檢測蓮草直胸跳甲hsp70基因表達特性的熒光定量pcr法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測蓮草直胸跳甲HSP70基因表達特性的熒光定量PCR法。本發(fā)明中蓮草直胸跳甲HSP70基因在不同溫度處理下熒光定量PCR方法的建立，為研究蓮草直胸跳甲HSP70基因表達特性及耐熱性產生的機制奠定了基礎。
【專利說明】檢測蓮草直胸跳甲HSP70基因表達特性的熒光定量PCR法

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種檢測蓮草直胸跳甲熱休克蛋白70 (HSP70)基因表達特性的熒光定量PCR法，特別涉及不同溫度(37°C _45°C)處理下檢測蓮草直胸跳甲HSP70基因表達量的高效快捷熒光定量PCR法。

【背景技術】
[0002]蓮草直胸跳甲屬鞘翅目，葉甲科，是空心蓮子草的主要生防天敵之一。GeorgeVogt于1962年首次發(fā)現(xiàn)了蓮草直胸跳甲對空心蓮子草有很好的控制作用。其后，蓮草直胸跳甲在美國、澳大利亞等地被廣泛應用于空心蓮子草的控制，并取得了較好的防治效果。我國于1986年從美國引進蓮草直胸跳甲，并應用于空心蓮子草的生物防治，在四川、浙江、福建、廣西等地取得一定的成功。
[0003]在我國，蓮草直胸跳甲各個蟲態(tài)在不同生境中隨季節(jié)的變化呈現(xiàn)出相應的種群變化規(guī)律，特別是在盛夏高溫季節(jié)，蓮草直胸跳甲種群數(shù)量快速下降，容易導致其夏季種群崩潰，不利于夏季高溫季節(jié)空心蓮子草的生物防治，而熱帶國家(如泰國)的蓮草直胸跳甲種群可以在高溫環(huán)境中正常生存繁育，因而有必要研究蓮草直胸跳甲耐熱性產生的分子機理，了解蓮草直胸跳甲的生長發(fā)育對溫度的依賴規(guī)律。
[0004]昆蟲在遭受到熱應激或其他誘導時體內會產生熱休克蛋白(heat shockprotein,HSP),而正常的蛋白質合成受到抑制。熱休克蛋白最早由Ritossa于1962年在昆蟲中發(fā)現(xiàn)。根據(jù)熱休克蛋白的結構、功能、大小不同將其分為HSP100、HSP90、HSP70、HSP60、HSP20等幾大家族，其中HSP70是生物體內最保守和最重要的熱休克蛋白家族，在幾乎所有生物的應激細胞中都能被高度誘導。近年來隨著生物科學技術的不斷發(fā)展，熱休克蛋白的研究已經取得了很大的發(fā)展。由于昆蟲熱休克蛋白參與耐熱反應過程，因此研究昆蟲HSPs和耐熱性的關系，有助于了解昆蟲的生長發(fā)育與溫度之間的依賴性。關于蓮草直胸跳甲HSP70基因克隆及表達的研究國內外未見報道，因此采用實時熒光定量PCR研究不同溫度處理下蓮草直胸跳甲HSP70基因的表達特性，一方面為我們全面深入地開展蓮草直胸跳甲HSP70基因的研究提供基礎數(shù)據(jù)，另一方面使其作為蓮草直胸跳甲育種的一個備選基因，為將來選育耐熱能力強的蓮草直胸跳甲品種提供可能。


【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的目的之一是為全面了解蓮草直胸跳甲HSP70基因的表達特性而設計的不同處理溫度。
[0006]本發(fā)明的另一目的是提供一種高效快捷檢測蓮草直胸跳甲HSP70基因表達量的實時熒光定量PCR方法。
[0007]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術方案如下:
將5組蓮草直胸跳甲分別在37 °C、39 °C、41 °C、43 V和45 V下熱激處理1.5 h后在26 °C恢復I h，每個樣品做3個平行重復。
[0008]設計一對檢測蓮草直胸跳甲HSP70基因表達特性的引物，其其特征包括符合熒光定量PCR反應特點的上下游引物:
HSP70-F:5'- GCAGGTTGATTATCTGCGTATGTT -3'、
HSP70-R:5'- ATTGAGACAGCAGGAGGAGTTATG -3' ；
以及作為內參基因的上下游引物:
Tubulin-F: 5'-CAGGTGAAGGTATGGACGAAAT-3'、
Tubulin-R: 5'-GCCTCTTGGTATTGTTGGTATTC-3' ；
本發(fā)明所述檢測蓮草直胸跳甲HSP70基因表達特性的熒光定量PCR法，其特征按如下步驟進行:
(1)cDNA第一鏈合成:提取樣本的總RNA并純化，采用反轉錄試劑盒得到以提取的RNA為模板反轉錄得到的cDNA ；
(2)對下述引物進行常規(guī)PCR檢測該基因的熒光定量上下游引物:
HSP70-F:5'- GCAGGTTGATTATCTGCGTATGTT -3'
HSP70-R:5'- ATTGAGACAGCAGGAGGAGTTATG -3'
以及作為內參基因的上下游引物:
Tubulin-F: 5'-CAGGTGAAGGTATGGACGAAAT-3'
Tubulin-R: 5'-GCCTCTTGGTATTGTTGGTATTC-3'
常規(guī)PCR擴增體系如下:

【權利要求】
1.一種檢測蓮草直胸跳甲HSP70基因表達特性的特異性引物，其特征在于:包括符合熒光定量PCR反應特點的上下游引物:
HSP70-F:5'- GCAGGTTGATTATCTGCGTATGTT -3'、
HSP70-R:5'- ATTGAGACAGCAGGAGGAGTTATG -3' ； 以及作為內參基因的上下游引物:
Tubulin-F: 5'-CAGGTGAAGGTATGGACGAAAT-3'、
Tubulin-R: 5'-GCCTCTTGGTATTGTTGGTATTC-3'。
2.一種檢測蓮草直胸跳甲HSP70基因表達特性的熒光定量PCR法，其特征在于，包括以下步驟: (1)蓮草直胸跳甲處理試驗:在26°C室溫采集蓮草直胸跳甲成蟲到Eppendorf管中，每個管內有雌雄蓮草直胸跳甲各3頭，共5組樣品；將5組蓮草直胸跳甲分別在37°C、39°C、41°C、43°C和45°C下熱激處理1.5 h后在26°C恢復I h，每個樣品做3個平行重復； (2)cDNA第一鏈合成:提取樣本的總RNA并純化，采用反轉錄試劑盒得到以提取的RNA為模板反轉錄得到的cDNA ； (3)對下述引物進行常規(guī)PCR檢測: 該基因的熒光定量上下游引物:
HSP70-F:5'- GCAGGTTGATTATCTGCGTATGTT -3'、
HSP70-R:5'- ATTGAGACAGCAGGAGGAGTTATG -3' ； 以及作為內參基因的上下游引物:
Tubulin-F: 5'-CAGGTGAAGGTATGGACGAAAT-3'、
Tubulin-R: 5'-GCCTCTTGGTATTGTTGGTATTC-3' ； 常規(guī)PCR擴增休系如下:
常規(guī)PCR反應程序如下:94°C預變性5 min,然后94°C變性30sec，56°C退火30sec，72°C延伸lmin，循環(huán)35次，最后72°C再延伸1min ； (4)實時熒光定量PCR反應: 以步驟(2)得到的cDNA為模板，加入步驟(3)所述的引物，進行熒光定量PCR程序反應，每個樣品設置3個重復，擴增后取平均值； 實時熒光定量PCR擴增體系如下:
實時熒光定量PCR反應程序如下:95°C預變性3 min，然后95°C變性10sec，60°C退火30sec，循環(huán)40次。
【文檔編號】C12Q1/68GK104131109SQ201410399664
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年8月15日 優(yōu)先權日:2014年8月15日
【發(fā)明者】鄭麗禎, 傅建煒, 游泳, 林濤, 史夢竹, 李建宇 申請人:福建省農業(yè)科學院植物保護研究所