專利名稱：：天然酶與蛋白酶協(xié)同法制備硫酸軟骨素的工藝的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于生化制藥領域，具體涉及一種硫酸軟骨素的制備方法。
背景技術：
：硫酸軟骨素是廣泛存在于人和動物軟骨組織中的一類黏多糖，它作為結(jié)締組織的重要組成部分，具有多種藥理作用與生理功能。在我國硫酸軟骨素用于治療神經(jīng)痛、神經(jīng)性偏頭痛、關節(jié)炎、肩關節(jié)痛和腹腔手術后疼痛等，預防和治療鏈霉素引起的聽覺障礙及各種噪聲引起的聽覺困難、耳鳴癥等，效果顯著。在西方發(fā)達國家，硫酸軟骨素作為保健品長期應用于防治冠心病、心絞痛、心肌梗塞、冠狀動脈機能不全、心肌缺血等疾病，無明顯的毒副作用，能顯著降低冠心病患者的發(fā)病率和死亡率。長期的臨床應用發(fā)現(xiàn)，在動脈和靜脈壁上沉積的脂肪等脂質(zhì)可以被有效去除或減少，能顯著降低血漿膽固醇，從而防止動脈粥樣硬化的形成。硫酸軟骨素的提取方法主要有堿提-酶解法、堿提法、超聲波輔助法和乙酸提取法，而堿提-酶解法又分為稀堿-酶提取工藝、濃堿-酶提取工藝和稀堿稀鹽-酶提取工藝等。但是以上幾種提取方法都存在或多或少的問題，如工序長，堿鹽用量大、耗能高、收率低、產(chǎn)品純度低等。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有的稀堿稀鹽-酶提取工藝中產(chǎn)品收率低、純度低的缺點，提供一種利用天然酶與蛋白酶的協(xié)同作用來提高產(chǎn)品質(zhì)量的硫酸軟骨素的制備方法。天然酶是利用冷凍的豬胰臟經(jīng)機器絞碎后用30%左右的酒精均質(zhì)，酒精能使細胞膜破碎直接剌激胰酶的分泌。此法比用純胰酶成本低，酶的原始狀態(tài)好酶活高，實際效果比純胰酶更好。所用的蛋白酶是2709堿性蛋白酶，此酶是采用地衣型芽孢桿菌2709優(yōu)良菌株經(jīng)液態(tài)深層培養(yǎng)發(fā)酵提取的固態(tài)酶。本發(fā)明的目的可以通過以下措施達到一種天然酶與蛋白酶協(xié)同制備硫酸軟骨素的工藝，包括如下步驟(A)用NaHC03溶液清洗軟骨后蒸煮810小時；其中NaHC03溶液的質(zhì)量含量為15%。；(B)待冷卻至30°C以下后，加入NaOH和NaCl提取2次(2小時/次)；其中NaOH的用量為軟骨質(zhì)量的0.55%，NaCl的用量為軟骨質(zhì)量的5100/0;(C)向提取液中加入2709蛋白酶和豬胰臟，在4555。C、pH8.89.0下處理510小時，其中2709蛋白酶的加入量為軟骨質(zhì)量的0.31%，豬胰臟的加入量為軟骨質(zhì)量的510%;豬胰臟在加入前先經(jīng)過冷凍攪碎，用體積百分比為2040%的酒精混合均勻(酒精的加入量為豬胰臟質(zhì)量的0.52倍)；酶解的溫度優(yōu)選為4951°C，pH優(yōu)選為8.88.9;(D)經(jīng)過酶處理的提取液在溫度6567。C、pH4.44.6下處理0.53小時，再調(diào)pH5.56.0至明顯分層后，用747過濾布過濾，濾液減壓濃縮到原體積的1/3左右；(E)向濃縮液中加入酒精至酒精的體積含量為6268%，處理26小時進行一次沉淀，過濾；(F)濾液加入酒精至體積含量為7074%，處理0.21小時進行二次沉淀，再過濾，合并二次沉淀過濾物和一次沉淀過濾物，脫水、干燥得粗品。粗品經(jīng)過球磨后即得到白色粉末狀成品。本發(fā)明中的酒精除特別說明的以外，一般指純乙醇。通過反復實驗可以確定本發(fā)明的一種優(yōu)化的工藝條件，其中NaHCCb溶液的質(zhì)量含量為3%。，NaOH的用量為軟骨質(zhì)量的13%，NaCl的用量為軟骨質(zhì)量的79%，2709蛋白酶的加入量為軟骨質(zhì)量的0.40.8%，豬胰臟的加入量為軟骨質(zhì)量的79%，一次沉淀時加入酒精至酒精的體積含量為6466°/。，一次沉淀處理時間35小時，二次沉淀時加入酒精至酒精的體積含量為7173%，二次沉淀處理時間0.40.6小時。本發(fā)明采用兩種酶(2709蛋白酶和豬胰臟)按特定的比例混合使用，由于豬胰臟中胰酶的原始狀態(tài)好酶活高，通過與2709蛋白酶的協(xié)同作用從而提高酶解效率，再通過其他步驟的相互配合，可以使牛鼻骨最終收率達到25%以上，其他易提取軟骨的收率可達到40%。本發(fā)明的方法可以使最終產(chǎn)品中硫酸軟骨素的純度達到95°/。以上。豬胰臟直接攪碎使用省去了提取胰酶的步驟，縮短了處理時間，降低了生產(chǎn)成本。具體實施方式實施例1將冷凍的豬胰臟攪碎，用體積百分比為30%的酒精按1:1的比例混合均勻。將牛鼻骨用3%。的NaHC03溶液清洗后，蒸煮9小時；待冷卻至3(TC以下后，加入NaOH和NaCl提取2次/次2小時；其中NaOH的用量為軟骨質(zhì)量的2%，NaCl的用量為軟骨質(zhì)量的8。/。。向提取液中加入2709蛋白酶和處理過的豬胰臟，在51°C、pH8.88.9下處理7小時，其中2709蛋白酶的加入量為軟骨質(zhì)量的0.5%，豬胰臟的加入量為軟骨質(zhì)量的9%。經(jīng)過酶處理的提取液在溫度67°C、pH4.44.6下處理1小時，再調(diào)pH5.56.0至明顯分層后，過濾，濾液濃縮至原體積的1/3左右。向上述濃縮液中加入酒精至體積含量為64%,處理4小時進行一次沉淀，過濾；濾液再加入酒精至體積含量為73%，處理0.5小時進行二次沉淀，再過濾，合并二次沉淀過濾物和一次沉淀過濾物，脫水、干燥得粗品，再經(jīng)過球磨后即為白色粉末成品。最終成品的收率為28%，經(jīng)檢測，硫酸軟骨素的各項質(zhì)量指標如表1所示表l實施例l所得產(chǎn)品的各項質(zhì)量<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實施例2將豬胰臟攪碎，用體積百分比為30%的酒精按1:l的比例混合均勻。將牛鼻骨用3^的NaHC03溶液清洗后，蒸煮9小時；待冷卻至3(TC以下后，加入NaOH和NaCl提取2次/次2小時；其中NaOH的用量為軟骨質(zhì)量的2%，NaCl的用量為軟骨質(zhì)量的8%。向提取液中加入2709蛋白酶和處理過的豬胰臟，在5CTC、pH8.88.9下處理8小時，其中2709蛋白酶的加入量為軟骨質(zhì)量的0.6%，豬胰臟的加入量為軟骨質(zhì)量的8%。經(jīng)過酶處理的提取液在溫度66°C、pH4.44.6下處理1小時，再調(diào)pH5.56.0至明顯分層后，過濾，濾液濃縮至原體積的1/3左右。向上述濃縮液中加入酒精至體積含量為65%，處理4小時進行一次沉淀，過濾；濾液再加入酒精至體積含量為72%，處理0.5小時進行二次沉淀，再過濾，合并二次沉淀過濾物和一次沉淀過濾物，脫水、干燥得粗品，再經(jīng)過球磨后即為白色粉末成品。最終成品的收率為27%，經(jīng)檢測，硫酸軟骨素的純度為97%。實施例3除將牛鼻骨替換為牛喉管外，其他同實施例1，最終白色粉末的收率為19%，純度為96%。實施例4除將牛鼻骨替換為牛脊椎骨外，其他同實施例2，最終白色粉末的收率為8%，純度為96%。實施例5除將牛鼻骨替換為鴨喉管外，其他同實施例1，最終白色粉末的收率為39%，純度為95%。實施例6除將牛鼻骨替換為雞喉管外，其他同實施例2，最終白色粉末的收率為43%,純度為95%。權利要求1、一種天然酶與蛋白酶協(xié)同作用制備硫酸軟骨素的工藝，其特征在于包括如下步驟(A)用NaHCO3溶液清洗軟骨后蒸煮8～10小時；(B)加入NaOH和NaCl提取2次；(C)向提取液中加入2709蛋白酶和豬胰臟，在45～55℃、pH8.8～9.0處理5～10小時，其中2709蛋白酶的加入量為軟骨質(zhì)量的0.3～1％，豬胰臟的加入量為軟骨質(zhì)量的5～10％；(D)經(jīng)過酶處理的提取液在溫度65～67℃、pH4.4～4.6下處理0.5～3小時，再調(diào)pH5.5～6.0至明顯分層后，濾液減壓濃縮到原體積的1/3左右；(E)向濃縮液中加入酒精至酒精的體積含量為62～68％，，處理2～6小時進行一次沉淀，過濾；(F)濾液加入酒精至體積含量為70～74％，處理0.2～1小時進行二次沉淀，再過濾，合并二次沉淀過濾物和一次沉淀過濾物，脫水、干燥得粗品。2、根據(jù)權利要求1所述的天然酶與蛋白酶協(xié)同制備硫酸軟骨素的工藝，其特征在于豬胰臟加入前先經(jīng)過攪碎，用體積百分比為2040%的酒精混合均勻。3、根據(jù)權利要求2所述的天然酶與蛋白酶協(xié)同制備硫酸軟骨素的工藝，其特征在于酒精的加入量為豬胰臟質(zhì)量的0.52倍。4、根據(jù)權利要求1所述的天然酶與蛋白酶協(xié)同制備硫酸軟骨素的工藝，其特征在于所述的NaHC03溶液的質(zhì)量含量為15%。。5、根據(jù)權利要求1所述的天然酶與蛋白酶協(xié)同制備硫酸軟骨素的工藝，其特征在于用NaOH和NaCl提取時，NaOH的用量為軟骨質(zhì)量的0.55%，NaCl的用量為軟骨質(zhì)量的510%。6、根據(jù)權利要求1所述的天然酶與蛋白酶協(xié)同制備硫酸軟骨素的工藝，其特征在于步驟C中酶解的溫度為4951°C，pH為8.88.9。全文摘要本發(fā)明公開了一種天然酶與合成酶協(xié)同作用制備硫酸軟骨素的工藝，包括清洗蒸煮后加入NaOH和NaCl提取，再向提取液中加入合成酶(2709)和天然酶(豬胰臟)進行酶解處理，經(jīng)過酶處理的提取液去蛋白后濃縮，最后通過一次沉淀和二次沉淀即得到硫酸軟骨素粗品。本發(fā)明采用兩種酶按特定的比例混合使用，通過它們之間的協(xié)同作用從而提高酶解效率，再通過其他步驟的相互配合，可以使牛鼻骨的最終收率達到25％以上，硫酸軟骨素的純度達到95％以上。豬胰臟直接攪碎使用省去了提取胰酶的步驟，縮短了處理時間，大大降低了生產(chǎn)成本。文檔編號C12P19/00GK101348815SQ20081012479公開日2009年1月21日申請日期2008年9月3日優(yōu)先權日2008年9月3日發(fā)明者于文濤,卡張,晗楊,岸譚,和黃申請人:南京工業(yè)大學