一種檢測(cè)芒果橫線尾夜蛾pban基因表達(dá)特性的熒光定量pcr法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測(cè)芒果橫線尾夜蛾P(guān)BAN基因表達(dá)特性的熒光定量PCR法。本發(fā)明中芒果橫線尾夜蛾P(guān)BAN基因不同組織部位熒光定量PCR方法的建立，為研究芒果橫線尾夜蛾P(guān)BAN基因表達(dá)特性及性信息素產(chǎn)生的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
【專利說明】-種檢測(cè)芒果橫線尾夜蛾P(guān)BAN基因表達(dá)特性的熒光定量 PCR法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測(cè)芒果橫線尾夜蛾P(guān)BAN基因表達(dá)特性的熒光定量PCR法，特別 涉及在不同的組織部位檢測(cè)芒果橫線尾夜蛾P(guān)BAN基因表達(dá)量的高效快捷熒光定量PCR法。

【背景技術(shù)】
[0002] 昆蟲信息素生物合成激活神經(jīng)肽（pheromone biosynthesis activating neuropeptide, PBAN)是一種重要的昆蟲神經(jīng)肽，在成蟲的腦-食道下神經(jīng)節(jié)（SG)合成，暫 時(shí)儲(chǔ)存在心側(cè)體，在受到相應(yīng)的刺激時(shí)釋放出來，能調(diào)節(jié)昆蟲性信息素的生物合成與釋放。 Raina等研究發(fā)現(xiàn)棉鈴蟲性行為受到激素物質(zhì)的調(diào)控，并從棉鈴蟲腦-咽下神經(jīng)節(jié)復(fù)合體 中分離出PBAN。隨后，Kitamura等從家蠶的頭部分離純化得到兩個(gè)活性肽，分別命名為 Bom-PBAN I 和 Bom-PBAN II。
[0003] PBAN基因在鱗翅目昆蟲中廣泛存在，Xu等從煙草天蛾的咽下神經(jīng)節(jié)中克隆出 DH-PBAN基因，該基因在滯育與非滯育蟲體的蛹期表達(dá)量存在差異。Li等首次成功克隆了 沙棘木蠹蛾的PBAN基因，該基因在腦-咽下神經(jīng)節(jié)中表達(dá)量最高，同時(shí)證明該基因的表達(dá) 可能與幼蟲的生長(zhǎng)及雌蛾性信息素的生物合成有關(guān)。Choi和Vander首次從紅火蟻中克隆 出PBAN家族中的新基因，該基因中α -神經(jīng)肽缺失，研究表明PBAN基因的差異與昆蟲的種 類相關(guān)。
[0004] PBAN是由腦-咽下神經(jīng)節(jié)合成和分泌的，而不同組織中PBAN的表達(dá)存在差異。 Xu等將1日齡的煙草天蛾分為頭、咽下神經(jīng)節(jié)、胸神經(jīng)節(jié)、腹神經(jīng)節(jié)、中腸和馬氏管等組織 分析PBAN在不同組織中的表達(dá)，結(jié)果表明咽下神經(jīng)節(jié)中的表達(dá)量最高，其次是胸神經(jīng)節(jié)， 頭部、腹神經(jīng)節(jié)和非神經(jīng)組織中無表達(dá)。Lee和Boo將1日齡的小菜蛾雌蟲和雄蟲分別分 為頭、胸部和腹部三部分分析PBAN的表達(dá)差異，研究表明在雌蟲和雄蟲的不同部位均存在 PBAN基因的表達(dá)。Chen等將小菜蛾雌蟲分為頭-咽下神經(jīng)節(jié)、腹神經(jīng)索、性腺和卵巢四部 分組織，其中，頭-咽下神經(jīng)節(jié)PBAN基因表達(dá)量最高，腹神經(jīng)索、性腺和卵巢次之。Li等將 沙棘木蠹蛾末齡幼蟲分為頭-咽下神經(jīng)節(jié)、馬氏管、脂肪體和腹神經(jīng)索四部分分析PBAN的 表達(dá)量，其中，頭-咽下神經(jīng)節(jié)表達(dá)量最高，腹神經(jīng)索次之，非神經(jīng)組織表達(dá)量最低。Chang 等將3日齡的雌性和雄性成蟲分別分為頭胸組織和腹部組織兩部分分析PBAN的表達(dá)差異， 結(jié)果表明雌性和雄性成蟲的頭胸組織表達(dá)量較高，而腹部組織無表達(dá)或因表達(dá)量低而未被 檢出。
[0005] 關(guān)于芒果橫線尾夜蛾P(guān)BAN基因克隆及表達(dá)的研究國(guó)內(nèi)外未見報(bào)道，因此采用實(shí) 時(shí)熒光定量PCR研究芒果橫線尾夜蛾P(guān)BAN基因在不同組織的表達(dá)譜，為研究芒果橫線尾 夜蛾性引誘劑的開發(fā)，利用芒果橫線尾夜蛾性信息素來干擾成蟲交配，用于芒果橫線尾夜 蛾的監(jiān)測(cè)和防治等綠色環(huán)境友好型防治芒果橫線尾夜蛾的新方法和新技術(shù)，并明確該P(yáng)BAN 基因在芒果橫線尾夜蛾性信息素的合成與釋放調(diào)控的功能提供依據(jù)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的之一是為全面了解芒果橫線尾夜蛾P(guān)BAN基因的表達(dá)特性而設(shè)計(jì)的 不同組織部位。
[0007] 本發(fā)明的另一目的是提供一種高效快捷檢測(cè)芒果橫線尾夜蛾P(guān)BAN基因表達(dá)量的 實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。
[0008] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下： 芒果橫線尾夜蛾幼蟲或成蟲采集于福建省福清市，于福建省植物保護(hù)研究所飼養(yǎng)室用 嫩葉、嫩梢飼養(yǎng)。化蛹后用指形管單只分裝，蛹和成蟲飼養(yǎng)溫度（25±1.0)°C，相對(duì)濕度 60%?70%，光周期16 L:8D。收集羽化后24 h的芒果橫線尾夜蛾雌蟲3只，用刀片將頭、 胸、腹切割分離，用液氮研磨后，采用E. Z. N. A total RNA kit試劑盒進(jìn)行總RNA提取，共3 次重復(fù)。
[0009] 設(shè)計(jì)一對(duì)檢測(cè)芒果橫線尾夜蛾P(guān)BAN基因表達(dá)特性的引物，其特征包括符合熒光 定量PCR反應(yīng)特點(diǎn)的上下游引物： PBAN-F :5' -CGACTTGGCAGAACTATGAACTTTT -3' PBAN-R :5' -TCGTGCTCCTCACTACTCTCACTT-3' 以及作為內(nèi)參基因的上下游引物： Tubulin-F: 5'-TTGATGAGGTCCGCACTGGC-3' Tubulin-R: 5'-GATTTCCTTGCCGATGGTGTAG-3' 本發(fā)明所述檢測(cè)芒果橫線尾夜蛾P(guān)BAN基因表達(dá)特性的熒光定量PCR法，其特征按如下 步驟進(jìn)行： (l)cDNA第一鏈合成：提取樣本的總RNA并純化，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒得到以提取的RNA 為模板反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA ; (2 )對(duì)下述引物進(jìn)行常規(guī)PCR檢測(cè) 該基因的熒光定量上下游引物： PBAN-F :5' -CGACTTGGCAGAACTATGAACTTTT -3' PBAN-R :5' -TCGTGCTCCTCACTACTCTCACTT-3' 以及作為內(nèi)參基因的上下游引物： Tubulin-F: 5'-TTGATGAGGTCCGCACTGGC-3' Tubulin-R: 5'-GATTTCCTTGCCGATGGTGTAG-3' 常規(guī)PCR擴(kuò)增體系如下：

【權(quán)利要求】
1. 一種檢測(cè)芒果橫線尾夜蛾P(guān)BAN基因表達(dá)特性的熒光定量PCR法的特異性引物，其特 征包括符合熒光定量PCR反應(yīng)特點(diǎn)的上下游引物： PBAN-F :5'-CGACTTGGCAGAACTATGAACTTTT -3' ； PBAN-R :5'-TCGTGCTCCTCACTACTCTCACTT-3' ； 以及作為內(nèi)參基因的上下游引物： Tubulin-F: 5'-TTGATGAGGTCCGCACTGGC-3' ； Tubulin-R: 5'-GATTTCCTTGCCGATGGTGTAG-3'〇
2. -種檢測(cè)芒果橫線尾夜蛾P(guān)BAN基因表達(dá)特性的熒光定量PCR法，其特征在于：包括 如下步驟： (1) 芒果橫線尾夜蛾處理試驗(yàn)：收集羽化后24 h的芒果橫線尾夜蛾雌蟲3只，用刀片將 頭、胸、腹切割分離，用液氮研磨后，采用E.Z.N.A total RNA kit試劑盒進(jìn)行總RNA提取， 共3次重復(fù)； (2) cDNA第一鏈合成：提取樣本的總RNA并純化，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒得到以提取的RNA 為模板反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA ; (3 )對(duì)下述引物進(jìn)行常規(guī)PCR檢測(cè) 該基因的熒光定量上下游引物： PBAN-F :5' -CGACTTGGCAGAACTATGAACTTTT -3' ； PBAN-R:5' -TCGTGCTCCTCACTACTCTCACTT-3' ； 以及作為內(nèi)參基因的上下游引物： Tubulin-F: 5'-TTGATGAGGTCCGCACTGGC-3' ； Tubulin-R: 5'-GATTTCCTTGCCGATGGTGTAG-3' ； 常規(guī)PCR擴(kuò)增休系如下：
常規(guī)PCR反應(yīng)程序如下：94°C預(yù)變性5 min，然后94°C變性30sec，55°C退火30sec， 72°C延伸lmin，在此條件下進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72°C再延伸lOmin ; (3)實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)： 以步驟（2)得到的cDNA為模板，加入步驟（3)所述的引物，進(jìn)行熒光定量PCR程序反 應(yīng)，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，擴(kuò)增后取平均值； 丈時(shí)炎光?.Ρ: Κ'Μ廣】--休系如下：
實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)程序如下：95°C預(yù)變性3 min，然后95°C變性10sec，6(TC退火 3〇sec，在此條件下進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104152559SQ201410399669
【公開日】2014年11月19日 申請(qǐng)日期:2014年8月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月15日
【發(fā)明者】魏輝, 鄭麗禎, 田厚軍, 陳藝欣, 林碩, 常虹 申請(qǐng)人:福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所