植物脅迫反應性myc類轉錄因子及其編碼基因和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了植物脅迫反應性MYC類轉錄因子及其編碼基因和應用。本發(fā)明首先公開了從棉花中分離的MYC類轉錄因子編碼基因，其多核苷酸序列為SEQ?ID?No.4所示，其編碼的氨基酸序列為SEQ?ID?No.5所示。本發(fā)明還公開了含有所述轉錄因子編碼基因的重組表達載體和重組宿主細胞。通過擬南芥轉基因功能分析實驗證明，在植物中過表達從棉花中分離的棉花MYC類轉錄因子編碼基因能夠有效提高植物對高鹽或干旱等非生物逆境脅迫的抗性。本發(fā)明植物脅迫反應性MYC類轉錄因子及其編碼基因在提高植物對逆境脅迫抗性以及培育耐逆境脅迫的轉基因植物新品種等方面有重要的應用前景。
【專利說明】植物脅迫反應性MYC類轉錄因子及其編碼基因和應用

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及轉錄因子，尤其涉及從棉花中分離的MYC類轉錄因子編碼基因，本發(fā)明還涉及含有所述棉花MYC類轉錄因子編碼基因的重組表達載體和重組宿主細胞，本發(fā)明進一步涉及棉花MYC類轉錄因子及其編碼基因在調控植物對逆境脅迫抗性以及培育耐逆境脅迫的轉基因植物新品種中的應用，屬于棉花MYC類轉錄因子及其應用【技術領域】。

【背景技術】
[0002]植物中髓細胞組織增生蛋白(Myelocytomatosis proteins, MYCs)即MYC類轉錄因子，具有多種調節(jié)功能，并廣泛存在于動植物中。在已經發(fā)現(xiàn)的MYC類轉錄因子中，MYC2是研究最為深入的一個，目前在模式植物擬南芥中發(fā)現(xiàn)MYC2轉錄因子通過形成CO I I/JAZs/MYC2復合物發(fā)揮調控作用，參與JA、ABA等激素信號轉導過程。如擬南芥的AtMYC2轉錄因子，在逆境下表達增強。在干旱脅迫下，AtMYC2蛋白也作為ABA誘導的轉錄激活子發(fā)?車功能。
[0003]干旱和鹽潰是諸多非生物逆境中對作物危害最為嚴重的自然災害，嚴重影響作物的產量和種植面積。據(jù)不完全統(tǒng)計，全世界的干旱地區(qū)占陸地總面積的三分之一，且有逐年增加的趨勢。土壤鹽堿化和次生鹽堿化問題在世界范圍內廣泛存在，特別是干旱、半干旱地區(qū)，問題更為嚴重。
[0004]棉花是最耐鹽的農作物之一，其耐鹽性因品種、生育階段、器官以及土壤鹽分種類等不同而差異較大。因此 ，從棉花中克隆MYC類轉錄因子編碼基因并將其應用于調控農作物的抗逆境脅迫以及培育耐逆境脅迫的轉基因植物新品種，對植物抗逆性能的提高將具有重要的意義。


【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的目的之一是提供一類植物脅迫反應性MYC類轉錄因子及其編碼基因；
[0006]本發(fā)明的目的之二是提供含有所述MYC類轉錄因子編碼基因的重組表達載體以及含有該重組表達載體的重組宿主細胞；
[0007]本發(fā)明的目的之三是將所述的棉花MYC類轉錄因子及其編碼基因應用于調控植物對逆境脅迫的抗性以及培育耐逆境脅迫的轉基因植物新品種。
[0008]本發(fā)明的上述目的是通過以下技術方案來實現(xiàn)的:
[0009]本發(fā)明從棉花(Gossypium hirsutum L.)分離了 GhMYC4轉錄因子編碼基因,其多核苷酸為(a)、(b)、(c)、(d)或(e)所示:
[0010](a)、SEQ ID N0.4所示的多核苷酸；或
[0011](b)、編碼SEQ ID N0.5所示氨基酸的多核苷酸；或
[0012](C)、與SEQ ID N0.4的互補序列在嚴謹雜交條件能夠進行雜交的多核苷酸，該多核苷酸所編碼蛋白質仍具有GhMYC4轉錄因子功能；或
[0013](d)、與SEQ ID N0.4所示的多核苷酸至少有90%或以上同源性的多核苷酸，優(yōu)選的，與SEQ ID N0.4所示的多核苷酸至少有95%或以上同源性的多核苷酸，最優(yōu)選的，與SEQID N0.4所示的多核苷酸至少有98%或以上同源性的多核苷酸；或
[0014](e)、在SEQ ID N0.4所示的多核苷酸的基礎上進行一個或多個堿基的缺失、取代或插入的多核苷酸變體，且該多核苷酸變體所編碼的蛋白仍具有GhMYC4轉錄因子的功能或活性。
[0015]本發(fā)明還公開了由所述轉錄因子基因編碼的GhMYC4轉錄因子，其氨基酸為(a)或
(b)所示:
[0016](a)、SEQ ID N0.5 所示的氨基酸；
[0017](b) jfSEQ ID N0.5所示的氨基酸通過一個或多個氨基酸殘基的替換、缺失或/和插入而衍生得到的仍具有GhMYC4轉錄因子功能或活性的蛋白變體。
[0018]本發(fā)明所述的蛋白變體可由遺傳多態(tài)性或人為操作產生，這些操作方法通常為本領域所了解。例如，可通過DNA的突變來制備GhMYC4轉錄因子的氨基酸序列變體或片段，其中用于誘變或改變多核苷酸的方法為本領域所習知。其中，保守的取代是將一種氨基酸殘基替換成具有相似性質的另一種氨基酸。本發(fā)明所述的GhMYC4轉錄因子及其編碼基因包括天然存在的序列和變體兩種形式。“變體”意指基本相似的序列，對于多核苷酸，變體包含天然多核苷酸中一個或多個位點處一個或多個核苷酸的缺失、插入或/和替換。對于多核苷酸，保守的變體包括由于遺傳密碼的簡并性而不改變編碼的氨基酸序列的那些變體。諸如此類天然存在的變體可通過現(xiàn)有的分子生物學技術來鑒定。變體多核苷酸還包括合成來源的多核苷酸，例如采用定點誘變所得到的仍編碼SEQ ID N0.5所示的氨基酸的多核苷酸變體，或者是通過重組的方法(例如DNA改組)。本領域技術人員可通過以下分子生物技術手段來篩選或評價變體多核苷酸所編碼蛋白的功能或活性=DNA結合活性、蛋白之間的相互作用，瞬時研究中基因表達的激活情況或轉基因植物中表達的效應等。
[0019]本發(fā)明還公開了含有所述的GhMYC4轉錄因子編碼基因的重組表達載體；所述的重組表達載體是重組植物表達載體。
[0020]本發(fā)明還公開了含有所述的重組表達載體的重組宿主細胞。
[0021]將所述棉花GhMYC4轉錄因子編碼基因可操作的與表達調控元件相連接，得到可以在植物中表達該編碼基因的重組植物表達載體；該重組植物表達載體可以由5'端非編碼區(qū)，SEQ ID N0.4所示的核苷酸和3'非編碼區(qū)組成；其中，所述的5'端非編碼區(qū)可以包括啟動子序列、增強子序列或/和翻譯增強序列；所述的啟動子可以是組成性啟動子、誘導型啟動子、組織或器官特異性啟動子；所述的3'非編碼區(qū)可以包含終止子序列、mRNA切割序列等。合適的終止子序列可取自根癌農桿菌的T1-質粒，例如章魚堿合成酶和胭脂堿合成酶終止區(qū)。
[0022]另外，本領域技術人員可以將SEQ ID N0.4所示的核苷酸進行優(yōu)化以增強在植物中的表達效率。例如，可采用目標植物的偏愛密碼子進行優(yōu)化來合成多核苷酸以增強在目標植物中的表達效率。
[0023]所述重組植物表達載體還可含有用于選擇轉化細胞的選擇性標記基因。選擇性標記基因用于選擇經轉化的細胞或組織。標記基因包括:編碼抗生素抗性的基因以及賦予除草化合物抗性的基因等。此外，所述的標記基因還包括表型標記，例如半乳糖苷酶和熒光蛋白等。
[0024]本發(fā)明還涉及將所述的棉花GhMYC4轉錄因子編碼基因引入到植物中以提高植物對逆境脅迫的抗性。
[0025]本發(fā)明進一步公開了所述的棉花GhMYC4轉錄因子編碼基因在提高植物對逆境脅迫抗性中的應用，包括以下步驟:(I)構建含有所述棉花GhMYC4轉錄因子編碼基因的重組植物表達載體；(2)將所構建的重組植物表達載體轉化到植物或植物細胞中；(3)培育篩選得到對逆境脅迫抗性提高的轉基因植物新品種。
[0026]本發(fā)明進一步公開了一種培育耐逆境脅迫的轉基因植物新品種的方法，包括以下步驟:(I)構建含有所述棉花GhMYC4轉錄因子編碼基因的重組植物表達載體；(2)將所構建的重組植物表達載體轉化到植物或植物細胞中；(3)培育篩選得到對逆境脅迫抗性提高的轉基因植物新品種。
[0027]其中，所述的逆境脅迫包括高鹽或干旱等各種非生物逆境脅迫。
[0028]轉化方案以及將所述多核苷酸或多肽引入植物的方案可視用于轉化的植物(單子葉植物或雙子葉植物)或植物細胞的類型而變化。將所述多核苷酸或多肽引入植物細胞的合適方法包括:顯微注射、電穿孔、農桿菌介導的轉化、直接基因轉移以及高速彈道轟擊等。在特定的實施方案中，可利用多種瞬時轉化法將本發(fā)明的GhMYC4轉錄因子基因提供給植物。在其它實施方案中，本發(fā)明的GhMYC4轉錄因子基因可通過將植物與病毒或病毒核酸接觸來引入到植物中，通常，這樣的方法涉及將本發(fā)明的GhMYC4轉錄因子基因構建體引入病毒DNA或RNA分子中。
[0029]利用常規(guī)方法可使已轉化的細胞再生穩(wěn)定轉化植株(McCormick et al.PlantCell Reports.1986.5:81-84)。本發(fā)明可用于轉化任何植物種類,包括但不限于:單子葉植物或雙子葉植物。更優(yōu)選的，所述的目標植物包括農作物、蔬菜或觀賞植物、果樹等，例如，可以是玉米、水稻、高粱、小麥、大豆、馬鈴薯、大麥、番茄、菜豆、花生或甘蔗等。
[0030]為了分析本發(fā)明從棉花(Gossypium hirsutum L.)分離的GhMYC4轉錄因子的功能，本發(fā)明用Gateway方法構建含有GhMYC4基因(核苷酸為SEQ ID N0.4所示)的植物表達載體，花序浸染法轉化擬南芥，獲得Tl代種子；通過擬南芥種子抗性篩選及PCR鑒定，獲得轉基因擬南芥。同時分別構建含有GhMYCl (核苷酸為SEQ ID N0.1所示)、GhMYC2 (核苷酸為SEQ ID N0.2所示)和GhMYC3 (核苷酸為SEQ ID N0.3所示)基因的植物表達載體，轉化擬南芥，獲得轉基因擬南芥。
[0031]對轉基因擬南芥進行抗旱耐鹽分析。表型分析結果表明，轉GhMYC4基因的擬南芥在NaCl澆淋10天后，無葉片發(fā)黃現(xiàn)象，開花與結實情況都好于NK對照組，表明轉GhMYC4基因的擬南芥對鹽脅迫有良好抗性；干旱處理后，轉GhMYC4基因的擬南芥植株生長正常但葉片小，植株生長較高，有一定的抗旱效果；生理指標分析表明，NaCl處理后，轉GhMYC4基因的擬南芥葉綠素含量與NK基本持平，在lmg/g-1.4mg/g之間波動，屬正常水平，說明轉GhMYC4基因的擬南芥的光合作用正常；轉GhMYC4基因擬南芥的丙二醇含量明顯低于對照，表明轉GhMYC4基因的擬南芥的抗鹽能力較強；干旱處理后，轉GhMYC4基因的擬南芥葉綠素水平基本保持在1.21mg/g左右，葉綠素水平正常，說明轉GhMYC4基因植株的光合作用正常；RGhMYC4基因的擬南芥丙二醇含量較低，在0.0Uymol/g附近，證明抗旱效果明顯；轉GhMYC4基因擬南芥的可溶性糖平均含量高于對照組，說明轉GhMYC4基因植株通過升高可溶性糖含量來提高其抗旱水平。
[0032]通過擬南芥轉化功能實驗證明，在植物中過表達棉花GhMYC4轉錄因子編碼基因能夠有效提高植物對高鹽或干旱等非生物逆境脅迫的抗性。因此，本發(fā)明克隆的棉花GhMYC4轉錄因子及其編碼基因在調控植物對逆境脅迫抗性及培育耐逆境脅迫的轉基因植物新品種等方面有廣泛的應用前景。
[0033]本發(fā)明所涉及到的術語定義
[0034]除非另外定義，否則本文所用的所有技術及科學術語都具有與本發(fā)明所屬領域的普通技術人員通常所了解相同的含義。
[0035]術語“轉錄因子”意指能夠與真核生物基因啟動子區(qū)域中順式作用元件特異性結合，從而激活或抑制下游基因在特定時間和空間轉錄與表達的一類DNA結合蛋白。
[0036]術語“多核苷酸”或“核苷酸”意指單股或雙股形式的脫氧核糖核苷酸、脫氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否則所述術語涵蓋含有天然核苷酸的已知類似物的核酸，所述類似物具有類似于參考核酸的結合特性并以類似于天然產生的核苷酸的方式進行代謝。除非另外特定限制，否則所述術語也意指寡核苷酸類似物，其包括PNA(肽核酸)、在反義技術中所用的DNA類似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等)。除非另外指定，否則特定核酸序列也隱含地涵蓋其保守修飾的變異體(包括(但不限于)簡并密碼子取代)和互補序列以及明確指定的序列。特定而言，可通過產生其中一個或一個以上所選(或所有)密碼子的第3位經混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代的序列來實現(xiàn)簡并密碼子取代(Batzer 等人，Nucleic Acid Res.19:5081 (1991) ;0htsuka 等人，J.B1l.Chem.260:2605-2608 (1985);和 Cassol 等人，(1992) ;Rossolini 等人，Mol Cell.Probes8:91-98(1994))。
[0037]術語“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互換使用以意指氨基酸殘基的聚合物。SP，針對多肽的描述同樣適用于描述肽和描述蛋白，且反之亦然。所述術語適用于天然產生氨基酸聚合物以及其中一個或一個以上氨基酸殘基為非天然編碼氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用，所述術語涵蓋任何長度的氨基酸鏈，其包括全長蛋白(即抗原)，其中氨基酸殘基經由共價肽鍵連接。
[0038]述語“嚴謹雜交條件”意指在所屬領域中已知的低離子強度和高溫的條件。通常，在嚴謹條件下，探針與其靶序列雜交的可檢測程度比與其它序列雜交的可檢測程度更高(例如超過本底至少2倍)。嚴謹雜交條件是序列依賴性的，在不同的環(huán)境條件下將會不同，較長的序列在較高溫度下特異性雜交。通過控制雜交的嚴謹性或洗滌條件可鑒定與探針100%互補的祀序列。對于核酸雜交的詳盡指導可參考有關文獻(Tijssen, Techniques inB1chemistry and Molecular B1logy-Hybridizat1n with Nucleic Probes, "Overviewof principles of hybridizat1n and the strategy of nucleic acid assays.1993)。更具體的，所述嚴謹條件通常被選擇為低于特異序列在規(guī)定離子強度PH下的熱熔點(Tm)約5-10°C。Tm為在平衡狀態(tài)下50%與目標互補的探針雜交到目標序列時所處的溫度(在指定離子強度、PH和核酸濃度下)(因為目標序列過量存在，所以在Tm下在平衡狀態(tài)下50%的探針被占據(jù))。嚴謹條件可為以下條件:其中在PH 7.0到8.3下鹽濃度低于約1.0M鈉離子濃度，通常為約0.01到1.0M鈉離子濃度(或其它鹽)，并且溫度對于短探針(包括(但不限于)10到50個核苷酸)而言為至少約30°C，而對于長探針(包括(但不限于)大于50個核苷酸)而言為至少約60°C。嚴謹條件也可通過加入諸如甲酰胺的去穩(wěn)定劑來實現(xiàn)。對于選擇性或特異性雜交而言，正信號可為至少兩倍的背景雜交，視情況為10倍背景雜交。例示性嚴謹雜交條件可如下:50%甲酰胺，5\330和1% SDS，在42°C下培養(yǎng)；*5XSSC，1% SDS，在65°C下培養(yǎng)，在0.2X SSC中洗滌和在65°C下于0.1% SDS中洗滌。所述洗滌可進行5、15、30、60、120分鐘或更長時間。
[0039]術語“重組宿主細胞株”或“宿主細胞”意指包含本發(fā)明多核苷酸的細胞，而不管使用何種方法進行插入以產生重組宿主細胞，例如直接攝取、轉導、f配對或所屬領域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持為例如質粒的非整合載體或者可整合入宿主基因組中。宿主細胞可為原核細胞或真核細胞，宿主細胞還可為單子葉或雙子葉植物細胞。
[0040]術語“轉化”意指將異源性DNA序列引入到宿主細胞或有機體的方法。
[0041]術語“表達”意指內源性基因或轉基因在植物細胞中的轉錄和/或翻譯。
[0042]術語“編碼序列”意指轉錄成RNA的核酸序列。
[0043]術語“重組植物表達載體”意指一種或多種用于實現(xiàn)植物轉化的DNA載體；本領域中這些載體常被稱為二元載體。二元載體連同具有輔助質粒的載體是大多常用于土壤桿菌介導轉化的。二元載體通常包括=T-DNA轉移所需要的順式作用序列、經工程化處理以便能夠在植物細胞中表達的選擇標記物，待轉錄的異源性DNA序列等。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0044]圖1為從棉花基因組及cDNA中克隆GhMYCl和GhMYC2電泳圖；其中，M為DNAMarker ;1、2為棉花基因組對MYCl全長引物的PCR結果；3為棉花cDNA對MYCl全長引物的PCR結果；4、5為棉花基因組對MYC2全長引物的PCR結果；6為棉花cDNA對MYC2全長引物的PCR結果；
[0045]圖2為從棉花基因組及cDNA中克隆GhMYC3和GhMYC4電泳圖；其中，1、2為棉花cDNA對MYC3全長引物的PCR結果；3為棉花基因組對MYC3全長引物的PCR結果；4、5、6為棉花基因組對MYC4全長引物的PCR結果；7、8、9為棉花cDNA對MYC4全長引物的PCR結果；
[0046]圖3為GhMYCl的陽性菌落檢測圖；其中，M為DNA Marker ;11、13為11和13號菌落；+為陽性對照；_為空白對照；
[0047]圖4為GhMYC2的陽性菌落檢測圖；
[0048]圖5為GhMYC3的陽性菌落檢測圖；
[0049]圖6為GhMYC4的陽性菌落檢測圖；
[0050]圖7為Gateway方法構建含有GhMYCl、GhMYC2、GhMYC3或GhMYC4基因的植物表達載體的流程圖；
[0051]圖8為GhMYCl、GhMYC2、GhMYC3和GhMYC4基因的入門克隆轉化大腸桿菌菌株DH5 α的菌液PCR檢測圖；其中，M為DNA Marker ;1_3為GhMYCl的入門克隆轉化大腸桿菌DH5 α的3號菌落的PCR檢測結果；2_3和2_4為GhMYC2的入門克隆轉化大腸桿菌DH5 α的3號和4號菌落的PCR檢測結果；3-2、3-3和3_4為GhMYC3的入門克隆轉化大腸桿菌DH5 α的2號、3號和4號菌落的PCR檢測結果；4-1、4-2、4-3、4-4和4_5為GhMYC4的入門克隆轉化大腸桿菌DH5 α的I號、2號、3號、4號和5號菌落的PCR檢測結果；+為陽性對照；
[0052]圖9為GhMYCl、GhMYC2、GhMYC3和GhMYC4基因的植物表達載體轉化大腸桿菌菌株DH5a的菌液PCR檢測圖；其中，M為DNA Marker ; 1-1、1-2和1-3為GhMYCl的植物表達載體轉化大腸桿菌DH5a的I號、2號和3號菌落的PCR檢測結果；2_1、2-1、2_3和2_4為GhMYC2的植物表達載體轉化大腸桿菌DH5 α的I號、2號、3號和4號菌落的PCR檢測結果；
3-1、3-2和3-3為GhMYC3的植物表達載體轉化大腸桿菌DH5α的I號、2號和3號菌落的PCR檢測結果；4-1、4-2、4-3和4_4為GhMYC4的植物表達載體轉化大腸桿菌DH5 α的I號、2號、3號和4號菌落的PCR檢測結果；+為陽性對照；_為空白對照；
[0053]圖1O為GhMYC 1、GhMYC2、GhMYC3和GhMYC4基因的植物表達載體轉化農桿菌GV3101的菌液PCR檢測圖;其中，M為DNA Marker ; 1-1、1-2、1-4和1-5為GhMYCl的植物表達載體轉化農桿菌GV3101的I號、2號、4號和5號菌落的PCR檢測結果；2_1、2-3、2_4和2-5為GhMYC2的植物表達載體轉化農桿菌GV3101的I號、3號、4號和5號菌落的PCR檢測結果；3-1、3-2、3-3和3-4為GhMYC3的植物表達載體轉化農桿菌GV3101的I號、2號、3號和4號菌落的PCR檢測結果；4-2和4-5為GhMYC4的植物表達載體轉化農桿菌GV3101的2號和5號菌落的PCR檢測結果；+為陽性對照；
[0054]圖11轉基因擬南芥的PCR鑒定圖；其中，M為DNA Marker ; 1_1—1-6為轉GhMYCl基因的6株擬南芥的檢測結果；3-1—3-2為轉GhMYC3基因的2株擬南芥的檢測結果；4_1 一
4-12為轉GhMYC4基因的12株擬南芥的檢測結果；
[0055]圖12為200mmol/L NaCl處理后的轉基因擬南芥總葉綠素含量的柱狀圖；其中NK為對照未轉基因植株；GhMYCl-l和GhMYCl-2為轉GhMYCl基因的擬南芥植株I號和2號；GhMYC2-l和GhMYC2-2為轉GhMYC2基因的擬南芥植株I號和2號；GhMYC3_l和GhMYC3_2為轉GhMYC3基因的擬南芥植株I號和2號；GhMYC4-l和GhMYC4_2為轉GhMYC4基因的擬南芥植株I號和2號；
[0056]圖13為干旱處理后的轉基因擬南芥總葉綠素含量的柱狀圖；其中NK為對照未轉基因植株；GhMYCl-l和GhMYCl-2為轉GhMYCl基因的擬南芥植株I號和2號；GhMYC3_l和GhMYC3-2為轉GhMYC3基因的擬南芥植株I號和2號；GhMYC4_l和GhMYC4_2為轉GhMYC4基因的擬南芥植株I號和2號；
[0057]圖14為200mmol/L NaCl處理后的轉基因擬南芥的丙二醇含量柱狀圖；其中NK為對照未轉基因植株；GhMYCl-l和GhMYCl-2為轉GhMYCl基因的擬南芥植株I號和2號；GhMYC2-l和GhMYC2-2為轉GhMYC2基因的擬南芥植株I號和2號；GhMYC3_l和GhMYC3_2為轉GhMYC3基因的擬南芥植株I號和2號；GhMYC4-l和GhMYC4_2為轉GhMYC4基因的擬南芥植株I號和2號；
[0058]圖15為干旱處理后的轉基因擬南芥的丙二醇含量柱狀圖；其中NK為對照未轉基因植株；GhMYCl-l和GhMYCl-2為轉GhMYCl基因的擬南芥植株I號和2號；GhMYC2_l和GhMYC2-2為轉GhMYC2基因的擬南芥植株I號和2號；GhMYC3_l和GhMYC3_2為轉GhMYC3基因的擬南芥植株I號和2號；GhMYC4-l和GhMYC4-2為轉GhMYC4基因的擬南芥植株I號和2號；
[0059]圖16為200mmol/L NaCl處理后的轉基因擬南芥的可溶性糖含量的柱狀圖；其中NK為對照未轉基因植株；GhMYCl-l和GhMYCl-2為轉GhMYCl基因的擬南芥植株I號和2號；GhMYC2-l和GhMYC2-2為轉GhMYC2基因的擬南芥植株I號和2號；GhMYC3_l和GhMYC3_2為轉GhMYC3基因的擬南芥植株I號和2號；GhMYC4-l和GhMYC4_2為轉GhMYC4基因的擬南芥植株I號和2號；
[0060]圖17為干旱處理后的轉基因擬南芥的可溶性糖含量柱狀圖；其中NK為對照未轉基因植株；GhMYCl-l和GhMYCl-2為轉GhMYCl基因的擬南芥植株I號和2號；GhMYC2_l和GhMYC2-2為轉GhMYC2基因的擬南芥植株I號和2號；GhMYC3_l和GhMYC3_2為轉GhMYC3基因的擬南芥植株I號和2號；GhMYC4-l和GhMYC4-2為轉GhMYC4基因的擬南芥植株I號和2號。

【具體實施方式】
[0061]下面結合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但是應理解所述實施例僅是范例性的，不對本發(fā)明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發(fā)明的保護范圍。
[0062]1、實驗材料
[0063]棉花銀棉品種的葉片，銀棉品種購買于北京市中蔬大森林花卉市場；擬南芥種子為哥倫比亞型，本發(fā)明人實驗室保存；pMD_19T克隆載體、Taq酶購于全式金公司；大腸桿菌DH5a與高純質粒小量制備試劑盒均購自北京百泰克生物技術有限公司；農桿菌菌株GV3101為本發(fā)明人實驗室保存；
[0064]pD0NR?207載體購自英偉捷達公司；表達載體pH7WG2D購自VIB (比利時)公司；Gateway克隆的BP反應試劑盒和LR反應試劑盒購自英偉捷達公司；DNA膠回收試劑盒購自塔克拉公司；Trizol試劑購自天根科技有限公司；cDNA反轉錄試劑盒購自Fermentas公司；引物合成和測序由北京奧科鼎盛生物技術有限公司完成。
[0065]實施例1棉花MYC類轉錄因子編碼基因的克隆
[0066]1、實驗方法
[0067]1.1電子克隆得到MYC類轉錄因子
[0068]根據(jù)同源基因中存在保守相似序列的特性，用擬南芥MYC類轉錄因子基因的序列為信息探針，對NCBI中EST數(shù)據(jù)庫棉花(Gossypium hirsutum)進行Tblastx同源性檢索，利用DNAStar軟件將檢索到的來自于棉花的EST序列拼接獲得連接體；然后用此連接體再次進行Tblastx的同源檢索與拼接，重復以上過程直至無重疊的EST序列，最終獲得陸地棉4個GhMYC基因的cDNA序列片段。
[0069]1.2RT-PCR方法獲得目的基因
[0070]依據(jù)電子克隆獲得的全長4個GhMYC基因的cDNA序列設計RT — PCR引物(表I)。
[0071]表1 GhMYC克隆全長引物
[0072]

【權利要求】
1.從棉花(Gossypiumhirsutum L.)分離的GhMYC4轉錄因子編碼基因,其特征在于，其多核苷酸為(a)、(b)、(c)、(d)或(e)所示: (a)、SEQID N0.4所示的多核苷酸；或 (b)、編碼SEQID N0.5所示氨基酸的多核苷酸；或 (c)、與SEQID N0.4的互補序列在嚴謹雜交條件能夠進行雜交的多核苷酸，該多核苷酸所編碼蛋白質仍具有GhMYC4轉錄因子功能；或 (d)、與SEQID N0.4所示的多核苷酸至少有90%或以上同源性的多核苷酸，優(yōu)選的，與SEQ ID N0.4所示的多核苷酸至少有95%或以上同源性的多核苷酸，最優(yōu)選的，與SEQ IDN0.4所示的多核苷酸至少有98%或以上同源性的多核苷酸；或 (e)、在SEQID N0.4所示的多核苷酸的基礎上進行一個或多個堿基的缺失、取代或插入的多核苷酸變體，且該多核苷酸變體所編碼的蛋白仍具有GhMYC4轉錄因子的功能或活性。
2.權利要求1所述編碼基因編碼的GhMYC4轉錄因子，其特征在于，其氨基酸為(a)或(b)所示:
(a)、SEQID N0.5所示的氨基酸； (b)jfSEQ ID N0.5所示的氨基酸通過一個或多個氨基酸殘基的替換、缺失或/和插入而衍生得到的仍具有GhMYC4轉錄因子功能或活性的蛋白變體。
3.含有權利要求1所述的編碼基因的重組表達載體。
4.按照權利要求3所述的重組表達載體，其特征在于:所述重組表達載體是重組植物表達載體。
5.含有權利要求3或4所述的重組表達載體的重組宿主細胞。
6.權利要求1所述的編碼基因在提高植物對逆境脅迫抗性中的應用。
7.按照權利要求6所述的應用，其特征在于，包括以下步驟:(1)構建含有權利要求1所述的編碼基因的重組植物表達載體；(2)將所構建的重組植物表達載體轉化到植物或植物細胞中；(3)培育篩選得到對逆境脅迫抗性提高的轉基因植物新品種。
8.一種培育耐逆境脅迫的轉基因植物新品種的方法，其特征在于，包括以下步驟:(I)構建含有權利要求1所述的編碼基因的重組植物表達載體；(2)將所構建的重組植物表達載體轉化到植物或植物細胞中；(3)培育篩選得到對逆境脅迫抗性提高的轉基因植物新品種。
9.權利要求2所述的GhMYC4轉錄因子在提高植物對逆境脅迫抗性中的應用。
10.按照權利要求6、7或9所述的應用，其特征在于:所述的逆境脅迫包括高鹽或干旱。
【文檔編號】C12N15/29GK104164440SQ201410390070
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年8月8日 優(yōu)先權日:2014年8月8日
【發(fā)明者】吳燕民, 周美亮, 劉博欣, 孫占敏, 唐益雄 申請人:中國農業(yè)科學院生物技術研究所