奶牛致病菌五重pcr反應(yīng)試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種奶牛致病菌五重PCR反應(yīng)試劑盒，包括檢測(cè)產(chǎn)腸毒素大腸桿菌LT基因、產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌ST基因、沙門氏菌invA基因、金黃色葡萄球菌nuc基因、單核細(xì)胞增生性李氏桿菌hlyA基因的五對(duì)引物。本發(fā)明以規(guī)?；?chǎng)環(huán)境中常見(jiàn)的大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單核增生性李氏桿菌為研究對(duì)象，利用這些致病菌不同的靶基因建立特異性強(qiáng)、可靠性和靈敏度高的多重PCR反應(yīng)試劑盒，這不僅可以提高檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性，且能夠檢測(cè)到一些傳統(tǒng)方法很難檢測(cè)到的致病菌，還為快速、高效檢測(cè)和控制牛場(chǎng)環(huán)境中多種致病菌提供思路和方法。
【專利說(shuō)明】奶牛致病菌五重PCR反應(yīng)試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于動(dòng)物分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種奶牛致病菌五重PCR反應(yīng)試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 隨著規(guī)?；膛?chǎng)的不斷發(fā)展，國(guó)內(nèi)外有關(guān)機(jī)構(gòu)和研究者逐漸重視牛舍的環(huán)境質(zhì) 量問(wèn)題?，F(xiàn)在奶牛飼養(yǎng)密度大，每頭牛的生活和運(yùn)動(dòng)空間都相對(duì)擁擠，牛舍環(huán)境質(zhì)量下降， 病原菌繁殖加快，致使牛舍受到污染。致病菌、條件性致病菌和非病原菌都可存在牛舍環(huán)境 中，當(dāng)這些細(xì)菌達(dá)到一定程度時(shí)，就會(huì)暴發(fā)系列疾病。牛舍環(huán)境質(zhì)量的好壞不僅直接影響了 牛的正常生長(zhǎng)和生產(chǎn)性能，還決定了畜產(chǎn)品的質(zhì)量和養(yǎng)牛業(yè)的生產(chǎn)效益。所以，環(huán)境中致病 菌是影響人和動(dòng)物健康的潛在因素，環(huán)境衛(wèi)生管理一有疏忽，它們就會(huì)趁虛而入，給養(yǎng)殖業(yè) 造成經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重者甚至影響到社會(huì)發(fā)展和政治穩(wěn)定。因此檢測(cè)和控制環(huán)境中病原菌的 問(wèn)題需亟待解決。
[0003] 環(huán)境中的病原菌主要有大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單核增生性李氏桿 菌等，它們?cè)谝欢ǔ潭壬暇蓪?dǎo)致動(dòng)物的感染。致病型大腸桿菌有很多種，其中，腸毒素型 大腸桿菌是引起腹瀉最常見(jiàn)的大腸桿菌。在世界范圍內(nèi)，它可引起犢牛嚴(yán)重的水樣腹瀉。 這種菌主要在小腸近端居留，通過(guò)產(chǎn)生腸毒素而致病。產(chǎn)腸毒素大腸桿菌有不耐熱腸毒素 (LT)和耐熱腸毒素（ST)兩種。沙門氏菌的主要致病物質(zhì)有脂多糖、腸毒素、內(nèi)毒素、侵襲 力。沙門氏菌的侵襲蛋白（invasion protein, inv)決定細(xì)菌粘附和進(jìn)入宿主上皮細(xì)胞的 能力，與細(xì)菌致病性密切相關(guān)，它是由invA、invB、invC、invD和invE等一組基因編碼，其中 invA為沙門氏菌的主要毒力因子，也是毒力島SPI基因之一。染色體上的侵襲基因 invA是 一段只存在于致病性沙門菌中獨(dú)特的保守基因序列。在沙門氏菌屬中invA基因序列有很 高的同源性，與其它生物沒(méi)有同源性，是目前沙門氏菌檢測(cè)的主要靶點(diǎn)。金黃色葡萄球菌可 以分泌多種毒力因子，如葡萄球菌溶血素、腸毒素、凝固酶、耐熱核酸酶等，這些毒素和酶致 病性強(qiáng)，可引起創(chuàng)傷性感染、膿腫、蜂窩織炎、乳腺炎、關(guān)節(jié)炎、敗血癥、毒素休克綜合癥、心 內(nèi)膜炎、中毒性嘔吐、腸炎等癥狀。金黃色葡萄球菌nuc基因編碼的耐熱核酸酶是一種胞外 酶，為金黃色葡萄球菌所特有，耐熱核酸酶蛋白的nuc基因編碼已全部定序，只要通過(guò)nuc 基因的特異性擴(kuò)增就可以快捷準(zhǔn)確地檢測(cè)出金黃色葡萄球菌。單核增生性李氏桿菌對(duì)人和 動(dòng)物均有侵襲力，可導(dǎo)致食物中毒，是一種人畜共患的食品病原菌。人、畜感染后主要表現(xiàn) 為腦膜炎.敗血癥及孕婦流產(chǎn)，有的可出現(xiàn)單細(xì)胞增多，溶血素為李斯特菌的主要致病因 子，由hly基因編碼，單核細(xì)胞增多性李斯特菌hlyA基因具有較高的保守性和特異性。因 此，hly基因可作為單核增生性李氏桿菌的靶基因。
[0004] 傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)、生化鑒定等檢測(cè)方法無(wú)法對(duì)難培養(yǎng)或不可培養(yǎng)的微生物進(jìn)行檢 測(cè)，而且特異性不高、靈敏度低、操作繁瑣耗時(shí)，難以滿足飛速發(fā)展的集約化養(yǎng)殖生產(chǎn)對(duì)檢 測(cè)速度的要求，不能實(shí)現(xiàn)有效的監(jiān)測(cè)、預(yù)防作用。因此，開(kāi)發(fā)快速檢測(cè)環(huán)境中致病菌技術(shù)，并 對(duì)其進(jìn)行控制成為保障畜舍環(huán)境公共衛(wèi)生和畜產(chǎn)品安全的重要任務(wù)之一。
[0005] 在國(guó)外，多年來(lái)，許多研究人員已創(chuàng)建了不少快速、特異、敏感、低耗且實(shí)用的細(xì)菌 學(xué)檢測(cè)方法。尤其是免疫酶聯(lián)法、DNA探針、多聚酶聯(lián)反應(yīng)、生物感受器、基因芯片等技術(shù)的 發(fā)展和應(yīng)用，明顯提高了人類對(duì)環(huán)境致病菌的認(rèn)識(shí)及檢測(cè)水平。但國(guó)內(nèi)對(duì)致病菌的免疫學(xué) 和分子生物學(xué)檢測(cè)方法也有一定的研究，對(duì)其應(yīng)用較少，相比傳統(tǒng)方法所需儀器設(shè)備相比 要求高，在很大程度上限制了這些方法的應(yīng)用，大大降低了其實(shí)用價(jià)值。多重PCR技術(shù)簡(jiǎn) 單、快速，實(shí)用性高，因此，可以考慮應(yīng)用多重PCR技術(shù)為奶牛致病菌的快速檢測(cè)提供一種 新的思路。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種奶牛致病菌五重PCR反應(yīng)試劑盒，克服關(guān)于奶牛致病菌 傳統(tǒng)檢測(cè)手段特異性不高、靈敏度低、操作繁瑣耗時(shí)等問(wèn)題，還能克服傳統(tǒng)檢測(cè)不能實(shí)現(xiàn)有 效監(jiān)測(cè)和預(yù)防作用的問(wèn)題。
[0007] 本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：奶牛致病菌五重PCR反應(yīng)試劑盒，包括10 XPCR 反應(yīng)緩沖液，Mg2+，dNTP，引物和Taq酶，所述的引物為：
[0008] (1)檢測(cè)產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌LT基因的引物：
[0009] Fl：5/ -CTGACTCTAGACCCCCAGATGAAAT-3 ; (SEQ ID No. 1)
[0010] Rl：5/ -CTGTCCTGCTAAGTGAGCACTTCTC-3 ; (SEQ ID No. 2)
[0011] (2)檢測(cè)產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌ST基因的引物：
[0012] F2：5/ -AAAACCAGATAGCCAGACAATTAAC-3 ; (SEQ ID No. 3)
[0013] R2：5/ -AGGATTACAACAAAGTTCACAGCAG-3 ; (SEQ ID No. 4)
[0014] (3)檢測(cè)沙門氏菌invA基因的引物：
[0015] F3：5/ -GATTTGTCCTCCGCTCTGTCTACTT-3 ; (SEQ ID No. 5)
[0016] R3：5/ -CAATACGATGCTGTTATCGTCCAGG-3 ; (SEQ ID No. 6)
[0017] (4)檢測(cè)金黃色葡萄球菌nuc基因的引物：
[0018] F4 :5，-TAGGGATGGCTATCAGTAATGTTTC-3，（SEQ ID No. 7)
[0019] R4：5/ -CCATCAGCATAAATATACGCTAAGC-3 ; (SEQ ID No. 8)
[0020] (5)檢測(cè)單核細(xì)胞增生性李氏桿菌hlyA基因的引物：
[0021] F5 :5，-TATGATGACGAAATGGCTTACAGTG-3，（SEQ ID No. 9)
[0022] R5 :5，-GAACAATTTCGTTACCTTCAGGATC-3，（SEQ ID No. 10)。
[0023] 進(jìn)一步的，所述的試劑盒的反應(yīng)體系為lOXBuffer 5μ L，25mmol .171的Mg2+6y L， 5U · μ Γ1 的 Taq 酶 0· 4μ L，dNTP 3· 0μ L，模板 DNA 1· 0μ L，10ymmol · Γ1 的上、下游引物 各0. 5 μ L,用滅菌去離子水補(bǔ)至50 μ L。
[0024] 進(jìn)一步的，所述的試劑盒的反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min，94°C變性45s，63°C退火 45 8,721：延伸458，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后721：終延伸1〇1^11。
[0025] 采用上述技術(shù)方案的積極效果：本發(fā)明以規(guī)?；?chǎng)環(huán)境中常見(jiàn)的大腸桿菌、沙 門氏菌、金黃色葡萄球菌、單核增生性李氏桿菌為研究對(duì)象，利用這些致病菌不同的靶基因 建立特異性強(qiáng)、可靠性和靈敏度高的多重PCR反應(yīng)試劑盒，這不僅可以提高檢測(cè)的靈敏度 和準(zhǔn)確性，且能夠檢測(cè)到一些傳統(tǒng)方法很難檢測(cè)到的致病菌，還為快速、高效檢測(cè)和控制牛 場(chǎng)環(huán)境中多種致病菌提供思路和方法，而且對(duì)及時(shí)有效控制和預(yù)防環(huán)境中病原菌傳播、降 低病原菌對(duì)動(dòng)物和人類帶來(lái)的危害、加強(qiáng)牛舍環(huán)境公共衛(wèi)生的監(jiān)護(hù)與防疫、提高畜產(chǎn)品質(zhì) 量具有十分重大的意義。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0026] 圖1是本發(fā)明的試劑盒優(yōu)化條件結(jié)果圖；
[0027] M-DL2000DNA Marker ;1?16-分別對(duì)應(yīng)表1中試驗(yàn)1?16 ;17_陰性對(duì)照；
[0028] 圖2是本發(fā)明的試劑盒特異性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果圖；
[0029] M-DL2000DNA Marker ;1為金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、產(chǎn)LT大腸桿菌；2為金黃 色葡萄球菌、沙門氏菌、單核增生性李氏桿菌、產(chǎn)ST大腸桿菌；3為金黃色葡萄球菌、沙門氏 菌、產(chǎn)LT大腸桿菌、產(chǎn)ST大腸桿菌；4為沙門氏菌、產(chǎn)ST大腸桿菌、產(chǎn)LT大腸桿菌；5為沙 門氏菌、產(chǎn)LT大腸桿菌；6為金黃色葡萄球菌、產(chǎn)ST大腸桿菌、產(chǎn)LT大腸桿菌；7為單核增 生性李氏桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、產(chǎn)LT大腸桿菌、產(chǎn)ST大腸桿菌；8為產(chǎn)ST大腸 桿菌、產(chǎn)LT大腸桿菌；9為單核增生性李氏桿菌、產(chǎn)ST大腸桿菌；10為陰性對(duì)照；
[0030] 圖3是本發(fā)明的試劑盒敏感性檢測(cè)結(jié)果圖；
[0031] M-DL2000DNA Marker ;1 ?7-五種菌濃度均依次為 107 ?lOkfu · mL'

【具體實(shí)施方式】
[0032] 本發(fā)明中的生物材料來(lái)源的說(shuō)明：
[0033] 1、引物
[0034] 檢測(cè)產(chǎn)腸毒素大腸桿菌LT基因、產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌ST基因、沙門氏菌invA基 因、金黃色葡萄球菌nuc基因、單核細(xì)胞增生性李氏桿菌hlyA基因的引物均為自行設(shè)計(jì)并 委托上海生工生物有限公司合成。
[0035] 2、菌種
[0036] 金黃色葡萄球菌（ATCC25923)、沙門氏菌（CVCC325)、單核細(xì)胞增生性李氏桿菌 (ATCC19111)、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（ATCC83922)購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏中心。
[0037] 實(shí)施例1
[0038] 將營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面活化的金黃色葡萄球菌（ATCC25923)、沙門氏菌（CVCC325)、單 核細(xì)胞增生性李氏桿菌（ATCC19111)、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（ATCC83922)分別接種營(yíng)養(yǎng)肉 湯，37°C培養(yǎng)18h后進(jìn)行DNA提取。用CTAB/NaCL2酚抽提法提取細(xì)菌DNA，取菌液lmL于 1. 5ml離心管，12000r/min離心2min，棄上清液，TE緩沖液（PH = 8. 0)洗滌，12000r/min離 心2min;于沉淀中加入567yL TE緩沖液，重懸菌體，加入30yL10%SDS和3yL蛋白酶 K(20mg/mL)，混勻，37°C溫浴 lh;加入 100yL 5mol/L NaCl，充分混勻，再加入 80yL CTAB/ NaCl溶液，混勻，于65°C溫浴lOmin ;加入等體積的氯仿/異戊醇（24:1)，混勻，離心4? 5min。將上清液轉(zhuǎn)入一個(gè)新管中；加入等體積的酚/氯仿/異戊醇（24:24:1)，離心5min, 將上清轉(zhuǎn)移到新管中；加入〇. 6體積異丙醇，輕輕混合至DNA沉淀下來(lái)，轉(zhuǎn)移沉淀至lmL乙 醇中洗滌；離心，棄上清，干燥，重溶于100 μ L TE緩沖液中，儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br> [0039] 根據(jù)產(chǎn)腸毒素大腸桿菌LT基因（V00275)、產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌ST基因 (Μ25607)、沙門氏菌invA基因（V43272. 1)、金黃色葡萄球菌nuc基因（V01281. 1)、單核細(xì) 胞增生性李氏桿菌hlyA基因的序列（AF253320. 1)，用Primer 5.0引物設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)， 5對(duì)引物由上海生工生物有限公司合成。引物序列如下：
[0040] (1)檢測(cè)產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌LT基因的引物：
[0041] Fl：5/ -CTGACTCTAGACCCCCAGATGAAAT-3 ; (SEQ ID No. 1)
[0042] Rl：5/ -CTGTCCTGCTAAGTGAGCACTTCTC-3 ; (SEQ ID No. 2)
[0043] (2)檢測(cè)產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌ST基因的引物：
[0044] F2：5/ -AAAACCAGATAGCCAGACAATTAAC-3 ; (SEQ ID No. 3)
[0045] R2：5/ -AGGATTACAACAAAGTTCACAGCAG-3 ; (SEQ ID No. 4)
[0046] (3)檢測(cè)沙門氏菌invA基因的引物：
[0047] F3：5/ -GATTTGTCCTCCGCTCTGTCTACTT-3 ; (SEQ ID No. 5)
[0048] R3：5/ -CAATACGATGCTGTTATCGTCCAGG-3 ; (SEQ ID No. 6)
[0049] (4)檢測(cè)金黃色葡萄球菌nuc基因的引物：
[0050] F4 :5，-TAGGGATGGCTATCAGTAATGTTTC-3，（SEQ ID No. 7)
[0051] R4：5/ -CCATCAGCATAAATATACGCTAAGC-3 ; (SEQ ID No. 8)
[0052] (5)檢測(cè)單核細(xì)胞增生性李氏桿菌hlyA基因的引物：
[0053] F5 :5，-TATGATGACGAAATGGCTTACAGTG-3，（SEQ ID No. 9)
[0054] R5 :5，-GAACAATTTCGTTACCTTCAGGATC-3，（SEQ ID No. 10)。
[0055] 構(gòu)建50 μ L的反應(yīng)體系，對(duì)退火溫度、Mg2+、引物、Taq酶及dNTPs濃度進(jìn)行正交試 驗(yàn)L16(45)，進(jìn)而篩選最優(yōu)的PCR反應(yīng)體系。正交試驗(yàn)方案見(jiàn)表1。
[0056] 表1PCR條件優(yōu)化正交設(shè)計(jì)方案
[0057]

【權(quán)利要求】
1. 一種奶牛致病菌五重PCR反應(yīng)試劑盒，包括10XPCR反應(yīng)緩沖液，Mg2+，dNTP，引物和 Taq酶，其特征在于：所述的引物為： (1) 檢測(cè)產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌LT基因的引物： Fl:5， -CTGACTCTAGACCCCCAGATGAAAT-3， （SEQIDNo.l) R1 ：5/ -CTGTCCTGCTAAGTGAGCACTTCTC-3; (SEQ ID No. 2) (2) 檢測(cè)產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌ST基因的引物： F2:5, -AAAACCAGATAGCCAGACAATTAAC-3' （SEQIDNo.3) R2：5/ -AGGATTACAACAAAGTTCACAGCAG-3; (SEQ ID No. 4) (3) 檢測(cè)沙門氏菌invA基因的引物： F3：5/ -GATTTGTCCTCCGCTCTGTCTACTT-3; (SEQ ID No. 5) R3：5/ -CAATACGATGCTGTTATCGTCCAGG-3; (SEQ ID No. 6) (4) 檢測(cè)金黃色葡萄球菌nuc基因的引物： F4：5/ -TAGGGATGGCTATCAGTAATGTTTC-3; (SEQ ID No. 7) R4：5/ -CCATCAGCATAAATATACGCTAAGC-3; (SEQ ID No. 8) (5) 檢測(cè)單核細(xì)胞增生性李氏桿菌hlyA基因的引物： F5：5/ -TATGATGACGAAATGGCTTACAGTG-3; (SEQ ID No. 9) R5:5，-GAACAATTTCGTTACCTTCAGGATC-3，（SEQIDNo.10)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的奶牛致病菌五重PCR反應(yīng)試劑盒，其特征在于：所述的試劑 盒的反應(yīng)體系為 lOXBuffer 5yL，25mmol .I71 的 Mg2+6yL，5U· μΓ1 的 Taq 酶 0.4yL， dNTP 3.0 μ L，模板DNA 1.0 μ L，10 μ mmol .171的上、下游引物各0.5 μ L，用滅菌去離子水 補(bǔ)至50 μ L。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的奶牛致病菌五重PCR反應(yīng)試劑盒，其特征在于：所述的試劑 盒的反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min，94°C變性45s，63°C退火45s，72°C延伸45s，共進(jìn)行30個(gè) 循環(huán)，最后72°C終延伸10min。
【文檔編號(hào)】C12R1/42GK104152555SQ201410384616
【公開(kāi)日】2014年11月19日 申請(qǐng)日期:2014年8月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月7日
【發(fā)明者】楊玉英, 胡婧, 翟軍軍, 孫海英 申請(qǐng)人:黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)