一種維生素b12核糖體開關(guān)載體的構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于基因工技術(shù)程領(lǐng)域，涉及一種維生素B12核糖體開關(guān)載體構(gòu)建的方法o以Propionibacteriumfreudenreichiisubsp.ShermaniiM株的全基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得完整的核糖體開關(guān)基因序列，將其插入到p5質(zhì)粒中構(gòu)建重組載體P519-SWITCH-GFP。該構(gòu)建的重組載體在宿主菌大腸桿菌BL21內(nèi)，可以感應(yīng)維生素B12濃度的變化，相應(yīng)調(diào)控?zé)晒獾鞍祝℅FP)的表達(dá)量，為維生素B12的檢測提供了一種新的技術(shù)支持和理論依據(jù)。
【專利說明】一種維生素 B12核糖體開關(guān)載體的構(gòu)建方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種維生素 B12核糖體開關(guān)載體的構(gòu)建 方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 核糖體開關(guān)是近些年來新發(fā)現(xiàn)的一種mRNA分子，位于mRNA的特定區(qū)域，通過感知 代謝物濃度的變化調(diào)控目標(biāo)基因的表達(dá)，在調(diào)控基因表達(dá)過程中不需要蛋白因子的參與。 核糖體開關(guān)由適體（aptamer domain)域和表達(dá)平臺（expression platform)兩部分組成， 適體域能折疊成多維結(jié)構(gòu)，感知目標(biāo)代謝物濃度的變化，并特異性的結(jié)合目標(biāo)代謝物，表達(dá) 平臺位于適體域的下游，通常和適體域具有一定的重疊。當(dāng)目標(biāo)代謝物與適體域相結(jié)合后， 表達(dá)平臺的RNA空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，調(diào)控基因表達(dá)。
[0003] P. freudenreichii (shermanii)是目前生產(chǎn)維生素 B12優(yōu)勢菌種之一。維生素 B12 是一組含鈷元素的化合物，又稱鈷胺素，分為四大類：氰鈷胺、羥鈷胺、甲鈷胺和腺苷鈷胺。 其中腺苷鈷胺（Cobamamide)是自然界中以天然存在形式最多的一類。通過對該菌株的基 因組序列同源性比對分析，發(fā)現(xiàn)該菌有核糖體開關(guān)的保守RNA序列，屬于翻譯調(diào)控型核糖 體開關(guān)。
[0004] P. freudenreichii (shermanii)菌株發(fā)酵生產(chǎn)腺苷鈷胺過程中，當(dāng)腺苷鈷胺的濃 度達(dá)到一定閾值時，目標(biāo)代謝物腺苷鈷胺與該菌核糖體開關(guān)的適體域相結(jié)合后，mRNA上表 達(dá)平臺的空間折疊結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，影響核糖體和mRNA的核糖體結(jié)合位點（RBS)結(jié)合,從而 起到調(diào)控基因表達(dá)的作用。維生素 B12核糖體開關(guān)可進(jìn)一步研究，并開發(fā)應(yīng)用于維生素 B12 的檢測。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種維生素 B12核糖體開關(guān)載體的構(gòu)建 方法，尤其是一種通過腺苷鈷胺濃度變化來調(diào)控?zé)晒獾鞍祝℅FP)量表達(dá)變化的維生素 B12核 糖體開關(guān)綠色熒光蛋白（GFP)表達(dá)載體。
[0006] 本發(fā)明技術(shù)方案是：
[0007] -種維生素 B12核糖體開關(guān)載體的構(gòu)建方法包括以下步驟：
[0008] 1)根據(jù)維生素 B12核糖體開關(guān)RNA的保守序列，在NCBI網(wǎng)站上與 P. freudenreichii (shermanii)菌株全基因組進(jìn)行同源性比對，發(fā)現(xiàn)該菌株基因組上 213bp的堿基序列與維生素 B12核糖體開關(guān)的保守序列同源性高達(dá)98%，從而確定維生素 B12核糖體開關(guān)的目的基因序列，
[0009] 維生素 B12核糖體開關(guān)目的基因堿基序列為：
[0010] TGTACTAGGGTCAATGTGCTGGCCTCGGCCAGCGCGCGTCCGCAGCGAAGCCGGTGGGAATCCGGCACT GTCCCGCAACGGTGATGGGGCCCGGCCCCGAGTCCGGTCGACTGTGGACGTGTCCCCACATTGCCCCGGCGCAAGGT CAGCCCCACGAGCTGCCTGCGCGTGCACCGCGAAGGACGGCCCGTGGATTTGAGGTTCTTGTCCGAG ；
[0011] 2)以P. freudenreichii (shermanii)菌株的基因組為模板，設(shè)計維生素 B12核糖 體開關(guān)目的基因序列的上、下游引物，在上游引物引入Xba I酶切位點，下游引物引入Nde I酶切位點，通過PCR擴(kuò)增獲得兩端帶有酶切位點的完整的維生素 B12核糖體開關(guān)目的基因 序列，獲得的目的基因序列用Xba I和Nde I酶消解，目的基因片段兩端露出黏性末端，PCR 產(chǎn)物純化試劑盒回收目的基因序列。
[0012] 3)用Xba I和Nde I雙酶切表達(dá)熒光蛋白的p519ngfp質(zhì)粒，1 %瓊脂糖凝膠電泳 回收雙酶切質(zhì)粒。
[0013] 4)將步驟3)回收的雙酶切質(zhì)粒與維生素 B12核糖體開關(guān)目的基因序列進(jìn)行連接， 得到重組載體質(zhì)粒P519-SWITCH-GFP。
[0014] 所述的步驟2)為：
[0015] 1)從 P. freudenreichii (shermanii)菌株中提取全基因組；
[0016] 2)以該菌株的基因組為模板，設(shè)計維生素 B12核糖體開關(guān)目的基因序列的上、下游 引物，在上游引物引入Xba I酶切位點，下游引物引入Nde I酶切位點，通過PCR擴(kuò)增獲得 兩端帶有酶切位點的完整的維生素 B12核糖體開關(guān)目的基因序列；
[0017] 3)將PCR產(chǎn)物用Xba I和Nde I限制性內(nèi)切酶在37°C水浴條件下，雙酶切4個小 時，用PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收核糖體開關(guān)目的基因序列。
[0018] 所述步驟2)中維生素 B12核糖體開關(guān)目的基因序列的上、下游引物為：
[0019] Riboswitch-F 5'GCTCTAGATGTACTAGGGTCAATGTGCTGG 3' （Xba I);
[0020] Riboswitch-R 5' GGAATTCCATATGGGACAAGAACCTCAAATCCACG 3'（Nde I)。
[0021] 所述的步驟4)為：
[0022] 1)把純化好的雙酶切維生素 B12核糖體開關(guān)目的基因序列與割膠回收的雙酶切質(zhì) 粒在16°C水浴的條件下，T4DNA連接酶連接過夜；
[0023] 2)用CaCl2法制備E. coli DH5 α和E. coli BL21 (DE3)感受態(tài)，將重組的質(zhì)粒轉(zhuǎn) 化進(jìn)Ε. coli DH5a感受態(tài)，在Kanamycin的LB固體培養(yǎng)基的平皿上涂布，篩選具有維生素 B12核糖體開關(guān)目的基因序列的重組質(zhì)粒。
[0024] 3)將拷貝有重組質(zhì)粒的E. coli DH5a進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，用質(zhì)粒抽提試劑盒提取重 組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化進(jìn)E. coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。
[0025] 本發(fā)明利用P. freudenreichii (shermanii)菌株的維生素 B12核糖體開關(guān)構(gòu)建重 組載體，核糖體開關(guān)大小在數(shù)百堿基之內(nèi)，與目標(biāo)代謝物結(jié)合迅速、識別特異性強(qiáng)。該構(gòu)建 的重組載體在宿主菌大腸桿菌BL21內(nèi)，可以感應(yīng)維生素 B12濃度的變化，相應(yīng)調(diào)控?zé)晒獾鞍?(GFP)的表達(dá)量，為維生素 B12的檢測提供了一種新的技術(shù)支持和理論依據(jù)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026] 圖1維生素 B12(Cobamamide)核糖體開關(guān)的調(diào)控模式，A為不加腺苷鈷胺的調(diào)控機(jī) 制，B為加腺昔鉆胺的調(diào)控機(jī)制。
[0027] 圖2為本發(fā)明構(gòu)建質(zhì)粒重組示意圖。
[0028] 圖3為P. freudenreichii (shermanii)菌株全基因組的0· 5%瓊脂糖凝膠電泳圖， 泳道1、2、3、4為4組平行提取的全基因組上樣凝膠電泳。
[0029] 圖4rTaq酶PCR基因組凝膠電泳圖，泳道1、2、3、4為4組平行上樣凝膠電泳，泳道 5為不加基因組DNA模板做陰性對照，234bp為目的基因213bp加上兩端的酶切位點及保護(hù) 喊基。
[0030] 圖5酶切p519ngfp質(zhì)粒凝膠電泳圖，泳道1為p519ngfp質(zhì)粒的Xba I單酶切條 帶，泳道2為p519ngfp質(zhì)粒的Nde I單酶切條帶，泳道3為p519ngfp質(zhì)粒的Xba I和Nde I雙酶切條帶，泳道4為p519ngfp原質(zhì)粒條帶做對照。
[0031] 圖6 Omg/L腺苷鈷胺的原質(zhì)粒p519ngfp熒光開啟的熒光顯微鏡圖。
[0032] 圖7 Omg/L腺苷鈷胺的原質(zhì)粒p519ngfp熒光未開啟的熒光顯微鏡圖。
[0033] 圖8 3mg/L腺苷鈷胺的原質(zhì)粒p519ngfp熒光開啟的熒光顯微鏡圖。
[0034] 圖9 3mg/L腺苷鈷胺的原質(zhì)粒p519ngfp熒光未開啟的熒光顯微鏡圖。
[0035] 圖10 Omg/L腺苷鈷胺的重組質(zhì)粒p519-SWITCH-GFP熒光開啟的熒光顯微鏡圖。
[0036] 圖11 Omg/L腺苷鈷胺的重組質(zhì)粒p519-SWITCH-GFP熒光未開啟的熒光顯微鏡圖。
[0037] 圖12 3mg/L腺苷鈷胺的重組質(zhì)粒p519-SWITCH-GFP熒光開啟的熒光顯微鏡圖。
[0038] 圖13 3mg/L腺苷鈷胺的重組質(zhì)粒p519-SWITCH-GFP熒光未開啟的熒光顯微鏡圖。

【具體實施方式】
[0039] 以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0040] PCR擴(kuò)增維生素 B12核糖體開關(guān)目的序列，將目的序列與p519ngfp綠色熒光蛋白 (GFP)表達(dá)載體相連接，得到能根據(jù)腺苷鈷胺濃度變化來調(diào)控綠色熒光蛋白（GFP)的重組 載體。
[0041] 本發(fā)明利用P. freudenreichii (shermanii)菌株的維生素 B12核糖體開關(guān)構(gòu)建重 組載體，核糖體開關(guān)大小在數(shù)百堿基之內(nèi)，與目標(biāo)代謝物結(jié)合迅速、識別特異性強(qiáng)。
[0042] 本發(fā)明包括以下步驟：
[0043] (1)根據(jù)核糖體開關(guān)RNA的保守序列，在NCBI網(wǎng)站上與 P. freudenreichii (shermanii)菌株全基因組進(jìn)行同源性比對，確定維生素 B12核糖體開關(guān) 目的序列。
[0044] 根據(jù)Alexey等人用RNA-PATTERN程序在67株菌中發(fā)現(xiàn)了近200個維生素 B12核 糖體開關(guān)元件,通過將這67株菌核糖體開關(guān)RNA序列進(jìn)行同源性比對，標(biāo)注了維生素 B12核 糖體開關(guān)保守序列。
[0045] P. freudenreichii (shermanii)菌株是維生素 B12主要生產(chǎn)菌株之一，在NCBI網(wǎng) 站上將維生素 B12核糖體開關(guān)保守序列與P. freudenreichii (shermanii)菌株全基因組 GenBank (登錄號：NC_014215. 1)序列同源性比對，發(fā)現(xiàn)該菌株基因組上213bp的堿基序列 與維生素 B12核糖體開關(guān)的RNA保守序列同源性高達(dá)98%。
[0046] 維生素 B12核糖體開關(guān)目的基因堿基序列：
[0047] TGTACTAGGGTCAATGTGCTGGCCTCGGCCAGCGCGCGTCCGCAGCGAAGCCGGTGGGAATCCGGCACT GTCCCGCAACGGTGATGGGGCCCGGCCCCGAGTCCGGTCGACTGTGGACGTGTCCCCACATTGCCCCGGCGCAAGGT CAGCCCCACGAGCTGCCTGCGCGTGCACCGCGAAGGACGGCCCGTGGATTTGAGGTTCTTGTCCGAG
[0048] (2)通過細(xì)菌DNA少量制備法,提取P. freudenreichii (shermanii)菌株全基因 組，以該基因組為模板，設(shè)計核糖體開關(guān)基因序列的上、下游引物時，在上游引物引入Xba I 酶切位點，下游引物引入Nde I酶切位點；進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得兩端帶有酶切位點的完整的維 生素 B12核糖體開關(guān)目的序列。
[0049] 維生素 B12核糖體開關(guān)目的基因上、下游引物為：
[0050] Riboswitch-F 5'GCTCTAGATGTACTAGGGTCAATGTGCTGG 3'
[0051](劃線部分為Xba I酶切位點，GC為保護(hù)堿基）；
[0052] Riboswitch-R 5'GGAATTCCATATGGGACAAGAACCTCAAATCCACG 3'
[0053] (劃線部分為Nde I酶切位點，GGAATTC為保護(hù)堿基）。
[0054] (3)獲得的目的基因序列用Xba I和Nde I酶在37°C水浴條件下酶切4小時，目 的基因片段兩端露出黏性末端，PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收目的基因序列。
[0055] (4) p519ngfp熒光蛋白（GFP)表達(dá)載體在Xba I和Nde I酶在37°C水浴條件下酶 切4小時，用1 %的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，割膠回收雙酶切載體。
[0056] (5)將雙酶切目的基因序列和雙酶切載體用T4連接酶連接，在16°C水浴的條件 下，T4連接酶連接過夜。
[0057] (6)將重組載體轉(zhuǎn)入用CaCl2法制備大腸桿菌DH5 α感受態(tài)中保存和擴(kuò)增重組質(zhì) 粒，在含有Kanamycin的LB固體培養(yǎng)基的平皿上涂布，并篩選具有維生素 B12核糖體開關(guān)基 因序列的重組質(zhì)粒。
[0058] (7)將具有維生素 B12核糖體開關(guān)基因序列的陽性轉(zhuǎn)化子擴(kuò)大培養(yǎng)，提取具有維生 素 B12核糖體開關(guān)基因序列的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入用CaCl2法制備大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)中， 在含有Kanamycin的LB固體培養(yǎng)基的平皿上涂布，挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)。
[0059] (8)在添加有不同腺苷鈷胺濃度的LB液體培養(yǎng)基中，接種1%的有重組質(zhì)粒的大 腸桿菌BL21(DE3)，觀察熒光蛋白（GFP)的表達(dá)情況。
[0060] 實施例I :P. freudenreichii (shermanii)菌株的全基因組提取。
[0061] 細(xì)菌基因組DNA的少量制備。具體步驟如下：
[0062] (1)從平板培養(yǎng)基上挑選單菌落接種至5mL的液體LB培養(yǎng)基中，適當(dāng)溫度條件下 振蕩過夜（overnight, 0/N)。
[0063] (2)取菌液 3mL 于 Eppendorf 管中，12000/min 離心 Imin 棄上清。
[0064] (3)加入lOOuLGTE溶液，在漩渦混合器上振蕩混勻至沉淀徹底分散。
[0065] (4)加入500ULGTE溶液，振蕩混勻（注意不要殘留細(xì)小菌塊）。
[0066] (5)向懸液中加入6 μ L的100mg/mL溶菌酶至終濃度為lmg/mL，37°C處理30min。
[0067] (6)向懸液中加入6 μ L的蛋白酶K(10mg/mL)至終濃度為0· lmg/mL,混勻，55°C繼 續(xù)溫浴lh，中間輕緩顛倒微量離心管數(shù)次。
[0068] (7)溫浴結(jié)束后向溶液中加入等體積（600ul)的酚：氯仿：異戊醇（25:24:1，V/V/ V)，上下顛倒充分混勻，12000r/min離心5min，上清液移到新的離心管中，然后再用酚/氯 仿/異戊醇溶液抽提一次。
[0069] (8)取上清液用等體積的氯仿/異戊醇抽提一次。
[0070] (9)取上清液（約500uL)至新的離心管中，向上清中加入1/10體積（約50uL)的 3mol/L醋酸鈉（ρΗ5· 2)，混勻加入2倍體積的無水乙醇，上下顛倒混勻，-20°C靜置30min沉 淀 DNA，取出 4°C，12000r/min 離心 10min。
[0071] (10)小心棄取上清液，用ImL的70%乙醇洗漆沉淀，4°C，12000r/min離心5min。 自然干燥或放入55°C烘箱中數(shù)分鐘除去乙醇。
[0072] (11)用60uL含有RNaseA (終質(zhì)量濃度20ug/mL)的TE溶解，37°C溫浴30min，除 去RNA
[0073] (12)取5uL樣品進(jìn)行電泳確定DNA的含量。
[0074] 實施例2 :PCR擴(kuò)增維生素 B12核糖體開關(guān)目的基因序列。
[0075] 以P. freudenreichii (shermanii)菌株的全基因組序列為模板，根據(jù)維生素 B12核 糖體開關(guān)基因序列設(shè)計上、下游引物。在上游引物引入Xba I酶切位點，下游引物引入Nde I酶切位點。
[0076] 上下游引物為：
[0077] Riboswitch-F 5' GCTCTAGATGTACTAGGGTCAATGTGCTGG 3'（Xba I);
[0078] Riboswitch-R 5' GGAATTCCATATGGGACAAGAACCTCAAATCCACG 3'（Nde I)。
[0079] 20uL PCR 擴(kuò)增體系包括 2uL IOXPCR Buffer，1.6uL dNTPS，0.8uL 上游引物， 0.8uL 下游引物，IuL 基因組 DNA 模板，0.2uL rTaq DNA polymerase，13.6uL ddH20，PCR 程 序：
[0080] 預(yù)變性 94 °C 5min 變性 94°C 30s " ? 30循環(huán) 退火 50°C 3()s 延伸 n°c 3〇s
[0081] 最后在72°C延伸IOmin
[0082] PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5uL反應(yīng)液用2%瓊脂糖凝膠電泳（用標(biāo)準(zhǔn)的λ DNA/Hindlll 做marker)，鑒定PCR產(chǎn)物是否存在以及大小。4組反應(yīng)液平行，1組不加基因組DNA模板做 陰性對照。
[0083] 擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物用Xba I和Nde I (限制性內(nèi)切酶購至Takara)雙酶切，20uL酶 切PCR產(chǎn)物體系包括15uLPCR產(chǎn)物，2uL10X通緩沖液，IuL Xba I限制性內(nèi)切酶，IuL Nde I限制性內(nèi)切酶，IuLddH2O，在37°C的恒溫水浴條件下酶切4h，用PCR產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行 純化，取5uL純化產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳驗證分析。
[0084] 實施例3 :載體p519-SWITCH-GFP的構(gòu)建。
[0085] 將保存有熒光蛋白（GFP)表達(dá)質(zhì)粒p519ngfp的E.coli DH5a活化并擴(kuò)大培養(yǎng)， 取IOmL菌液用質(zhì)粒抽提試劑盒（生工公司）提取p519ngfp質(zhì)粒。20uL酶切p519ngfp質(zhì) 粒體系包括15uL p519ngfp質(zhì)粒，2uL10X通緩沖液，IuL Xba I限制性內(nèi)切酶，luL Nde I 限制性內(nèi)切酶，IuL CldH2O，在37°C的恒溫水浴條件下酶切4h，用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳， 割膠回收試劑盒回收雙酶切質(zhì)粒。
[0086] 雙酶切的核糖體開關(guān)目的基因與雙酶切的質(zhì)粒以3:1的比例，6uL雙酶切的核糖 體開關(guān)目的基因，雙酶切的質(zhì)粒2uL，IuL T4DNA Ligase Buffer，IuL T4DNA Ligase，在 16 °C的水浴條件下，連接過夜。
[0087] 實施例4 :重組載體p519-SWITCH-GFP的轉(zhuǎn)化
[0088] (1)取兩管IOOuL的大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，一管加入重組質(zhì)粒8uL，輕輕用 槍吹打混勻，另一管感受態(tài)細(xì)胞加 2uL的無菌水做陰性對照。
[0089] (2)冰浴 20min。
[0090] (3) 42°C保溫90s，熱擊后迅速放入冰中，冰浴3min。
[0091] (4)添加800uL的LB培養(yǎng)基，混勻后，37°C振蕩培養(yǎng)Ih (200r/min)，使細(xì)胞恢復(fù)正 常生長狀態(tài)，并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因（Kanamycin)。
[0092] (5)菌液 3000r/min 離心 5min。
[0093] (6)棄去800uL上清液，余下的IOOuL樣品用槍輕輕吹打，吸至含有千分之一 Kanamycin抗生素的LB固體培養(yǎng)基平板上，均勻涂布。
[0094] (7)將上述的平板倒置培養(yǎng)，37°C培養(yǎng)18h。
[0095] 實施例5 :重組載體p519-SWITCH-GFP的熒光蛋白（GFP)的表達(dá)。
[0096] 挑取平皿上的單菌落，用質(zhì)粒抽提試劑盒提取重組質(zhì)粒P519-SWITCH-GFP，將提取 的重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR，用2%的瓊脂糖凝膠電泳驗證，驗證正確后按照步驟1-9,進(jìn)行大腸桿 菌BL21(DE3)轉(zhuǎn)化表達(dá)。
[0097] 將取濃度為0mg/L、300mg/L的腺苷鈷胺各IOOuL加入到4支IOmL的LB液體培 養(yǎng)基中，使腺苷鈷胺的終濃度為〇mg/L、3mg/L，振蕩搖勻，其中2支試管中接入1% (IOOuL) 的含有重組載體p519ngfp的大腸桿菌BL21 (DE3)，另外2支試管中1 % (IOOuL)有重組載 體P519-SWITCH-GFP的大腸桿菌BL21 (DE3)，37°C振蕩培養(yǎng)7h(200r/min)，熒光顯微鏡觀 察大腸桿菌BL21(DE3)熒光蛋白（GFP)的表達(dá)量，試驗結(jié)果表明：加入腺苷鈷胺后，有重組 載體P519-SWITCH-GFP大腸桿菌BL21(DE3)的熒光蛋白（GFP)表達(dá)量明顯低于有原質(zhì)粒 p519ngfp大腸桿菌BL21(DE3)的熒光蛋白（GFP)表達(dá)量。
[0098] 應(yīng)當(dāng)理解的是，對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，可以根據(jù)上述說明加以改進(jìn)或變換， 而所有這些改進(jìn)和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1. 一種維生素 B12核糖體開關(guān)載體的構(gòu)建方法，其特征在于包括以下步驟： 1) 根據(jù)維生素 B12核糖體開關(guān)RNA的保守序列，在NCBI網(wǎng)站上與A /rewofe/zreicAiifiAe/mafliiy*菌株全基因組進(jìn)行同源性比對，發(fā)現(xiàn)該菌株基因組上213bp 的堿基序列與維生素 B12核糖體開關(guān)的保守序列同源性高達(dá)98%，從而確定維生素 B12核糖 體開關(guān)的目的基因序列， 維生素 B12核糖體開關(guān)目的基因喊基序列為： TGTACTAGGGTCAATGTGCTGGCCTCGGCCAGCGCGCGTCCGCAGCGAAGCCGGTGGGAATCCGGCACTGTC CCGCAACGGTGATGGGGCCCGGCCCCGAGTCCGGTCGACTGTGGACGTGTCCCCACATTGCCCCGGCGCAAGGTCAG CCCCACGAGCTGCCTGCGCGTGCACCGCGAAGGACGGCCCGTGGATTTGAGGTTCTTGTCCGAG ； 2) 以A /rewofe/zreicAii 菌株的基因組為模板，設(shè)計維生素 B12核糖體開 關(guān)目的基因序列的上、下游引物，在上游引物引入油酶切位點，下游引物引入酶切 位點，通過PCR擴(kuò)增獲得兩端帶有酶切位點的完整的維生素 B12核糖體開關(guān)目的基因序列， 獲得的目的基因序列用油3 I和I酶消解，目的基因片段兩端露出黏性末端，PCR產(chǎn)物 純化試劑盒回收目的基因序列； 3) 用油a I和雙酶切表達(dá)熒光蛋白的p519/w_f/7質(zhì)粒，1%瓊脂糖凝膠電泳回收雙 酶切質(zhì)粒； 4) 將步驟3)回收的雙酶切質(zhì)粒與維生素 B12核糖體開關(guān)目的基因序列進(jìn)行連接，得到 重組載體質(zhì)粒P519-SWITCH-GFP。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述維生素 B12核糖體開關(guān)載體的構(gòu)建方法，其特征在于所述的步 驟2)為： V) h)\P· freudenreichii 菌株中提取全基因組； 2)以該菌株的基因組為模板，設(shè)計維生素 B12核糖體開關(guān)目的基因序列的上、下游引 物，在上游引物引入油a I酶切位點，下游引物引入I酶切位點，通過PCR擴(kuò)增獲得兩端 帶有酶切位點的完整的維生素 B12核糖體開關(guān)目的基因序列； 3 )將PCR產(chǎn)物用I和I限制性內(nèi)切酶在37°C水浴條件下，雙酶切4個小時，用 PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收核糖體開關(guān)目的基因序列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述維生素 B12核糖體開關(guān)載體的構(gòu)建方法，其特征在于所述步驟 2)中維生素 B12核糖體開關(guān)目的基因序列的上、下游引物為： Riboswitch-F 5' GCTCTAGATGTACTAGGGTCAATGTGCTGG 3' (Jbal)； Riboswitch-R 5' GGAATTCCATATGGGACAAGAACCTCAAATCCACG 3' I)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述維生素 B12核糖體開關(guān)載體的構(gòu)建方法，其特征在于所述的步 驟4)為： 1) 把純化好的雙酶切維生素 B12核糖體開關(guān)目的基因序列與割膠回收的雙酶切質(zhì)粒在 16°C水浴的條件下，T4 DNA連接酶連接過夜； 2) 用CaClJi制備萬.co/i DH5a和萬.co/i BL21 (DE3)感受態(tài)，將重組的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 進(jìn)萬.co/i DH5 a感受態(tài)，在Kanamycin的LB固體培養(yǎng)基的平皿上涂布，篩選具有維生素 B12核糖體開關(guān)目的基因序列的重組質(zhì)粒； 3) 將拷貝有重組質(zhì)粒的凡cWi DH5ci進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，用質(zhì)粒抽提試劑盒提取重組質(zhì) 粒，轉(zhuǎn)化進(jìn)凡co/i BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。
【文檔編號】C12N15/65GK104212826SQ201410392294
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年8月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月11日
【發(fā)明者】朱炫, 王小豐, 顧青 申請人:浙江工商大學(xué)