一種使用硫酸軟骨素酶生產(chǎn)硫酸乙酰肝素的工藝的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種使用硫酸軟骨素酶生產(chǎn)硫酸乙酰肝素的工藝。首先將肝素鈉粗品經(jīng)過酶解、樹脂吸附、氯化鈉溶液洗脫得到洗脫物。將洗脫物用硫酸軟骨素ABC酶或硫酸軟骨素B酶進行酶解。利用這兩種酶專一切斷硫酸皮膚素結構中二糖單元之間1-4糖苷鍵的特異性，得到降解反應產(chǎn)物不飽和二糖。之后進行超濾、除重金屬、氧化等精制步驟得到硫酸乙酰肝素精品。該法既克服了硫酸乙酰肝素與硫酸皮膚素表面所帶負電荷密度相近難分離的特點，又避免了傳統(tǒng)路線得到硫酸乙酰肝素所帶進的重金屬離子雜質，提高了產(chǎn)品收率，有顯著的經(jīng)濟效益。
【專利說明】一種使用硫酸軟骨素酶生產(chǎn)硫酸乙酰肝素的工藝

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)硫酸乙酰肝素的工藝，特別涉及一種使用硫酸軟骨素酶生產(chǎn)硫酸乙酰肝素的工藝。

【背景技術】
[0002]硫酸乙酰肝素是一廣泛存在于動物細胞表面的糖胺聚糖，是藥物舒洛地特的主要組成部分。它在細胞的信號傳導、增生與分化、免疫調(diào)節(jié)、細胞黏附以及神經(jīng)細胞的信息傳遞等方面具有重要的生物學功能。硫酸乙酰肝素在組成糖基和糖苷鍵連接方式上類似肝素，但比肝素具有抗栓活性強，抗凝活性弱的優(yōu)點。由于其負電荷密度和分子量與硫酸皮膚素相近，故分離純化硫酸乙酰肝素成為制約藥物開發(fā)的難點。曾有文獻表明，利用硫酸皮膚素與硫酸乙酰肝素結構上的不同，用班氏試劑可以與硫酸皮膚素生產(chǎn)沉淀從而將兩者分離開來。但此方法收率低、周期長、成本高且引入較難除去的雜質銅離子而不被選擇。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的就是針對現(xiàn)有技術存在的上述缺陷，提供一種使用硫酸軟骨素酶生產(chǎn)硫酸乙酰肝素的工藝，利用這兩種酶能夠專一選擇切斷硫酸皮膚素氨基己糖和艾杜糖醛酸二糖之間的1-4糖苷鍵，將硫酸皮膚素降解成二糖小分子，從而與硫酸乙酰肝素分離開來，能夠得到大批量的精品硫酸乙酰肝素。
[0004]一種使用硫酸軟骨素酶生產(chǎn)硫酸乙酰肝素的工藝，包括如下制作步驟，濃度按質量百分比:
八將肝素鈉粗品溶于濃度為2 %的氯化鈉溶液中，采用酶解法酶解，對酶解液用陰離子交換樹脂充分吸附；
8步驟八中的陰離子交換樹脂用濃度為3.096-6.0%的氯化鈉溶液進行洗脫，得到洗脫液經(jīng)乙醇沉淀烘干得到洗脫物；
步驟8中得到的洗脫物溶為10.0%濃度，調(diào)節(jié)邱值為8.0-8.5，添加洗脫物重量
2.096-3.5%的0^12，后添加洗脫物重量3.0^-4.5%的充分攪拌反應，將沉淀過濾除去得到上清液；
0將步驟中的上清料液調(diào)節(jié)邱值為6.0-7.0，溫度20-401，加入硫酸軟骨素八80酶量為:酶/洗脫物=1000-2000幾/如，攪拌酶解8-124 ；或調(diào)節(jié)上清料液邱值7.0-8.5，溫度20-401，加入硫酸軟骨素8酶量為:酶/洗脫物=1500-2500幾/敁洗脫物，攪拌酶解8-1211 ；
2將酶解液用步驟再次除蛋白，調(diào)邱值至7.0，用31(超濾膜進行超濾3-處，取截留液用乙醇1.5-2.0倍沉淀；
？將步驟2所得沉淀物用純化水溶解，加入乙二胺四乙酸201八進行攪拌、吸附、過濾，濾液用1.5-2.0倍藥用乙醇沉淀，所得的沉淀物溶解并用雙氧水氧化處；
6將步驟？所得料液加入1.5-2.0倍藥用乙醇沉淀，棄上清，所得固體沉淀物再用純化水溶成10%濃度，經(jīng)0.22微米濾芯過濾，然后真空冷凍干燥，最終得到硫酸乙酰肝素精品。
[0005]優(yōu)選的，本發(fā)明提到的酶解法是指:
調(diào)節(jié)步驟4的肝素鈉溶液邱值8.0-8.5、溫度35-381，加入肝素鈉粗品重量的1.096-2.0%的胰蛋白酶解3-處，酶解完畢調(diào)料液邱值7.0-7.5，用強堿型陰離子交換樹脂對其充分吸附。
[0006]本發(fā)明與現(xiàn)有工藝相比，其優(yōu)點和有益效果在于:
1.本發(fā)明中前期獲得低鹽度洗脫物并不影響肝素鈉的收率，并且為肝素鈉的前期生產(chǎn)過程除掉大部分雜質；
2.本發(fā)明中所用到的酶制劑是基因重組酶，它是將來源于肝素黃桿菌的硫酸軟骨素8酶基因與麥芽糖結合蛋白基因融合于大腸桿菌中可溶性表達獲得此酶，與傳統(tǒng)酶相該酶具有酶效高、催化能力強，每升料液體積含酶活在50001^-7700 I[之間；
3.與傳統(tǒng)工藝相比，利用酶制劑得到硫酸乙酰肝素收率高、純度高、生產(chǎn)周期短且不會引入重金屬雜質。

【具體實施方式】
[0007]實施例1:
在攪拌條件下，將1001?粗品肝素鈉溶于10001質量百分比濃度為2%氯化鈉溶液中，以下無特殊說明均為質量百分比濃度。將料液溫度調(diào)至371，然后用濃度為6001/1的氫氧化鈉將料液邱值調(diào)節(jié)至8.5，加入1.5?胰蛋白酶酶解3卜。酶解完畢將料液調(diào)為邱值
7.0，料液用強堿型陰離子交換樹脂完全吸附至無料液。配置兩倍量樹脂體積且濃度為5.3%的氯化鈉溶液對樹脂柱進行洗脫。將得到的洗脫液用1.6倍體積的藥用乙醇沉淀處，棄上清且601烘干5匕得到洗脫物為17.7如。將此沉淀物溶于1771純化水中，調(diào)節(jié)料液邱值
8.0，，添加0.4? 0^12，后添加0.571(^2003進行充分攪拌反應1匕將沉淀過濾取上清液。用611101/1鹽酸調(diào)節(jié)料液邱值6.5，控制溫度301，加入2000011單位硫酸軟骨素八酶量，攪拌反應9卜。酶解結束，將酶解液用步驟再次除蛋白。之后調(diào)料液邱值7.0，用31(超濾膜進行超濾3匕取截留液用乙醇2.0倍沉淀得到沉淀物干品重約12.3X8。將所得沉淀物用801純化水溶解，加入乙二胺四乙酸￡01^0.76?進行攪拌處并過濾，濾液用2.0倍藥用乙醇沉淀。所得的沉淀物用純化水溶為100匕調(diào)節(jié)邱值為10.0，控制料液溫度調(diào)至351，加入30%雙氧水體積1匕氧化處。氧化完成經(jīng)0.22微米微孔濾膜過濾，濾過液用6001/1鹽酸將值調(diào)節(jié)為7.0，加入1.51?的氯化鈉，充分溶解后，加入2001藥用乙醇，攪拌300111，沉淀4小時。向沉淀物種加入純化水531將沉淀物溶解，然后經(jīng)0.22微米濾膜過濾至潔凈區(qū)真空冷凍干燥48卜制得精品硫酸乙酰肝素10.5如。經(jīng)過檢測其純度為94.6%，比旋度為+65.3，效價為7.61 口/呢。
[0008]實施例2:
在攪拌條件下，將1001?粗品肝素鈉溶于10001濃度為2%氯化鈉溶液中。將料液溫度調(diào)至351，然后用濃度為6001/1的氫氧化鈉將料液值調(diào)節(jié)至8.3，加入肝素鈉粗品重量的1.3?的胰蛋白酶酶解處。酶解完畢將料液調(diào)為邱值7.2，料液用強堿型陰離子交換樹脂完全吸附至無料液。配置兩倍量樹脂體積且濃度為4.6%的氯化鈉溶液對樹脂柱進行洗脫。將得到的洗脫液用2.0倍體積的藥用乙醇沉淀處，棄上清且601烘干5匕得到洗脫物為17.6如。將此沉淀物溶于1761純化水中，調(diào)節(jié)料液邱值8.3，添加0.52?的0^12，后添加0.70?的似#03進行充分攪拌反應1匕將沉淀過濾取上清液。用611101/1鹽酸調(diào)節(jié)料液邱值7.5，控制溫度361，加入硫酸軟骨素8酶量3520011攪拌反應10匕將酶解液用0步驟再次除蛋白。之后調(diào)料液邱值7.0，用31(超濾膜進行超濾3匕取截留液用乙醇2.0倍沉淀得到沉淀物干品重約12.8?.將所得沉淀物用801純化水溶解，加入乙二胺四乙酸2?進行攪拌處并過濾，濾液用2.0倍藥用乙醇沉淀。所得的沉淀物用純化水溶為1201,調(diào)節(jié)邱值為10.0，控制料液溫度調(diào)至371，加入30%雙氧水體積12匕氧化處。氧化完成經(jīng)0.22微米微孔濾膜過濾，濾過液用600:1/1鹽酸將邱值調(diào)節(jié)為7.0，加入1.5^的氯化鈉，充分溶解后，加入2001藥用乙醇，攪拌300111，沉淀4小時。向沉淀物種加入純化水601將沉淀物溶解，然后經(jīng)0.22微米微孔濾膜過濾至潔凈區(qū)真空冷凍干燥48卜制得精品硫酸乙酰肝素11.2敁。經(jīng)過肌。檢測其純度為95.6%，比旋度為+61.5，效價為8.91 口/呢。
[0009]實施例3:
在攪拌條件下，將1001?粗品肝素鈉溶于10001濃度為2%氯化鈉溶液中。將料液溫度調(diào)至381，然后用濃度為6001/1的氫氧化鈉將料液值調(diào)節(jié)至8.2，加入肝素鈉粗品重量的1?的胰蛋白酶酶解處。酶解完畢將料液調(diào)為邱值6.9，料液用強堿型陰離子交換樹脂完全吸附至無料液。配置兩倍量樹脂體積且濃度為3.7%的氯化鈉溶液對樹脂柱進行洗脫。將得到的洗脫液用2.0倍體積的藥用乙醇沉淀處，棄上清且601烘干5匕得到洗脫物為16.2X8。將此沉淀物溶于176[純化水中，調(diào)節(jié)料液邱值8.0，添加0.6?的，后添加0.7?的似#03進行充分攪拌反應1.5匕將沉淀過濾取上清液。用611101/1鹽酸調(diào)節(jié)料液邱值8.0，控制溫度381，加入硫酸軟骨素8酶量4000011攪拌反應10匕將酶解液用0步驟再次除蛋白。之后調(diào)料液邱值7.0，用31(超濾膜進行超濾處，取截留液用乙醇1.7倍沉淀得到沉淀物干品重約11.6?.將所得沉淀物用801純化水溶解，加入乙二胺四乙酸￡01^0.9?進行攪拌處并過濾，濾液用2.0倍藥用乙醇沉淀。所得的沉淀物用純化水溶為110匕調(diào)節(jié)邱值為10.0，控制料液溫度調(diào)至381，加入30%雙氧水體積1.1匕氧化處。氧化完成經(jīng)0.22微米微孔濾膜過濾，濾過液用6111011/1鹽酸將邱值調(diào)節(jié)為7.0，加入1.5^的氯化鈉，充分溶解后，加入2001藥用乙醇，攪拌30111111，沉淀4小時。向沉淀物種加入純化水601將沉淀物溶解，然后經(jīng)0.22微米微孔濾膜過濾至潔凈區(qū)真空冷凍干燥48卜制得精品硫酸乙酰肝素10.2如。經(jīng)過檢測其純度為97.2%，比旋度為+67.1，效價為8.21 口/呢。
【權利要求】
1.一種使用硫酸軟骨素酶生產(chǎn)硫酸乙酰肝素的工藝，其特征是包括如下制作步驟，濃度按質量百分比: 將肝素鈉粗品溶于濃度為2%的氯化鈉溶液中，采用酶解法酶解，對酶解液用陰離子交換樹脂充分吸附； 步驟A中的陰離子交換樹脂用濃度為3.0%-6.0%的氯化鈉溶液進行洗脫，得到洗脫液經(jīng)乙醇沉淀烘干得到洗脫物； 步驟B中得到的洗脫物溶為10.0%濃度，調(diào)節(jié)pH值為8.0-8.5，添加洗脫物重量.2.0%-3.5%的CaCl2，后添加洗脫物重量3.0%-4.5%的Na2C03充分攪拌反應，將沉淀過濾除去得到上清液； 將步驟C中的上清料液調(diào)節(jié)pH值為6.0-7.0，溫度20-40°C，加入硫酸軟骨素ABC酶量為:酶/洗脫物=1000-2000 IU/Kg，攪拌酶解8-12h ;或調(diào)節(jié)上清料液pH值7.0-8.5，溫度20-40°C，加入硫酸軟骨素B酶量為:酶/洗脫物=1500-2500 IU/Kg洗脫物，攪拌酶解8-12h ； 將酶解液用C步驟再次除蛋白，調(diào)pH值至7.0，用3K超濾膜進行超濾3-4h，取截留液用乙醇1.5-2.0倍沉淀； 將步驟E所得沉淀物用純化水溶解，加入乙二胺四乙酸EDTA進行攪拌、吸附、過濾，濾液用1.5-2.0倍藥用乙醇沉淀，所得的沉淀物溶解并用雙氧水氧化4h ； 將步驟F所得料液加入1.5-2.0倍藥用乙醇沉淀，棄上清，所得固體沉淀物再用純化水溶成10%濃度，經(jīng)0.22微米濾芯過濾，然后真空冷凍干燥，最終得到硫酸乙酰肝素精品。
2.根據(jù)權利要求1所述的使用硫酸軟骨素酶生產(chǎn)硫酸乙酰肝素的工藝，其特征是:所述的酶解法是指: 調(diào)節(jié)步驟A的肝素鈉溶液pH值8.0-8.5、溫度35-38 °C，加入肝素鈉粗品重量的.1.0%-2.0%的胰蛋白酶解3-4h，酶解完畢調(diào)料液pH值7.0-7.5，用強堿型陰離子交換樹脂對其充分吸附。
【文檔編號】C12P19/26GK104293866SQ201410480890
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年9月19日 優(yōu)先權日:2014年9月19日
【發(fā)明者】楊曉宏, 郭林, 李 榮, 崔慧斐, 李福川, 陳少鵬, 張中志 申請人:東營天東制藥有限公司