一種病毒rna檢測引物的設(shè)計(jì)方法及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種病毒RNA檢測引物的設(shè)計(jì)方法及試劑盒，尤指一種新型的病毒RNA小片段引物設(shè)計(jì)方法和以此方法設(shè)計(jì)的HCV?RNA檢測試劑盒，屬于臨床檢驗(yàn)學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明通過對HCV?RNA的5’–UTR區(qū)不同位置的引物設(shè)計(jì)，發(fā)現(xiàn)在HCV?RNA降解的患者血清中，目的片段為小片段的檢測效率明顯高于長片段；并用上述最小片段的引物建立了相應(yīng)的檢測試劑盒。本發(fā)明的特點(diǎn)是：本發(fā)明所描述的小片段引物設(shè)計(jì)方法提供了一種新型的、涉及二級結(jié)構(gòu)的、可靠的小片段引物設(shè)計(jì)原則；尤其適用于RNA降解標(biāo)本的檢測；可以推廣到其他病毒RNA的檢測中；可降低對標(biāo)本采集、運(yùn)輸、保存中的要求，提高檢測效率。
【專利說明】-種病毒RNA檢測引物的設(shè)計(jì)方法及試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種新型的病毒RNA小片段引物設(shè)計(jì)方法和以此方法設(shè)計(jì)的HCV RNA 檢測試劑盒，屬于臨床檢驗(yàn)學(xué)領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 病毒RNA定量檢測是病毒感染輔助診斷和療效觀察的重要依據(jù)。然而，諸多研究 證實(shí)：病毒RNA在標(biāo)本采集、運(yùn)輸、保存、檢測前處理等過程中存在降解現(xiàn)象，若RNA降解， 以目前的試劑盒來看，檢測效率將普遍降低，進(jìn)而影響診斷治療。這是由于：以HCV為例， 目前國內(nèi)外檢測HCV RNA的商品化試劑盒通常是擴(kuò)增5' -UTR的150-250bp左右的片段。 5'-UTR是HCV RNA的最保守序列，長341nt，其保守性使其成為引物設(shè)計(jì)最集中的區(qū)域。然 而，商品化試劑盒通常忽略了 5' -UTR的二級結(jié)構(gòu)降解時(shí)對檢測的影響。
[0003] HCV RNA的5' -UTR大部分序列自身互補(bǔ)，因而形成了充滿了"莖環(huán)"的二級結(jié)構(gòu)。 ①該結(jié)構(gòu)存在熱不穩(wěn)定性，運(yùn)輸和保存中環(huán)境溫度的變化會導(dǎo)致5' -UTR二級結(jié)構(gòu)打開，使 得靠近其5'端的序列容易被外切酶降解。目前商品化試劑盒檢測片段普遍較長，不可避免 地靠近5'端而易被外切酶降解，使得檢測效率降低。
[0004] ②該結(jié)構(gòu)存在酶不穩(wěn)定性，在"環(huán)"的區(qū)域常常比"莖"區(qū)更容易被多種內(nèi)切酶降 解，使RNA 5'-UTR被酶降解成長短不一的小片段。若引物剛好設(shè)計(jì)在"環(huán)"上充滿酶切位 點(diǎn)的區(qū)域，則當(dāng)RNA被內(nèi)切酶降解，引物無法和模板結(jié)合，檢測效率也將降低。目前商品化 試劑盒的檢測片段普遍較長，不可避免地含蓋諸多"莖"區(qū)而易被內(nèi)切酶降解，使得檢測效 率降低。
[0005] 因此，對于RNA降解標(biāo)本，目前商品化試劑盒的檢測效率都會有不同程度的降低， 檢測結(jié)果可能會影響用藥和療效觀察，或者造成HCV RNA陽性獻(xiàn)血者血液漏檢。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的第一個(gè)技術(shù)問題是建立一種新型的病毒RNA檢測的小片段引物 設(shè)計(jì)方法。
[0007] 本發(fā)明要解決的第二個(gè)技術(shù)問題是以HCV為例，用上述方法設(shè)計(jì)引物，建立HCV RNA小片段檢測試劑盒。
[0008] 本發(fā)明要解決的第三個(gè)技術(shù)問題是提供上述試劑盒的應(yīng)用，并和其他試劑盒進(jìn)行 檢測性能比較。
[0009] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0010] 一種病毒RNA檢測引物的設(shè)計(jì)方法，由以下原則組成：
[0011] (1)選擇病毒基因組RNA最保守區(qū)域，通常為5' -UTR區(qū)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)；
[0012] (2)將該病毒各型別在5' -UTR區(qū)的共同序列作為引物設(shè)計(jì)的選擇區(qū)域，并將共 同序列在二級結(jié)構(gòu)中定位；
[0013] (3)共同序列中位于5' -UTR二級結(jié)構(gòu)的"莖"上的區(qū)域作為引物設(shè)計(jì)的首選區(qū)， 盡量避開"環(huán)"結(jié)構(gòu)；
[0014] (4)正反引物設(shè)計(jì)應(yīng)盡量靠近5' - UTR的3'端；
[0015] (5)將最靠近5' - UTR的3'端，位于"莖"上的18-21nt的序列選為forward引 物互補(bǔ)區(qū)；
[0016] (6)將第二靠近5' -UTR的3'端，位于"莖"上的18-21nt的序列選為probe探 針的互補(bǔ)區(qū)；
[0017] (7)將第三靠近5' - UTR的3'端，位于"莖"上的18-2lnt的序列選為reverse弓| 物；
[0018] (8) forward引物、probe探針、reverse引物之間不要有重合區(qū)域；
[0019] (9)擴(kuò)增的目的片段跨越的"環(huán)"越少越好，即目的片段越小越好。
[0020] 所述⑴的5' -UTR的二級結(jié)構(gòu)為各RNA病毒專屬的、國際公認(rèn)的二級結(jié)構(gòu)。
[0021] 所述⑵共同序列是該病毒各亞型的RNA序列通過clustalX多重序列比對程序 比對所得的共同序列。
[0022] -組檢測HCV病毒RNA的核苷酸序列，包括引物序列、探針序列和陽性序列，其中 引物序列為序列表SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所不的核昔酸序列，探針序列為序列表SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列，陽性序列為序列表SEQ ID No. 4所示的核苷酸序列。
[0023] 本發(fā)明通過對HCV RNA的5' - UTR區(qū)不同位置的引物設(shè)計(jì)，發(fā)現(xiàn)在HCV RNA降解 的患者血清中，目的片段為小片段的檢測效率明顯高于長片段；并用上述最小片段的引物 建立了相應(yīng)的檢測試劑盒。
[0024] -種HCV病毒RNA檢測試劑盒，由以下檢測試劑組成：
[0025] (l)HCV RNA 提取試劑：
[0026] 1)裂解液：含異硫氰酸胍的溶液；
[0027] 2) RNase inhibitor :含有 RNase 抑制劑的溶液；
[0028] 3)去蛋白液：含有異丙醇的溶液；
[0029] 4)漂洗液：含有75%的乙醇的溶液；
[0030] 5)洗脫液：RNase free water ;
[0031] 6) RNA 吸附柱；
[0032] (2)0neSt印RT-PCR熒光檢測試劑：
[0033] 1)PCR 反應(yīng)液（PCR buffer);
[0034] 2) dNTP 混合液（dNTP mix);
[0035] 3)引物 A(primer forward) :5, -GCTGCACGGTCTACGAGAC-3,（SEQ ID No. 1);
[0036] 4)引物 B(primer reverse) :5, -GCCTTGTGGTACTGCCTGATA-3'（SEQ ID No. 2);
[0037] 5)熒光探針（probe) :5, -CCGGGGCACTCGCAAGCACCCT-3'（SEQ ID No. 3);
[0038] 6)酶混合物（Enzyme Mix):含有Taq酶和逆轉(zhuǎn)錄酶；
[0039] (3)對照品
[0040] 1)陰性對照：HCV陰性的健康人血清；
[0041] 2)強(qiáng)陽性對照：含有3 X 107的HCV5 ' -UTR的非傳染性體外轉(zhuǎn)錄RNA (SEQ ID No. 4)；
[0042] 3)弱陽性對照：含有3 X 103的HCV5 ' -UTR的非傳染性體外轉(zhuǎn)錄RNA (SEQ ID No. 4) 〇
[0043] 陽性對照（SEQ ID No. 4):
[0044] 5 ' -AGGCCUU⑶GGUACUGCCUGAUAGGGUGCUUGCGA⑶GCCCCGGGAG⑶CUCGUAGACCGUGCAC C-3 ,
[0045] 所述（2)中引物A為5 ' -GCTGCACGGTCTACGAGAC-3 '，是根據(jù)本發(fā)明的引物設(shè)計(jì)原 則選出的最靠近5' -UTR的3'端區(qū)域的互補(bǔ)序列。
[0046] 所述（2)中引物B為5 ' -GCCTTGTGGTACTGCCTGATA-3 '，是根據(jù)本發(fā)明的引物設(shè)計(jì) 原則選出的第三靠近5' -UTR的3'端的序列。
[0047] 所述（2)中熒光探針（probe) : 5 ' -CCGGGGCACTCGCAAGCACCCT-3 '，是根據(jù)本發(fā)明的 引物設(shè)計(jì)原則選出的第二靠近5' -UTR的3'端區(qū)域的互補(bǔ)序列。
[0048] 所述的一種病毒RNA檢測引物的設(shè)計(jì)方法在HCV RNA發(fā)生降解的血清檢測中的應(yīng) 用、在臨床上檢測HCV感染患者血清中的應(yīng)用、在獻(xiàn)血者血液篩查中的應(yīng)用、或在檢測其他 RNA病毒中的應(yīng)用。
[0049] 所述的一組檢測HCV病毒RNA的核苷酸序列或一種HCV病毒RNA檢測試劑盒在 HCV RNA發(fā)生降解的血清檢測中的應(yīng)用、在臨床上檢測HCV感染患者血清中的應(yīng)用、在獻(xiàn)血 者血液篩查中的應(yīng)用、或在檢測其他RNA病毒中的應(yīng)用。
[0050] 所述的HCV RNA小片段檢測試劑盒的應(yīng)用。例如：
[0051] (l)HCV RNA小片段檢測試劑盒在檢測臨床HCV感染者血清RNA水平中的應(yīng)用，可 以為臨床治療和用藥提供輔助診斷依據(jù)；
[0052] (2) HCV RNA小片段檢測試劑盒在獻(xiàn)血者的血液篩查中的應(yīng)用，可以發(fā)現(xiàn)HCV陽性 的血液或處于HCV感染窗口期的獻(xiàn)血者血液，保護(hù)輸血的安全性；
[0053] (3) HCV RNA小片段檢測試劑盒在檢測HCV RNA發(fā)生降解的標(biāo)本中的應(yīng)用。本試劑 盒可以檢測那些由于采集、運(yùn)輸、保存不當(dāng)發(fā)生降解的RNA標(biāo)本。用本試劑盒檢測HCV RNA 降解前后標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)：在降解前，長片段和小片段擴(kuò)增的Ct值相近，即檢測RNA含量差距不 大；在降解后，長片段擴(kuò)增的Ct差值比小片段擴(kuò)增的Ct差值明顯增大，即RNA含量用長片 段方法時(shí)檢測效率下降，而用本發(fā)明中的小片段檢測方法可以最大限度地還原降解標(biāo)本的 原始模板量，進(jìn)而提高檢測效率。
[0054] (4)所述的病毒RNA檢測的小片段引物設(shè)計(jì)方法在其他病毒RNA檢測中的應(yīng)用。 本發(fā)明得到了一整套新的RNA引物設(shè)計(jì)原則，考慮到了二級結(jié)構(gòu)和片段長短的因素，較大 程度地克服了由于RNA降解所導(dǎo)致的檢測效率降低，可以推廣到其他病毒RNA檢測中。
[0055] 本發(fā)明試劑盒的簡要檢測程序?yàn)椋?br> [0056] (1)提取 HCV RNA ;
[0057] (2)配制RT-PCR主反應(yīng)混合液；
[0058] (3)分別加入forward引物與reverse引物；
[0059] (4)加入Taqman探針作為實(shí)時(shí)熒光PCR的監(jiān)測工具；
[0060] (5)設(shè)定程序并擴(kuò)增；
[0061] (6)得到結(jié)果和結(jié)果分析。
[0062] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明提供了一種病毒RNA小片段的引物設(shè)計(jì)方法以及HCV RNA 小片段檢測試劑盒，①可以最大限度地還原病毒RNA降解標(biāo)本的原始病毒載量，提高檢出 率，防止血液篩查的漏檢；②可以不用嚴(yán)格要求標(biāo)本的采集、運(yùn)輸、保存條件；③可以推廣 到其他病毒的引物設(shè)計(jì)中，使病毒RNA降解不再較大影響檢測結(jié)果；④靈敏度高、使用方 便、操作簡單、特異性強(qiáng)。
[0063] 下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明進(jìn)行說明，以使公眾更好地理解本發(fā)明內(nèi) 容及應(yīng)用，并不以任何方式造成對本發(fā)明的限定。凡依照本發(fā)明公開內(nèi)容所做的任何等同 替換，均屬于本發(fā)明保護(hù)范圍。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0064] 圖1 :用本發(fā)明的小片段方法來設(shè)計(jì)HCV RNA引物，在HCV RNA5'-UTR二級"莖環(huán)" 結(jié)構(gòu)上，設(shè)計(jì)了1?1(1'6￥6^61)、？(；1；'〇^31(1)引物和一個(gè)探針？化1'(^6) ;為驗(yàn)證本方法，另設(shè) 計(jì)了 R2、R3、R4(reverse2、3、4)引物作對比。
[0065] 圖2 :HCV RNA降解前后，不同長度目的片段檢測HCV RNA病毒含量的Ct差值。
[0066] 圖3 :本發(fā)明的小片段試劑盒與科華、羅氏試劑盒在RNA降解前后的臨床標(biāo)本中的 檢測性能比較。

【具體實(shí)施方式】
[0067] 以下為實(shí)施例中涉及的主要材料和試劑：
[0068] 病毒裂解液，國藥集團(tuán)，中國
[0069] RNase inhibitor，Promega，美國
[0070] 去蛋白液，國藥集團(tuán)，中國
[0071] 漂洗液，國藥集團(tuán)，中國
[0072] RNA吸附柱，天根生化，中國
[0073] OneStep RT-PCR Buffer，Qiagen，德國
[0074] dNTP mix，Qiagen，德國
[0075] Primer forward, invirogen,美國
[0076] Primer reverse, invirogen,美國
[0077] Probe，invirogen，美國
[0078] RNase free water，康為世紀(jì)，中國
[0079] OneStep RT-PCR Enzyme Mix，科華生物，中國
[0080] Template RNA，從血清標(biāo)本中提取的HCV RNA
[0081] 引物、探針和陽性對照均委托英濰捷基上海（貿(mào)易）有限公司合成，探針標(biāo)記：5' 熒光基團(tuán)是FAM標(biāo)記，3 '淬滅基團(tuán)是MGB標(biāo)記。
[0082] 實(shí)施例1 :檢測HCV RNA小片段的試劑盒
[0083] 一 ·試劑盒組成
[0084] l.HCV RNA 提取試劑：
[0085] 1)病毒裂解液：含異硫氰酸胍的溶液；
[0086] 2) RNase inhibitor :含有 RNase 抑制劑的溶液；
[0087] 3)去蛋白液：含有異丙醇的溶液；
[0088] 4)漂洗液：含有75%的乙醇的溶液（無水乙醇用純水1:3稀釋）；
[0089] 5)洗脫液：RNase free water ;
[0090] 6) RNA吸附柱（硅基質(zhì)膜）。
[0091] 2. OneSt印RT-PCR熒光檢測試劑：
[0092] 1)PCR 反應(yīng)液（PCR buffer) :Qiagen，德國；
[0093] 2) dNTP 混合液（dNTP mix) :Qiagen，德國；
[0094] 3)引物 A(primer forward) :5, -GCTGCACGGTCTACGAGAC-3，，自主設(shè)計(jì)；（SEQ ID No. 1)使用濃度ΙΟμΜ ;
[0095] 4)引物 B (primer reverse) :5，-GCCTTGTGGTACTGCCTGATA-3，，自主設(shè)計(jì)；（SEQ ID No. 2)使用濃度ΙΟμΜ ;
[0096] 5)熒光探針（probe) :5' -CCGGGGCACTCGCAAGCACCCT-3'，自主設(shè)計(jì)；（SEQ ID No. 3)使用濃度10 μ Μ ;探針標(biāo)記：5'熒光基團(tuán)是FAM標(biāo)記，3'淬滅基團(tuán)是MGB標(biāo)記；
[0097] 酶混合物（Enzyme Mix):含有Taq酶和逆轉(zhuǎn)錄酶，來源為QIAGEN：))': 〇neStep RT-PCR Kit ；
[0098] 3.對照品
[0099] 1)陰性對照：HCV陰性的健康人血清；
[0100] 2)強(qiáng)陽性對照：含有3X 107的HCV5' -UTR的非傳染性體外轉(zhuǎn)錄RNA ; (SEQ ID No. 4)
[0101] 3)弱陽性對照：含有3X103的HCV5' -UTR的非傳染性體外轉(zhuǎn)錄RNA，（SEQ ID No. 4) 〇
[0102] 二.人血清HCV RNA檢測條件及方法：
[0103] 1.HCVRNA 的提取
[0104] 1)將血清與裂解液等體積混勻；
[0105] 2)加入 RNase inhibitor,混勻后 70°C加熱 10min ;
[0106] 3)再加入等體積無水乙醇，震蕩混勻；
[0107] 4)將3)中的混合液全部轉(zhuǎn)入RNA吸附柱，離心棄液；
[0108] 5)吸附柱中加入去蛋白液，離心棄液；
[0109] 6)吸附柱中加入漂洗液，離心棄液；
[0110] 7)加入RNase free water,靜置lmin，離心，收集液為模板RNA。
[0111] 2. One St印 RT-PCR 擴(kuò)增體系
[0112] 表 1
[0113]

【權(quán)利要求】
1. 一種病毒RNA檢測引物的設(shè)計(jì)方法，其特征在于由以下原則組成： (1) 選擇病毒基因組RNA最保守區(qū)域，通常為5' -UTR區(qū)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)； (2) 將該病毒各型別在5' -UTR區(qū)的共同序列作為引物設(shè)計(jì)的選擇區(qū)域，并將共同序 列在二級結(jié)構(gòu)中定位； (3) 共同序列中位于5' -UTR二級結(jié)構(gòu)的"莖"上的區(qū)域作為引物設(shè)計(jì)的首選區(qū)，盡量 避開"環(huán)"結(jié)構(gòu)； (4) 正反引物設(shè)計(jì)應(yīng)盡量靠近5' - UTR的3'端； (5) 將最靠近5' -UTR的3'端，位于"莖"上的18-21nt的序列選為forward引物互 補(bǔ)區(qū)； (6) 將第二靠近5' - UTR的3'端，位于"莖"上的18-21nt的序列選為probe探針的 互補(bǔ)區(qū)； ⑵將第三靠近5' - UTR的3'端，位于"莖"上的18-21nt的序列選為reverse引物； (8) forward引物、probe探針、reverse引物之間不要有重合區(qū)域； (9) 擴(kuò)增的目的片段跨越的"環(huán)"越少越好，即目的片段越小越好。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種病毒RNA檢測引物的設(shè)計(jì)方法，其特征在于：所述（1)的 5' -UTR的二級結(jié)構(gòu)為各RNA病毒專屬的、國際公認(rèn)的二級結(jié)構(gòu)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種病毒RNA檢測引物的設(shè)計(jì)方法，其特征在于：所述⑵共 同序列是該病毒各亞型的RNA序列通過clustalX多重序列比對程序比對所得的共同序列。
4. 一組檢測HCV病毒RNA的核苷酸序列，其特征在于：包括引物序列、探針序列和陽性 序列，其中引物序列為序列表SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列，探針序列為 序列表SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列，陽性序列為序列表SEQ ID No. 4所示的核苷酸序 列。
5. -種HCV病毒RNA檢測試劑盒，其特征在于由以下檢測試劑組成： (1) HCV RNA提取試劑： 1) 裂解液：含異硫氰酸胍的溶液； 2. RNase inhibitor :含有RNase抑制劑的溶液； 3) 去蛋白液：含有異丙醇的溶液； 4) 漂洗液：含有75%的乙醇的溶液； 5) 洗脫液：RNase free water ; 6. RNA吸附柱； (2) 0neSt印RT-PCR熒光檢測試劑： 1. PCR 反應(yīng)液（PCR buffer); 2. dNTP 混合液（dNTP mix); 3) 引物 A(primer forward) :5, -GCTGCACGGTCTACGAGAC-3，（SEQ ID No. 1); 4) 引物 B(primer reverse) :5, -GCCTTGTGGTACTGCCTGATA-3'（SEQ ID No.2); 5) 熒光探針（probe):5'-CCGGGGCACTCGCAAGCACCCT-3'（SEQIDNo·3)，探針標(biāo)記 ：5' 熒光基團(tuán)是FAM標(biāo)記，3'淬滅基團(tuán)是MGB標(biāo)記； 6) 酶混合物（Enzyme Mix):含有Taq酶和逆轉(zhuǎn)錄酶； (3) 對照品 1) 陰性對照：HCV陰性的健康人血清； 2) 強(qiáng)陽性對照：含有3X 107的HCV5' -UTR的非傳染性體外轉(zhuǎn)錄RNA(SEQ ID No. 4); 3) 弱陽性對照：含有3X 103的HCV5' -UTR的非傳染性體外轉(zhuǎn)錄RNA(SEQ ID No. 4)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種HCV病毒RNA檢測試劑盒，其特征在于：所述（2)中引物 A為5' -GCTGCACGGTCTACGAGAC-3'，是根據(jù)本發(fā)明的引物設(shè)計(jì)原則選出的最靠近5' - UTR 的3'端區(qū)域的互補(bǔ)序列。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種HCV病毒RNA檢測試劑盒，其特征在于：所述（2)中引 物B為5 ' -GCCTTGTGGTACTGCCTGATA-3 '，是根據(jù)本發(fā)明的引物設(shè)計(jì)原則選出的第三靠近 5' -UTR的3'端的序列。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種HCV病毒RNA檢測試劑盒，其特征在于：所述（2)中熒 光探針（probe) :5' -CCGGGGCACTCGCAAGCACCCT-3'，是根據(jù)本發(fā)明的引物設(shè)計(jì)原則選出的 第二靠近5' -UTR的3'端區(qū)域的互補(bǔ)序列。
9. 權(quán)利要求1至4中任何一項(xiàng)所述的一種病毒RNA檢測引物的設(shè)計(jì)方法在HCV RNA發(fā) 生降解的血清檢測中的應(yīng)用、在臨床上檢測HCV感染患者血清中的應(yīng)用、在獻(xiàn)血者血液篩 查中的應(yīng)用、或在檢測其他RNA病毒中的應(yīng)用。
10. 權(quán)利要求4至8中任何一項(xiàng)所述的一組檢測HCV病毒RNA的核苷酸序列或一種HCV 病毒RNA檢測試劑盒在HCV RNA發(fā)生降解的血清檢測中的應(yīng)用、在臨床上檢測HCV感染患 者血清中的應(yīng)用、在獻(xiàn)血者血液篩查中的應(yīng)用、或在檢測其他RNA病毒中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12Q1/68GK104120194SQ201410390106
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2014年8月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月8日
【發(fā)明者】李金明, 陳利達(dá), 李文麗 申請人:衛(wèi)生部北京醫(yī)院