安徽麝微衛(wèi)星位點、引物及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了安徽麝微衛(wèi)星位點、引物及其應(yīng)用，安徽麝微衛(wèi)星位點包括9個穩(wěn)定的多態(tài)性微衛(wèi)星位點，其序列分別如SEQ?ID?NO：1-SEQ?ID?NO：9所示。所述的安徽麝微衛(wèi)星位點的引物，其序列分別如SEQ?ID?NO：10-SEQ?ID?NO：27所示。應(yīng)用上述引物，對7個個體的基因分型數(shù)據(jù)顯示，等位基因數(shù)為0-4，期望雜合度He為0-0.779，觀測雜合度Ho為0-0.714.除了位點MaI75外，其他均表現(xiàn)出多態(tài)性，達(dá)到了個體識別的要求。
【專利說明】安徽麝微衛(wèi)星位點、引物及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)，尤其涉及的是安徽麝微衛(wèi)星位點、引物及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 安徽廣隸屬于偶蹄目（Artiodactyla)、反芻亞目（Ruminantia)、有角下目 (Pecora)、麝科（Moschidae)，是古北界特有哺乳動物。僅分布在安徽、河南、湖北三省交界 的大別山，是華東地區(qū)珍貴的野生動物資源。目前，種群數(shù)量總計在500-600只左右。分子 生物信息為建立改物種保護單元提供了一定的理論依據(jù)。而該方面的研究上處于空白。因 此，展開安徽麝的遺傳學(xué)研究已經(jīng)可不容緩。
[0003] 目前安徽麝種群數(shù)量稀少，在野外調(diào)查中較難發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致樣品的采集十分艱難，而 目前最為合適的非損傷采樣方法是采集糞便。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足提供安徽麝微衛(wèi)星位點、引物 及其應(yīng)用。本發(fā)明是首次提供安徽麝的微衛(wèi)星位點及引物，并且利用這些位點對采集到的 糞便樣品進行遺傳學(xué)鑒定和個體識別。這些位點在對安徽麝的保護遺傳學(xué)研究、種質(zhì)資源 調(diào)查、個體識別和輔助育種中起到重要作用。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0006] 安徽麝微衛(wèi)星位點，包括9個穩(wěn)定的多態(tài)性微衛(wèi)星位點，其序列分別如SEQ ID N0 : 1-SEQ ID NO :9 所示。
[0007] 所述的安徽麝微衛(wèi)星位點的引物，其序列分別如SEQ ID NO :10-SEQ ID NO :27所 /_J、1 o
[0008] 所述的安徽麝微衛(wèi)星位點或者所述的引物的應(yīng)用，包括分子生態(tài)學(xué)研究，譜系分 析，種質(zhì)資源調(diào)查，輔助育種和個體識別，所述9個穩(wěn)定的多態(tài)性微衛(wèi)星位點組合使用，或 者其對應(yīng)的引物組合使用。
[0009] 應(yīng)用上述引物，對7個個體的基因分型數(shù)據(jù)顯示，等位基因數(shù)為0-4,期望雜合度 He為0-0. 779,觀測雜合度Ho為0-0. 714.除了位點MaI75外，其他均表現(xiàn)出多態(tài)性，達(dá)到 了個體識別的要求。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0010] 圖 1 AFLP 擴增結(jié)果凝膠電泳檢測圖；M :Trans 2K Plus II DNA Marker ;L1-L2 : AFLP擴增結(jié)果；Y :空白對照；
[0011] 圖2安徽麝糞便DNA提取結(jié)果凝膠電泳圖；M :Trans 2K DNA Marker ;L1-L7 :糞便 DNA抽提結(jié)果；

【具體實施方式】
[0012] 以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明進行詳細(xì)說明。
[0013] 1、建庫DNA抽提
[0014] 由于建庫篩選微衛(wèi)星位點需要高質(zhì)量的模板，所以我們剪取安徽麝肌肉組織（來 自林業(yè)局收繳的偷獵樣品），提取DNA作為微衛(wèi)星富集文庫的模板?；蚪MDNA的抽提采用 SDS/蛋白酶K裂解、酚-氯仿抽提途徑（Sambrook et al.，1999)。
[0015] 2、安徽麝微衛(wèi)星富集文庫的構(gòu)建
[0016] 利用提取基因組DNA，采用AFLP快速分離法（Fast Isolation by AFLP of Sequences Containing repeats, FIASCO)來構(gòu)建微衛(wèi)星富集文庫，具體過程如下：取基因 組DNA 250ng左右，使用Msel消化，同時與Msel的AFLP受體接頭（5, -TAC TCA GGA CTC AT-3' /5' -GAC GAT GAG TCC TGA G-3'）進行連接。將消化產(chǎn)物稀釋十倍以后，用AFLP受 體特異的引物（5'_GAT GAG TCC TGA GTAAN-3'，簡稱Msel-N)做PCR擴增。擴增產(chǎn)物在 1%的瓊脂糖凝膠電泳30min后為大于200bp的彌散帶（如圖1)。
[0017] 使用探針（AC)12或者（AG)12與酶切連接液PCR擴增片段進行雜交后，使用磁珠進 行吸附洗脫，即可獲得所需的單鏈微衛(wèi)星重復(fù)序列。以捕獲的DNA為模板，以Msel-N為引物 進行雙鏈DNA恢復(fù)。PCR反應(yīng)體積為50 μ L，反應(yīng)體系組成為：dNTP 5 μ L，Buffer 5 μ L，rTaq 0.5yL，MseI-N Primer 2yL，磁珠洗脫液5μΙ^ΡΟ?的循環(huán)設(shè)置為：95°C預(yù)變性5min;95°C 變性30sec ;60°C退火30sec ;72°C延伸45sec，進行5個循環(huán)；進行另外92°C變性30sec ; 60°C退火 30sec ;72°C延伸 45sec 的 30 個循環(huán)，72°C延伸 10min。
[0018] PCR產(chǎn)物經(jīng)PCR清潔試劑盒（Axygen)純化，并用2 %瓊脂糖-EB凝膠檢測，結(jié)果為 大于200bp的彌散帶則視為成功。將純化后的雙鏈恢復(fù)產(chǎn)物與pEASY-Tl載體（TransGen Biotech)連接后轉(zhuǎn)化于DH5-a感受態(tài)細(xì)胞（TransGen Biotech)中。將已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì) 胞涂布于添加0. 5mM IPTG和0. 5 μ g/mLX-Gal的Amp+LB平板上，在37°C下培養(yǎng)13h，得到 包含AC、AG兩種重復(fù)的微衛(wèi)星文庫。
[0019] 3、陽性克隆的篩選、測序及引物設(shè)計
[0020] 挑取白色飽滿的菌落置于Amp+LB液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)（37°C，5h)。采用三引 物PCR法（Zane et al.，2002)檢測含有微衛(wèi)星片段的陽性重組子。實驗中選用M13載體 通用引物（M13-47)和克隆對應(yīng)的無生物素標(biāo)記的探針仏〇 12八八6)12進行反應(yīng)。如果產(chǎn)物 出現(xiàn)兩條或兩條以上的條帶即可認(rèn)為該單克隆含有目的序列，反之則認(rèn)為無目的序列。通 過三引物法成功檢驗出有目的序列的陽性重組子108個，對這些重組子進行測序。
[0021] 4、序列分析、引物設(shè)計及微衛(wèi)星位點的初步篩選
[0022] 檢查測序結(jié)果，去除M13的載體序列后，使用TRF軟件（Tandem Repeats Finder, Version3. 2· 1)尋找其中含有微衛(wèi)星重復(fù)單元的序列（Benson，1999)。使用PRMER5軟件 (Lalitha，2000;Singh et al. ,1998)在重復(fù)單元序列上、下游的側(cè)翼序列中設(shè)計引物，將 目的片段設(shè)置為100_400bp之間。共選擇18個微衛(wèi)星重復(fù)位點作為備選標(biāo)記。
[0023] 5、基因分型數(shù)據(jù)的讀取和微衛(wèi)星位點的獲得
[0024] 為檢測篩選初篩得到的微衛(wèi)星位點的多態(tài)性在物種鑒定及個體識別方面的實用 性，對初選出的18個微衛(wèi)星位點的單側(cè)引物5'端進行熒光標(biāo)記（FAM/HEX/TAMRA)，然后使 用多個安徽麝個體進行擴增篩選。由于安徽麝是國家I級保護動物，數(shù)量稀少，只適宜采取 非損傷性采樣，我們利用野外拾取的糞便樣品進行DNA的抽提，抽提方法如下：將乙醇保存 的糞便破碎并混合均勻后，將lg糞便樣品轉(zhuǎn)移到15ml離心管中，10000r/min離心去乙醇。 加入10ml雙蒸水振蕩洗滌樣品10000r/min離心去上清。加入3ml裂解液（1% SDS，0. 5M EDTA，0.01M Tris-HCl)，50y 1 蛋白酶 K(20mg/ml)，混勻后 55°C 水浴 lh。10000r/min 離心 沉淀糞便殘渣后，將上層裂解液轉(zhuǎn)入裝有2g 土豆粉的離心管中，振蕩將淀粉懸浮。lOOOOr/ min離心lOmin沉淀淀粉顆粒，將上清液轉(zhuǎn)入新管。加入0. 25倍體積的NaCl (3. 5M)，0. 3 倍體積的抽提緩沖液（10% CTAB，0. 7M NaCl)，混勻后65°C水浴lOmin，使用等體積酚-氯 仿-異戊醇（25 : 24 : 1)抽提3次。加入等體積的DNA結(jié)合液混勻，4000r/min離心通 過DNA結(jié)合柱，棄廢液，使用75%乙醇，10000r/min離心洗滌DNA結(jié)合柱的濾膜2次。加入 100 μ L TE洗脫濾膜上的DNA，并離心洗脫并瓊脂糖凝膠電泳檢測（如圖2)，-20°C保存。
[0025] 擴增過程如下：首先對待選位點的PCR擴增，循環(huán)設(shè)置為：95°C預(yù)變性5 min ;95°C 變性30 sec，Tm溫度下退火30sec，72°C延伸60sec，反應(yīng)30個循環(huán)；72°C延伸lOmin。擴 增產(chǎn)物使用Tamara350熒光分子量標(biāo)準(zhǔn)在ABI 377DNA測序儀中使用聚丙烯酰胺凝膠進行 基因分型，基因分析的結(jié)果使用Genescan 2. 0軟件進行讀取。
[0026] 經(jīng)過篩選后，最終獲得9個穩(wěn)定的多態(tài)微衛(wèi)星位點，微衛(wèi)星序列如下所示：
[0027] MalOl
[0028] TAACACAACATTGTTGATCAACTACACTCTAAAATAAAATAAATATTTACAAAAAAAGTTACAAAAAAA GGAAAGGATGCCTGGAAATACAAGAACTTGTCATTGGAGTTAGACAATATGGTGGATGGGCCAACTTTCAATAGGCT TATTTTATTTCACTGACTCTATTTTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGATAACCCAAAAATCA GAGCACAAGGGAGTGAAAGTCGGTAGAAGTGGGAGGAGGGAGAGATAAGAGTGGAACGTGGGTGGTCTAAAACAAGC AAGGGCAGTAAGACAGTCCCAGGTTCCTTCTAAGTCCTGATTATTATAAACAGTGTTACAGTGAACACTGGGGTGTA TATATCTTTTCGAATTATGGTTTTCTCCAGAAGCGACCTAAATGTCCAT
[0029] MaI02
[0030] TAAATAAATAACTGCAATATTATGATAAACTCCACAAGTACAATGTTGTATATTAGGAAGTAACCCTTG AAATATTTACAGAGGAAGAAGCTTCTACCCTGTTTATGAATACTGAGAGAGTGTTTGCCAGGTAGACAAGGTCAGGT GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGCATGGGGGTGGGGGGGATATTCCAGATAGAAGGAACATGT CAAGGGCACAGAATACCATGATGAGGTTCAGGGGAAGTTCACATTTATCAACTGTGGGCAACAGGGAACCCCAAAGG TGTGAGTAGGCTAGGGAGGAACTGGATTTCTATATTAGAGGGATCTCCTTTGTGTCAGCATAGAGGTCGAATTTAGG GTTGAGAATGGGGGTAGGCATGAAGTCAAAGGCAGAAATACCAATCAAGAGGTCACTGTGATAGTCTAGGAAAGAAA TGATGAGGACCCTTATCACTTTGTCTTTCACTCAAAACTCAAACTCTCCCTGAACTTTTCCATTTCAAACAGCTCAA ATCCAAAATTTTGATAAAGTCACAGATCAGT
[0031] Mai 17
[0032] TAACTATGTTATTTTAGCATTTTTATGCACATGATTTGTATGGATTTGTAGCATTTCTGAAGTTCAGA TTAGCTTTCTAAGTGAAACTGATATGTGAAGTCAGTCATTAGTTTTCAGTCTGTTTCCTCTCCCTCTGTGTGTGTG TGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTCTTTCTCTCACTCTCAGACACACACAGATACACTTCAAGCTAGGAT AAGTTCTAAATCAAATCTCAAAAACCAATAATAAGAAAAAAGAGTGGTGCTTTCCMACAAACATCGTTTTTCTT CTCTACCCCTTTTTCTTGCTCCCTACACTGTT
[0033] Mai 32
[0034] TAATTATTTTTTCTTATGATGAGAACTTTAGAATCTACTCTCTTAGGAACTTTCAAATAAATTACTCTT TTCTTTCTCTGTGGATCTACTGACATGAGAGCCCAAAGTGCTAGGTAGTAGTTGCAACTTTTTCCTCAGTAGAATCT AGACTGGGGCTTCCCAAGTGGCTTAGTGGGTACAGAACCTGCCTGCCAATGCAGGAGATGTAAGAGATGCAGCTTCA ATCCCTGGGTCAGGAAGATCCCCTGGAGGAGGGCATGGCAACCGACTCCAATATTCTTGCCTAGTGAATCCCATGGA CAGAGGAGCCTGGCGGACTCCTGACAGAGGAGTCCATAGGGTTGCAAAGAGTCAGACACGATTGAGTCACACACACA CACACACACACACACAGAGCTTTACTTTAGTGGAAGCAACCCTCCAGTGTTCATTCAACTTACCTCTGTTGGT
[0035] Mai 48
[0036] TAACCATCACAAGAACTCTTTGAGATGGGTTACTATTATTGCACTTGGGAATATGGCTTACTTTTATAT TTATCTGAACATGCTCACTTTCTTTGCAATGAAAGTTCAATTTCCTTTACATAAGAAACAAGTGTGTGTGTGTATGT GCGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTAATGATCCCAGTGAGAAAATAATTATGTATTTATAAATGTTAG TCCTTGGCAAGTCTTTGCTGATTGCTCAGTCTATAGTCTTTTAGTTCAACAGCTTTTCAACTCCTTTTCCTGCTGGC TCAGATAAGTTCATATGCAAGCCCCAGTTCCCAGAGTAACACATGGTTCCCGGCATCCTAGTTGTCATGTAACCCTT TTGTTCCTTGACTTTTGAAAACACCAGCATCAGTGACAGAGAAATAAGCACTAAAGGGATAATCTTGAATCTGTTTT ACTTTGCTCATATGAAATTTTGCAGATGGACTACTCTAAACATTACACT
[0037] MaI75
[0038] TAAGGTAAAAAAAGGATTATACTGCAAAGGGAGGTCAAAGAGCAGCAGAGTCTAATTCTTTTTGTTTGG TATAAATGAGGTCCTGTACGGTGGCGTGGTGGTAAAGAATCTGCTTACTGATGCAGGAGATGAAATAGACATGGGTT CCATCTCTGGATTAGGAAGATCCCTTGGAGGAGGAGGAAACAGCAACGCATTCCAGTATTCTTGTCTAGAAAATTCA CGGACAGAGGAGCCTGGCAGGCTACAGTCCATGGGGCTGCAAAGAGTTGGATGCTACTGAGTGACTGAGCATGCACA CACACACACACACAAAAGCACACACACACGCACAGAAACACACACACACACATGCGTATAAGGAAAAGGTCAAAGTA CATGCAGAGAGGGGAAGAAATTGACAGAGTCAAGTATCTTGGT
[0039] Mai 79
[0040] TAAGTCACATTTACTGTTATATTAGAAGAACTACTCGTTAGCACATTTTATGCTACCATGCATGAACCC CAGTGTAACAAAGGCATCCTAGAAAATTCTTTCTCCAGAAACTCAAAACAGCTGGTGCTAGATGGTTGAGAATGCAG GCAGCTGGCTAACAACAGCTGGAGAGTATCAGCTGAGTAGCCAAGATCAGAGACAGCTGAGAGAGGCAGCCAGAGAG AAGGGCTCTCTCAAGATCATTCTGGTTCAGCAGACGGACTGCTTTTTTAGTTCAAAAAAGGAAAAGTTTCATTTTAG ACTGAACCCCAGCAATATAAATCCAAGAGTCACCAATGAGAACTCTCTCTGGAAAGGAAAACTGTTGCCTTCCTGAT TTGATCTTTTCCTGTAGCTCAAACGGTAAAGAATCTGCCTGCCATGCAGGAGACCAGGGTTCGATCCTGGATTGGTA AGTTCCTCTGGAGAAGGGAATGGCAATCCACTCTAGTATTCTTGCCTAGAGAATTCTACAGTCCGTGGGGTGGCAAA GAGTCGGACATGACTAAGCGACACACACACACCCCAGACATGAAAAACACACACACACACACGAAAAACACACACAC GAAACACACACACACACACCCAGACATGAAACACCAACCTCTGCTTCTATGT
[0041] Mai 168
[0042] TAAGGAAATTCTGTCAAATGAAGAATAGGGGTTTTAGGATCACCAGTCTCAGAAATGTTGGAAGAAAGA TAATATTTTAGAAGTAAGGGTTGGGGAAGGTTTGTCAATAGCCTTGGGTACTGAAAGAGGACAGATAATACAAGGAA CAATTGCTATGGGTATTGGGTCAGGGAATCAACAAAACAAGAGAAGGGTTGCTTAGAAGTAAGGAAGGTCAGTAAAA CCTGGATGGCATGAGCTTGCTGTTGCCAAAATCAGCAAGGCATCAAAAAGTGTGTGTCCAAAGTATTACTGGTCAGT TTCATTTATGGAACACTTACCAGAGTTATGCAAGATGGGCCCTCAGTAAGGGGGGCGGACAGAGCTGGAAAGCTGTG TGTATTCACACACACACACACACACACACACACACACACACACACAGAGTCACATTTATGTTCTGTCAAAGAAGCAG AATTGCTTGCTCAATCTAGTGTTTTGTATACCTGGAAAAGACTTTACAGCTTATGTAGTTCAACCTAGACTTAGATG TGAGAACTGAATGTTACTTGCCAGAAATACTAGGAGGTAGTACGGTATAATGGT
[0043] Mai 199
[0044] TAACTGGTTGCCCTGATTCCATCCTTGCCTTCCCTGCTTTCTGTTCTCCACTCTGGGGTAATCTTTTT CACACGTAAATCAGATTGTGTCAAATTCAGAGTTCTGATCTGGTGGTACCTCTCCTCTTGCAGAAAAATTCTGTTC AATCCCTTTGCTCTCTGGCTGTATCACACTGGCCTTTGTGATGTTCTTAGAACATGCCAAACATTTCCTGCCTTT TAGTGCCAGTATCTGAGATTTCCTCTGCTGGGGATGCACTTGTTCCAGATAGCCAAATGGTCTGGTCCTTCACTG CCTTCGGGTTTCTGCTCAAACATCTCCTCCCTAACCACCCTCTCCATGAAAAATACTCTCTCTCTCTCCCTCCCT CTCTCTCTCTCTCTCTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTTTGCTCTGATTTACTTGTCCCAGTTATTTATTATTGTGT ATCAAACCACCCTACACGGACTTCCCTAATGGTCCAGTGGTTAGGACTCTGTGTTTCCACTGCAGGGGGCACGGG TTTGATCCCTGGTGGAGGAAGTAAGATTCTGTGTGCCACGTGGTATGGCCAAAAAATAAAAGAAAACAAATCACC TCACGACTTAGTGGCT
[0045] 各位點的引物序列如下：
[0046] MaI01-F ：ATGGGCCAACTTTCAATAGG
[0047] MalOl-R ：ACCACCCACGTTCCACTCT
[0048] MaI02-F ：GAGAGTGTTTGCCAGGTAGAC
[0049] MaI02-R ：GTTGCCCACAGTTGATAAATG
[0050] MaI17-F ：ATGATTTGTATGGATTTGTAGCA
[0051] Mai17-R ：ATTATTGGTTTTTGAGATTTGATT
[0052] MaI32-F ：AATCTAGACTGGGGCTTCC
[0053] MaI32-R ：GAGGGTTGCTTCCACTAAA
[0054] MaI48-F ：GCACTTGGGAATATGGCTTAC
[0055] MaI48-R ：ATCCCTTTAGTGCTTATTTCTCTG
[0056] MaI75-F ：CGGTGGCGTGGTGGTAA
[0057] MaI75-R ：ACTCTGTCAATTTCTTCCCCTCTC
[0058] Mai79-F ：CTGTAGCTCAAACGGTAAAGAATC
[0059] MaI79-R ：CATAGAAGCAGAGGTTGGTGTT
[0060] MaII68-F ：CCAAAATCAGCAAGGCATCA
[0061] MaiI68-R ：AGTATTTCTGGCAAGTAACATTCA
[0062] MaII99-F ：ACTGCCTTCGGGTTTCTGCTC
[0063] MaiI99-R ；AAGTCCGTGTAGGGTGGTTTGATA
[0064] 7個糞便樣品均鑒定為安徽麝所有。這7個個體的基因分型數(shù)據(jù)如下表1所示：
[0065] 表1 7個個體的基因分型數(shù)據(jù)
[0066]

【權(quán)利要求】
1. 安徽麝微衛(wèi)星位點，包括9個穩(wěn)定的多態(tài)性微衛(wèi)星位點，其序列分別如SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO :9 所示。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的安徽麝微衛(wèi)星位點的引物，其序列分別如SEQ ID NO :10-SEQ ID NO :27 所示。
3. 權(quán)利要求1所述的安徽麝微衛(wèi)星位點或者權(quán)利要求2所述的引物的應(yīng)用，包括分子 生態(tài)學(xué)研究，譜系分析，種質(zhì)資源調(diào)查，輔助育種和個體識別，所述9個穩(wěn)定的多態(tài)性微衛(wèi) 星位點組合使用，或者其對應(yīng)的引物組合使用。
【文檔編號】C12Q1/68GK104087583SQ201410345129
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年7月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月21日
【發(fā)明者】張保衛(wèi), 丁玲, 王慧, 潘濤 申請人:張保衛(wèi)