的HLA-B*5801等位基因的檢測(cè)。
【專利說(shuō)明】-種檢測(cè)HLA - B*5801等位基因的TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光 PCR方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于藥物基因組學(xué)和基因診斷領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)HLA - B*5801等位 基因的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 別嚼醇（Allopurinol)為次黃嘌呤的異構(gòu)體，是黃嘌呤氧化酶（X0)的抑制劑，可 阻止次黃嘌呤和黃嘌呤代謝為尿酸，從而減少尿酸的生成，是目前唯一能抑制尿酸合成的 藥物。臨床主要用于高尿酸血癥和痛風(fēng)的治療。然而，隨著藥品的大量應(yīng)用，其不良反應(yīng)也 日益凸顯，是最易引起嚴(yán)重藥疹的藥物之一。別嘌醇的不良反應(yīng)主要表現(xiàn)為皮膚、黏膜損 害，最常見(jiàn)的是剝脫性皮炎，比較嚴(yán)重的有Stevens - Johnson綜合征、中毒性表皮壞死松解 癥、系統(tǒng)性疾?。ㄊ人嵝粤＜?xì)胞增多癥、脈管炎、以及主要器官的疾病）。有文獻(xiàn)報(bào)道別嘌呤 醇皮膚變態(tài)反應(yīng)致死率達(dá)20 - 40%。
[0003] 目前，已有報(bào)道別嘌呤醇、卡馬西平等多種藥物都與HLA上的等位基因密切相關(guān)。 HLA是指人類白細(xì)胞抗原，由人類第6號(hào)染色體短臂一群密切連鎖的復(fù)等位基因編碼，是當(dāng) 前已知的人類染色體中基因密度最高，也是多態(tài)性最為豐富的區(qū)域。世界衛(wèi)生組織HLA因 子命名委員會(huì)命名的相關(guān)HLA等位基因已達(dá)到5000多個(gè)；鑒于HLA系統(tǒng)的高度多態(tài)性和 復(fù)雜性，決定了 HLA等位基因的檢測(cè)方法不同于普通多態(tài)性位點(diǎn)的檢測(cè)。其中已有大量研 究證明別嘌呤醇相關(guān)的嚴(yán)重超敏反應(yīng)與白細(xì)胞抗原HLA - B*5801密切相關(guān)，在服用別嘌呤 醇后出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)的患者中100%存在，而在未出現(xiàn)不良反應(yīng)的患者（耐受人群）和 正常對(duì)照組中，其攜帶率僅為15%和20% ;中國(guó)漢族、泰國(guó)人中HLA-B*5801陽(yáng)性者比白 人高（6 - 8% vs2% )，發(fā)生超敏反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)更大。臺(tái)灣衛(wèi)生署已更新了別嘌呤醇的藥品 說(shuō)明書(shū)，添加了別嘌呤醇相關(guān)的嚴(yán)重超敏反應(yīng)與白細(xì)胞抗原HLA-B*5801的關(guān)系，并建議 在使用別嘌呤醇前，應(yīng)該進(jìn)行HLA - B*5801基因型檢測(cè)，結(jié)果陽(yáng)性患者應(yīng)禁止使用該藥物。 此外，美國(guó)臨床藥理學(xué)聯(lián)盟也提出了類似的建議。臨床醫(yī)師推薦在服用別嘌呤醇之前進(jìn)行 HLA -B*5801等位基因檢測(cè)，以判斷是否屬高危人群；從而有效降低由別嘌呤醇引起的嚴(yán)重 不良反應(yīng)。同時(shí)，美國(guó)風(fēng)濕病協(xié)會(huì)發(fā)布指南建議對(duì)具有高風(fēng)險(xiǎn)的別嘌呤醇過(guò)敏綜合征的亞 群體進(jìn)行HLA - B*5801檢測(cè)。因此，研究一種快速PCR法對(duì)HLA - B*5801等位基因進(jìn)行檢 測(cè)是非常必要的。
[0004] 目前，HLA等位基因分型檢測(cè)的常用方法主要是基于核酸序列識(shí)別的 方法，主要包括PCR - SBT(PCR Sequence - based Typing,基于測(cè)序分型的聚 合酶鏈反應(yīng)）、PCR-SSOP(Sequence Specific Oligonucleotide Probes)法和 PCR-SSP(Sequence-specific primers)法。其中，PCR-SBT直接測(cè)序法更是國(guó)際上公認(rèn)的 HLA基因分型方法的"金標(biāo)準(zhǔn)"。此類方法具有靈敏度高，特異性強(qiáng)，樣本需求量少等優(yōu)點(diǎn)。 但是，擁有眾多優(yōu)點(diǎn)的同時(shí)，此類方法也存在著操作繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，成本高昂，而且測(cè)序結(jié)果 會(huì)出現(xiàn)套峰，不利于結(jié)果的判讀，使得PCR -SBT法存在著模棱兩可的結(jié)果等缺點(diǎn)。尤其，操 作繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)等缺點(diǎn)已經(jīng)逐漸不能滿足現(xiàn)代醫(yī)學(xué)檢測(cè)需要，不適應(yīng)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所要求 的"快速、簡(jiǎn)便"的理念。此外，PCR - SSOP即序列特異性寡核苷酸探針，首先是對(duì)HLA的多 態(tài)區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，在擴(kuò)增過(guò)程中對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記，然后針對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物設(shè)計(jì)系列寡核苷酸探 針固定在膜上，最后將產(chǎn)物與膜上的探針雜交、放射自顯影，根據(jù)信號(hào)判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果。該技 術(shù)為傳統(tǒng)的分型技術(shù)，靈敏度高、特異型較強(qiáng)，且需要樣本量少；但是由于其所用的載體大 多為膜或微滴定板，對(duì)于復(fù)雜的HLA等位基因來(lái)說(shuō)，它不具有集成化的優(yōu)點(diǎn),而且洗脫條件 比較繁瑣，耗時(shí)較長(zhǎng)，難以標(biāo)準(zhǔn)化和自動(dòng)化。PCR - SSP即序列特異性引物PCR技術(shù)，適用于 廣泛臨床監(jiān)測(cè)。其原理是根據(jù)已知HLA基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，直接PCR擴(kuò)增基因組DNA 后通過(guò)凝膠電泳檢測(cè)產(chǎn)物，根據(jù)產(chǎn)物有無(wú)和片段大小來(lái)判斷HLA基因型。該技術(shù)簡(jiǎn)便、技術(shù) 條件容易掌握，需要樣本量少、對(duì)血液條件要求不高，適用于臨床對(duì)于已知HLA序列的快速 檢測(cè)應(yīng)用等優(yōu)勢(shì)；然而由于PCR - SSP技術(shù)需要進(jìn)行凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，因此該技術(shù)在操作過(guò)程 中易造成二次污染、時(shí)間長(zhǎng)，同時(shí)在PCR過(guò)程中多對(duì)引物易造成二聚體等非目的基因產(chǎn)物， 從而易造成假陽(yáng)性結(jié)果。
[0005] 針對(duì)于傳統(tǒng)的HLA檢測(cè)方法，實(shí)時(shí)定量PCR法是在普通PCR反應(yīng)體系中加入熒光 基團(tuán)或熒光染料，利用信號(hào)積累檢測(cè)整個(gè)PCR反應(yīng)的進(jìn)程，它是將熒光值的積累與PCR產(chǎn)物 擴(kuò)增的過(guò)程相結(jié)合，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線或測(cè)量指數(shù)擴(kuò)增期的熒光值來(lái)進(jìn)行定量或者定性的 方法；實(shí)時(shí)定量PCR法的優(yōu)點(diǎn)主要有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)短、高通量、無(wú)污 染等特點(diǎn)。因此，將實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)合ARMS(Amplification refractory mutation system) 法應(yīng)用于HLA等位基因的分型檢測(cè)是PCR分子診斷【技術(shù)領(lǐng)域】的一項(xiàng)創(chuàng)新。
[0006] 但是，由于HLA基因家族的的序列多態(tài)性，經(jīng)過(guò)一系列的序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)多個(gè) HLA -B基因與HLA -B*5801有很高的序列同源性，其中以HLA -ΒΦ570101基因與HLA -B*5801 的基因序列同源性最高，它們之間的序列同源性達(dá)到99%，相對(duì)于HLA基因家族序列多態(tài) 性集中的區(qū)域，尤其是exonl、exon 2、exon3及intronl、intron2序列中，只存在15個(gè)特異 性堿基。因此，設(shè)計(jì)一種適宜于熒光定量PCR反應(yīng)高特異性擴(kuò)增HLA - B*5801基因的引物 探針組合非常困難。
[0007] 目前，國(guó)內(nèi)針對(duì)HLA - B*5801的檢測(cè)技術(shù)以PCR - SSP和熒光PCR這兩種方法為 主，其中目前可查的熒光PCR法專利及相關(guān)試劑盒基本上是采用多個(gè)探針、多管同時(shí)進(jìn)行 檢測(cè)的方法，由于這些方法都是多管反應(yīng)，因此與本發(fā)明技術(shù)相比，它們普遍具有檢測(cè)通量 較低、操作繁瑣、成本高等不足之處。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本申請(qǐng)研發(fā)出一套適宜于熒光PCR反應(yīng)高特異性擴(kuò)增HLA-B*5801等位基因的引 物探針組合；在現(xiàn)已有的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)HLA分型的基礎(chǔ)上，提供一種更加簡(jiǎn)便、快速、高 通量、特異性高的可以定性檢測(cè)HLA -B*5801等位基因分型的方法，以改善現(xiàn)有技術(shù)上所存 在的缺陷。此檢測(cè)方法更易于在臨床的推廣和應(yīng)用，從而更加有利于HLA - B*5801基因型 指導(dǎo)下的別嘌呤醇安全用藥。
[0009] 本發(fā)明提供的定性HLA -B*5801基因的TaqMan探針檢測(cè)方法，首先通過(guò)與HLA -B 中3000個(gè)其它等位基因序列的對(duì)比，進(jìn)行HLA - B*5801特異性位點(diǎn)和引物設(shè)計(jì)區(qū)域的確 定，它們主要位于HLA - B等位基因第2和第3外顯子，然后根據(jù)特異性位點(diǎn)附近的區(qū)域， 結(jié)合等位基因阻滯突變系統(tǒng)（ARMS)的方法，設(shè)計(jì)TaqMan探針檢測(cè)的特異性引物以及探針， 值得注意的是探針和引物設(shè)計(jì)的位置能夠排除其它HLA - B等位基因的結(jié)合、識(shí)別，尤其是 HLA - B*570101等位基因。采用TaqMan探針?lè)ㄔ跓晒舛縋CR儀上擴(kuò)增DNA片段，通過(guò)擴(kuò) 增曲線分析結(jié)果，來(lái)判斷未知樣本是否攜帶HLA - B*5801等位基因。
[0010] 為實(shí)現(xiàn)以上發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下。
[0011] 本發(fā)明提出的用于熒光PCR反應(yīng)高特異性擴(kuò)增HLA-B*5801等位基因的特異性引 物探針組合，包括：
[0012] 上游引物 Fp : 5 ' - AGGGGCCGGAGTATTGGGATG - 3 '
[0013] 下游引物 Rp: 5，- TTGGCCTCAACTGAAAATGAAAC - 3，
[0014] 探針 probe :5' - HEX - TCAGGGAGGCGGATCTCGGAC - BHQ2 - 3，
[0015] 其中，HEX 為 6-carboxy-hexachlorofluorescein ;BHQ2 為 Black Hole Quencher-2〇
[0016] 一種檢測(cè)HLA-B*5801等位基因的TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光PCR方法,主要包括以下 環(huán)節(jié)：
[0017] (1)針對(duì)HLA -B*5801等位基因設(shè)計(jì)特異性引物和探針，即權(quán)利要求1所述的引物 探針組合；并設(shè)計(jì)內(nèi)參基因的引物和探針；
[0018] (2)獲得抽提的待測(cè)樣本基因組DNA ;
[0019] ⑶在同一個(gè)反應(yīng)體系中，將待測(cè)樣本基因組DNA與所述引物探針組合以及內(nèi)參 基因的引物和探針按照確定比例混合；
[0020] (4)通過(guò) Applied Biosystem7500 或者 LightCycler System480 進(jìn)行實(shí)時(shí)定量熒 光PCR檢測(cè)，其中分別利用FAM通道和VIC通道進(jìn)行雙通道熒光采集；
[0021] (5)分析判斷待測(cè)樣本是否攜帶HLA - B*5801等位基因。
[0022] 基于上述方案，本發(fā)明還進(jìn)一步作如下優(yōu)化設(shè)計(jì)：
[0023] 環(huán)節(jié)（1)中設(shè)計(jì)內(nèi)參基因 β - actin引物和探針為：
[0024] 上游引物 Actin - F:5' - CAGCAGATGTGGATCAGCAAG - 3'
[0025] 下游引物 Actiη - R: 5，- GCATTTGCGGTGGACGAT - 3 '
[0026] 探針 probe: 5，- FAM - AGGAGTATGACGAGTCCGGCCCC - BHQ2 - 3，
[0027] 其中，F(xiàn)AM 為 6 - carboxyfluorescein。
[0028] 使用Premix Ex Taq試劑盒（TaKaRa)進(jìn)行擴(kuò)增，所述反應(yīng)體系以20 μ L計(jì)，則包 括：10uL Premix Ex Taq(2X)，HLA-B*5801 特異性上游引物 Fp 250nM- 500nM，下游引 物Rp 250nM - 500nM，HLA - B*5801特異性探針100nM - 250nM，以及ACTB基因特異性上游 弓丨物ΙΟΟηΜ - 250nM，下游引物100nM - 250nM，探針50nM - 250nM ;然后加入待測(cè)樣本基因組 DNA約10ng - 50ng，補(bǔ)充PCR等級(jí)的水至終體積20 μ L ;
[0029] 擴(kuò)增程序?yàn)椋?5°C預(yù)變性 30s ;95°C 5s ?10sec，64°C 34s ?40sec,共計(jì) 35 ?40 個(gè)循環(huán)。
[0030] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)主要有：
[0031] 1、節(jié)省耗材和時(shí)間、簡(jiǎn)單易行、高通量
[0032] 基于本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及PCR反應(yīng)特點(diǎn)，使得該發(fā)明可以很大程度上節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間和耗 材，檢測(cè)過(guò)程只需要50min - lh，操作也簡(jiǎn)單易行，整個(gè)實(shí)驗(yàn)可以在2小時(shí)內(nèi)全部完成。采 用本發(fā)明方法與HLA等位基因分型"金標(biāo)準(zhǔn)" PCR - SBT測(cè)序進(jìn)行方法學(xué)對(duì)比，50例樣本結(jié) 果完全吻合；與PCR - SSP進(jìn)行方法學(xué)對(duì)比，104例樣本結(jié)果完全吻合。同時(shí)，使用本發(fā)明 方法，可一次同時(shí)高通量進(jìn)行96例或者384例樣本的檢測(cè)，因此，可完全使用本發(fā)明進(jìn)行 HLA - B*5801等位基因檢測(cè)，適用于臨床分子診斷。
[0033] 2、結(jié)果可靠、靈敏度高
[0034] 本發(fā)明中，只需10ng - 20ng基因組DNA便可進(jìn)行準(zhǔn)確的HLA - B*5801基因分型檢 狽IJ，相比與傳統(tǒng)的PCR -SSP技術(shù)，大大提高了檢測(cè)的靈敏度。其中，最低檢測(cè)樣本量可達(dá)到 0. 15ng〇
[0035] 3、檢測(cè)方法靈活、無(wú)污染
[0036] 本發(fā)明方法較傳統(tǒng)的HLA等位基因分型方法，未涉及多重?cái)U(kuò)增、重復(fù)開(kāi)蓋等二次 污染的可能。本發(fā)明可直接根據(jù)探針的熒光曲線判斷擴(kuò)增產(chǎn)物，不涉及任何對(duì)人體有毒害 作用的化學(xué)試劑，操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)短、安全、無(wú)污染。
[0037] 4、成本低、經(jīng)濟(jì)適用
[0038] 由于本發(fā)明具有高通量的特點(diǎn)，因此使得本發(fā)明中每個(gè)反應(yīng)管的成本低；同時(shí)，此 技術(shù)適用于檢測(cè)人類全血、組織等全基因組DNA樣本，較經(jīng)濟(jì)適用。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0039] 圖1為利用內(nèi)參基因（Target2)的引物與探針對(duì)人基因組DNA實(shí)時(shí)擴(kuò)增結(jié)果。曲 線1為純合陽(yáng)性樣本（2條DNA鏈均攜帶HLA - B*5801等位基因 ），Ct = 23. 20 ;曲線2為 雜合陽(yáng)性樣本（1條DNA鏈攜帶HLA - B*5801等位基因 ），Ct = 23. 97 ;曲線3為陰性樣本 (2條DNA鏈均不攜帶HLA -B*5801等位基因 ），Ct = 23. 45 ;NTC擴(kuò)增曲線表明此實(shí)驗(yàn)無(wú)污 染。
[0040] 圖2為利用目的基因（Targetl)的引物與探針對(duì)人基因組DNA實(shí)時(shí)熒光定量擴(kuò)增 結(jié)果曲線1為純合陽(yáng)性樣本（2條DNA鏈均攜帶HLA - B*5801等位基因 ），Ct = 24. 63 ;曲 線2為雜合陽(yáng)性樣本（1條DNA鏈攜帶HLA - B*5801等位基因 ），Ct = 25. 42 ;曲線3為陰 性樣本（2條DNA鏈均不攜帶HLA - B*5801等位基因 ），Ct = 36. 46 (>35. 0) ;NTC擴(kuò)增曲線 表明此實(shí)驗(yàn)及引物和探針無(wú)污染。
[0041] 圖3為利用FAM通道和HEX/VIC通道進(jìn)行雙通道熒光采集的實(shí)時(shí)定量擴(kuò)增結(jié)果。
[0042] 圖4和圖5為HLA -B*5801標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性樣本DNA系列稀釋后實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線，樣本系列 稀釋倍數(shù)分別為 1:5,1:25,1:125,1:625 ;其 Ct 值分別為 26. 968,29. 372,31. 731，34. 201。 其中圖4為目的基因稀釋后的實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線；圖5為目的基因和內(nèi)參基因整體稀釋后實(shí)時(shí) 擴(kuò)增曲線。
[0043] 圖6為SBT測(cè)序結(jié)果示意圖。

【具體實(shí)施方式】
[0044] 實(shí)施例1 TaqMan探針?lè)z測(cè)HLA - B*5801等位基因
[0045] 1、DNA樣本的提取及稀釋
[0046] 按常規(guī)方法獲得用乙二胺四乙酸（EDTA)抗凝的真空采血管采集靜脈血后，使用 QIAamp DNA Mini Blood Kit (德國(guó)Qiagen公司）試劑盒提取DNA;將已提取的DNA使用 NanoDrop 2000進(jìn)行濃度測(cè)定（A26Q/28。= 1· 95?2. 15)。用上述方法，分別測(cè)得104例布依 族DNA樣本濃度，然后使用PCR等級(jí)的Η20將樣本稀釋至10ng/ μ L。
[0047] 2、設(shè)計(jì)引物和探針
[0048] 在多態(tài)性位點(diǎn)集中的區(qū)域，利用ARMS方法設(shè)計(jì)HLA -Β*5801的特異性引物，上游引 物 F :5' - GGGCCGGAGTATTGGGATG - 3'，下游引物 R:5' - TTGGCCTCMCTGMMTGAAAC - 3'，以 及配套的熒光探針 probe:5' -HEX -TCAGGGAGGCGGATCTCGGAC - BHQ2 -3' ；另外在 β -actin 基因上設(shè)計(jì)內(nèi)參引物，上游引物Actin -F:5' -CAGCAGATGTGGATCAGCMG - 3'，下游引物Act in -R:5' -GCATTTGCGGTGGACGAT -3'，以及配套的熒光探針probe:5' -FAM -AGGAGTATGACGAGTC CGGCCCC - BHQ2 _ 3,。
[0049] 其 中，F(xiàn)AM 為 6-carboxyfluorescein;HEX 為 6 - carboxy - hexachlorofluorescein ；BHQ2 % Black Hole Quencher - 2 ;
[0050] 委托上海某公司合成。
[0051] 3、樣本檢測(cè)
[0052] 在熒光定量PCR儀上，將目的基因和內(nèi)參基因（ACTB)的引物、探針同時(shí)加入一個(gè) 管中，分別利用FAM通道和HEX/VIC通道進(jìn)行雙通道熒光采集；使用Premix Ex Taq試劑 盒（TaKaRa)進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系（20 μ L)包括：10 μ L Premix Ex Taq(2X)，HLA - B*5801 特異性上游引物Fp 250nM - 500nM,下游引物Rp 250nM - 500nM，HLA - B*5801特異性探針 100nM - 250nM，以及ACTB基因特異性上游引物100nM - 250nM，下游引物100nM - 250nM,探 針50nM - 250nM,然后加入被測(cè)樣本基因組DNA約lOng - 50ng，補(bǔ)充PCR等級(jí)的水至終體 積20μ L ;用于檢測(cè)HLA - B*5801基因型的擴(kuò)增程序：95°C預(yù)變性30s ;95°C 5s?10sec， 64°C 34s?40sec，共計(jì)35?40個(gè)循環(huán)。
[0053] 4、結(jié)果分析
[0054] 內(nèi)參基因作為質(zhì)控，必須出現(xiàn)熒光擴(kuò)增曲線；在內(nèi)參基因觀察到擴(kuò)增曲線的前提 下，特異性探針必須同時(shí)擴(kuò)增到曲線，則判斷待測(cè)樣本攜帶HLA-B*5801等位基因。本發(fā)明 中，有熒光擴(kuò)增曲線達(dá)到閾值以上，則代表該目的片段的特異性引物及探針與DNA模板結(jié) 合，并且引物能夠順利延伸，引物覆蓋區(qū)域堿基序列與模板序列一致，且探針覆蓋范圍內(nèi)堿 基也與模板序列一致。
[0055] 實(shí)施例2 HLA - B*5801基因型特異引物靈敏度檢測(cè)
[0056] 1、DNA樣本的稀釋
[0057] 取HLA-B*5801標(biāo)準(zhǔn)品DNA作為試驗(yàn)樣品，其濃度為10ng/uL。用PCR等級(jí)的 H20 5 倍連續(xù)稀釋樣品，SP 1:5，1:25，1:125，1:625 ;其 DNA 濃度分別為：10ng/yL，2ng/yL， 0· 4ng/u L，0. 08ng/y L。
[0058] 2、設(shè)計(jì)引物和探針
[0059] 在多態(tài)性位點(diǎn)集中的區(qū)域，利用ARMS方法設(shè)計(jì)HLA -B*5801的特異性引物，上游引 物 F :5' - GGGCCGGAGTATTGGGATG _ 3'，下游引物 R :5' _ TTGGCCTCMCTGAAAATGAMC - 3'，以 及配套的熒光探針口1'(*6:5'-冊(cè)乂-11^6640600641'(：11^八(：-811〇2-3' ；另外在@-;^忖11 基因上設(shè)計(jì)內(nèi)參引物，上游引物Actin -F:5' -CAGCAGATGTGGATCAGCAAG - 3'，下游引物Act in -R: 5' -GCATTTGCGGTGGACGAT -3'，以及配套的熒光探針probe: 5' -FAM -AGGAGTATGACGAGTC CGGCCCC - BHQ2 - 3,。
[0060] 其 中，F(xiàn)AM 為 6 - carboxyfluorescein ;HEX 為 6 - carboxy - hexachlorofluorescein ;BHQ2 為 Black Hole Quencher - 2 ;
[0061] 委托上海某公司合成。
[0062] 3、樣本檢測(cè)
[0063] 在熒光定量PCR儀上，將目的基因和內(nèi)參基因（ACTB)的引物、探針同時(shí)加入一 個(gè)管中，分別利用FAM通道和VIC通道進(jìn)行雙通道熒光采集；使用Premix Ex Taci試劑盒 (TaKaRa)進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系（2〇μ? 包括：l〇uL Premix Ex Taq(2X)，HLA_B*5801 特異性上游引物Fp 25〇nM - 5〇OnM,下游引物Rp 250nM - 500nM，HLA - B*5801特異性探針 ΙΟΟηΜ - 250nM，以及ACTB基因特異性上游引物ΙΟΟηΜ - 250nM，下游引物100nM - 250nM，探 針50nM - 250nM，然后加入被稀釋的標(biāo)準(zhǔn)樣品基因組DNA約2 u L，補(bǔ)充PCR等級(jí)的水至終 體積20 μ L ;用于檢測(cè)HLA _B*5801基因型的擴(kuò)增程序：95?預(yù)變性30s ;95°C 5s?10sec， 64? 34s?40sec，共計(jì)35?40個(gè)循環(huán)。
[0064] 4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0065] HLA - B*5801標(biāo)準(zhǔn)樣品DNA系列稀釋后實(shí)時(shí)擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖4、圖5。由圖4、 圖 5 可見(jiàn)，標(biāo)準(zhǔn)樣品系列稀釋倍數(shù) 1:5 (10ng/ μ L)，1:25 (2ng/ μ L)，1:125 (0. 4ng/ μ L)， 1:625(0. 08ng/yL)的 Ct 值分別為 26· 968,29. 372,31. 731,34. 201。本發(fā)明由此可檢測(cè)低 至0· 15ng DNA左右的樣本。
[0066] 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)：50例樣本進(jìn)行SBT測(cè)序與HLA - B*5801基因檢測(cè)方法比較
[0067] 從104例布依族樣本中隨機(jī)選取50例樣本，將其送至GenDx公司進(jìn)行SBT金標(biāo)準(zhǔn) 測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用峰圖和Excel表格進(jìn)行展示，以便對(duì)本發(fā)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行復(fù)核。將SBT測(cè) 序結(jié)果與本發(fā)明的檢測(cè)方法結(jié)果進(jìn)行比對(duì)（見(jiàn)表1)，發(fā)現(xiàn)兩者之間的陰、陽(yáng)性符合率均為 100%。
[0068] 表 1
[0069]

【權(quán)利要求】
1. 用于熒光PCR反應(yīng)高特異性擴(kuò)增HLA-B*5801等位基因的特異性引物探針組合，包 括： 上游引物 Fp :5' - AGGGGCCGGAGTATTGGGATG - 3' 下游引物 Rp:5' - TTGGCCTCAACTGAAAATGAAAC - 3' 探針 probe :5' - HEX - TCAGGGAGGCGGATCTCGGAC - BHQ2 - 3' 其中，HEX 為 6-carboxy-hexachlorofluorescein ;BHQ2 為 Black Hole Quencher-2〇
2. -種檢測(cè)HLA_B*5801等位基因的TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光PCR方法，用于非疾病診斷 目的，主要包括以下環(huán)節(jié) ： (1) 針對(duì)HLA -B*5801等位基因設(shè)計(jì)特異性引物和探針，即權(quán)利要求1所述的引物探針 組合；并設(shè)計(jì)內(nèi)參基因的引物和探針； (2) 獲得抽提的待測(cè)樣本基因組DNA ; (3) 在同一個(gè)反應(yīng)體系中，將待測(cè)樣本基因組DNA與所述引物探針組合以及內(nèi)參基因 的引物和探針按照確定比例混合； (4) 通過(guò)Applied Biosystem7500或者LightCycler System480進(jìn)行實(shí)時(shí)定量突光PCR 檢測(cè)，其中分別利用FAM通道和VIC通道進(jìn)行雙通道熒光采集； (5) 分析判斷待測(cè)樣本是否攜帶HLA - B*5801等位基因。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)HLA_B*5801等位基因的TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光PCR方 法，其特征在于，環(huán)節(jié)（1)中設(shè)計(jì)內(nèi)參基因 β -actin引物和探針為： 上游引物 Actin - F:5' - CAGCAGATGTGGATCAGCAAG - 3' 下游引物 Actin - R:5' - GCATTTGCGGTGGACGAT - 3' 探針 probe:5' - FAM - AGGAGTATGACGAGTCCGGCCCC - BHQ2 - 3' 其中，F(xiàn)AM 為 6 - carboxyfluorescein。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)HLA_B*5801等位基因的TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光PCR方 法，其特征在于：使用Premix Ex Taq試劑盒（TaKaRa)進(jìn)行擴(kuò)增，所述反應(yīng)體系以20 μ L計(jì)， 則包括：10μLPremixExTaq(2X)，HLA-B*5801 特異性上游引物Fp 250nM-500nM，下游 引物Rp 250nM - 500nM，HLA - Β*5801特異性探針ΙΟΟηΜ - 250ηΜ，以及ACTB基因特異性上 游引物 Actin - F ΙΟΟηΜ - 250ηΜ，下游引物 Actin - R ΙΟΟηΜ - 250ηΜ，探針 50nM - 250ηΜ ;然 后加入待測(cè)樣本基因組DNA約10ng - 50ng，補(bǔ)充PCR等級(jí)的水至終體積20 μ L ; 擴(kuò)增程序?yàn)椋?5°C預(yù)變性30s ;95°C 5s?lOsec，64°C 34s?40sec，共計(jì)35?40個(gè)循 環(huán)。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK104232781SQ201410503583
【公開(kāi)日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2014年9月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月26日
【發(fā)明者】康星, 王會(huì)娟, 陳融, 劉金輝, 戴鵬高, 李斌, 陳超 申請(qǐng)人:陜西佰美基因股份有限公司