磁性納米材料在促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化【技術(shù)領(lǐng)域】，公開了一種磁性納米材料在促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中的應(yīng)用。其中磁性納米材料為活性成分，其具有促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞分化成成骨細(xì)胞的作用。毒性檢測(cè)證明本發(fā)明的三氧化二鐵納米修飾的納米釕和三氧化二鐵納米修飾的納米硒磁性納米材料對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞幾乎無毒性。茜素紅和油紅O染色證明本發(fā)明制備的磁性納米材料具有促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化，抑制成脂分化的作用。本發(fā)明制備的磁性納米材料，如三氧化二鐵納米修飾的納米釕或納米硒，直接以過量的納米釕或納米硒與三氧化二鐵納米耦合，制備過程無需添加其它輔助試劑、產(chǎn)物體系簡(jiǎn)單，產(chǎn)品可直接保存和使用。
【專利說明】磁性納米材料在促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種磁性納米材料在 促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 干細(xì)胞是一類具有自我更新能力和多向分化潛能的細(xì)胞類型，它是人體新生細(xì)胞 從增殖、遷移、分化直至達(dá)到成熟這一系列過程中的第一個(gè)細(xì)胞。關(guān)于干細(xì)胞的研究已成為 目前生物學(xué)上最具挑戰(zhàn)性、也最具有吸引力的領(lǐng)域之一。干細(xì)胞按其來源可分為胚胎干細(xì) 胞和成體干細(xì)胞。而間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs，mesenehymal stem cells)就是成體干細(xì)胞的其 中一種。作為一類具有自我更新能力的成體干細(xì)胞，間充質(zhì)干細(xì)胞可以向多種細(xì)胞組織類 型分化。它不僅可以向多種間質(zhì)來源的細(xì)胞譜系分化，例如脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、 肌鍵細(xì)胞等等，也可以向其他的細(xì)胞譜系分化，比如星形膠質(zhì)細(xì)胞、肌原細(xì)胞、心肌細(xì)胞以 及神經(jīng)細(xì)胞等。由于體外分離培養(yǎng)的MSCs在細(xì)胞表型上沒有明顯的改變，也無功能缺失， 因此被認(rèn)為其對(duì)于細(xì)胞療法和組織修復(fù)工程具有重要的意義。
[0003] 在MSCs的培養(yǎng)體系中添加一定濃度的地塞米松、β -甘油磷酸鈉和抗壞血酸可以 使得人MSCs向成骨細(xì)胞方向分化。MSCs分化為成骨細(xì)胞主要需經(jīng)歷四個(gè)階段，S卩：未成熟 的骨祖細(xì)胞、成熟的骨祖細(xì)胞、前成骨細(xì)胞、成熟的成骨細(xì)胞。在此分化過程中，細(xì)胞的堿性 磷酸酶（ALP)、I型膠原、骨橋蛋白和骨鈣蛋白的表達(dá)都隨之增強(qiáng)，同時(shí)可觀察到細(xì)胞外基 質(zhì)中發(fā)生鈣鹽沉積、骨結(jié)節(jié)形成等現(xiàn)象。這一分化過程中多個(gè)因子起到了調(diào)控作用。其中 Runx2(核心結(jié)合因子）對(duì)成骨細(xì)胞的發(fā)育至關(guān)重要。此外，骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMPs, bone morphogenetic proteins)也是成骨細(xì)胞發(fā)育過程中非常重要的調(diào)節(jié)因子，它們可以促進(jìn) 較成熟的成骨細(xì)胞的分化和骨基質(zhì)的形成；但是對(duì)于處在發(fā)育早期的成骨細(xì)胞，它們卻抑 制其分化而促進(jìn)其增生。
[0004] 胰島素、IBMX(1-甲基-3-異丁基黃嘌呤）、引哚美辛的適量添加可以促進(jìn)約95% 的MSCs體外分化為脂肪細(xì)胞。其分化過程表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)富集的脂質(zhì)小泡，過氧化物 酶增殖激活受體Y、甘油-3-磷酸脫氫酶（GPDH)、脂蛋白脂酶（LPL)以及脂肪酸結(jié)合蛋白 (A2)等表達(dá)增加。
[0005] 磁性材料是一種古老而用途廣泛的功能材料。1960年Freeman等提出鐵磁性粒子 可以通過血液循環(huán)系統(tǒng)和外界磁場(chǎng)的協(xié)同作用下到達(dá)身體的某一特定組織。磁性納米顆粒 是包被葡聚糖等不同生物大分子衣的納米級(jí)氧化鐵膠體溶液，具有高熱穩(wěn)定性、低毒性和 超順磁性。因其獨(dú)特的超順磁性質(zhì)和納米特性已經(jīng)被越來越多的應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)和生物科 技的研究中，包括靶向給藥、腫瘤磁過熱療法、生物傳感器以及特異性靶點(diǎn)（如細(xì)菌、白細(xì) 胞、蛋白質(zhì)）的濃度示蹤等，具有廣闊的應(yīng)用前景和潛在的應(yīng)用價(jià)值。
[0006] 干細(xì)胞移植治療各類疾病成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)，但移植后如何從受體辨別供 體細(xì)胞，并觀察其在活體內(nèi)的生存遷徙情況一直是困擾其臨床應(yīng)用的瓶頸。隨著分子影像 學(xué)的發(fā)展，超順磁性納米鐵顆粒（SPI0)作為磁共振成像（MRI)分子探針可以標(biāo)記骨髓間充 質(zhì)干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、心肌細(xì)胞、造血細(xì)胞等，并能活體監(jiān)測(cè)細(xì)胞的遷徙，代謝和生物學(xué)行 為。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種磁性納米 材料在促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明的目的通過下述方案實(shí)現(xiàn)：
[0009] -種磁性納米材料在促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中的應(yīng)用，其中磁性納米材料為 活性成分，其具有促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞分化成成骨細(xì)胞的作用；
[0010] 所述的磁性納米材料優(yōu)選為三氧化二鐵納米修飾的納米釕和三氧化二鐵納米修 飾的納米硒中的至少一種。
[0011] 本發(fā)明中，所述的三氧化二鐵納米修飾的納米釕結(jié)構(gòu)式可表述為Fe203@R U ;所述 的三氧化二鐵納米修飾的納米硒結(jié)構(gòu)式可表述為Fe203@Se。
[0012] 本發(fā)明中，所述的三氧化二鐵納米修飾的納米釕（Fe203@Ru)，優(yōu)選通過如下方法制 備得到：
[0013] 往三氧化二鐵（Y-Fe203)納米粒子溶液中攪拌滴加三氯化釕溶液，再加入硫普 羅寧，待懸濁液由紅色變?yōu)樽攸S色，磁性分離、水洗滌，得到三氧化二鐵納米修飾的納米釕 (Fe 203@Ru)。
[0014] 所述三氧化二鐵納米粒子溶液濃度為8?15wt %。
[0015] 所述三氯化釕溶液的濃度優(yōu)選為0. 04?0. 05M。
[0016] 所述三氧化二鐵納米粒子與三氯化釕的質(zhì)量比為1:1. 5?1:2。
[0017] 所用三氯化釕與硫普羅寧的摩爾比為1:1?1:10。
[0018] 將上述制備得到的三氧化二鐵納米修飾的納米釕重懸于水中，得到Fe203@Ru懸濁 液。
[0019] 所述的水優(yōu)選為超純水或蒸餾水。
[0020] 本發(fā)明中，所述的三氧化二鐵納米修飾的納米硒，優(yōu)選通過如下方法制備得到：
[0021] 往三氧化二鐵U -Fe203)納米粒子溶液中攪拌加入亞硒酸鈉（Na2Se03)，再加入硫 普羅寧，待懸濁液由紅色變?yōu)樯罴t色，磁性分離、洗滌，得到三氧化二鐵納米修飾的納米硒 (Fe 203@Se)。
[0022] 所述三氧化二鐵納米粒子溶液濃度為8?15wt %。
[0023] 所用三氧化二鐵納米粒子與亞硒酸鈉的質(zhì)量比為1. 5:1?2:1。
[0024] 所用亞硒酸鈉與硫普羅寧的摩爾比為1:1?1:4。
[0025] 將上述制備得到的三氧化二鐵納米修飾的納米硒重懸于水中，得到Fe203@Se懸濁 液。
[0026] 所述的水優(yōu)選為超純水或蒸餾水。
[0027] 本發(fā)明的機(jī)理為：
[0028] 本發(fā)明的磁性納米材料應(yīng)用于間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化中。毒性檢測(cè)證明本發(fā)明 的Fe20 3@Ru和Fe203@Se對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞幾乎無毒性。茜素紅和油紅0染色證明本發(fā)明制備 的Fe 203@Ru和Fe203@Se具有促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化，抑制成脂分化的作用。本發(fā)明制 備的磁性納米材料，如三氧化二鐵納米修飾的納米釕或納米硒，直接以過量的納米釕或納 米硒與三氧化二鐵納米耦合，制備過程無需添加其它輔助試劑、產(chǎn)物體系簡(jiǎn)單，產(chǎn)品可直接 保存和使用。
[0029] 本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點(diǎn)及有益效果：
[0030] (1)本發(fā)明提供磁性納米材料在間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化中的應(yīng)用。
[0031] ⑵本發(fā)明制備的三氧化二鐵納米修飾的納米釕（Fe203@Ru)和三氧化二鐵納米修 飾的納米硒（Fe 203@Se)，制備過程無需添加其它輔助試劑、產(chǎn)物體系簡(jiǎn)單，產(chǎn)品可直接保存 和使用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0032] 圖1是三氧化二鐵納米修飾的納米釕和三氧化二鐵納米修飾的納米硒透視電鏡 圖。
[0033] 圖2是三氧化二鐵納米修飾的納米釕和三氧化二鐵納米修飾的納米硒對(duì)間充質(zhì) 干細(xì)胞的毒性檢測(cè)圖。
[0034] 圖3是成骨實(shí)驗(yàn)與成脂實(shí)驗(yàn)：(A)成骨誘導(dǎo)14天，細(xì)胞間可見鈣質(zhì)沉積，鈣結(jié)節(jié)形 成明顯，經(jīng)茜素紅染色呈紅色結(jié)節(jié)，（ΧΙΟ) ;(B)成脂誘導(dǎo)18天后，被誘導(dǎo)的細(xì)胞經(jīng)油紅0 染色，胞漿中脂滴呈現(xiàn)紅色（X20)。

【具體實(shí)施方式】
[0035] 下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限 于此。
[0036] 本發(fā)明所用原料的純度只要達(dá)到化學(xué)純以上即可，來源均可從市場(chǎng)購得。
[0037] 實(shí)施例1 :三氧化二鐵納米修飾的納米釕的制備
[0038] 將20mg γ _Fe203納米粒子研磨均勻后分散于160mL蒸餾水中，超聲使其均勻分散 于蒸饋水中。lmin后，在轉(zhuǎn)速為170r/min的機(jī)械攪拌速度下，滴加入4mL濃度為0. 043M的 RuC13溶液，滴加完成后，接著加入0. 28g的硫普羅寧?？梢钥吹綉覞嵋褐饾u由紅色變?yōu)樽?黃色。反應(yīng)完成后，在磁場(chǎng)作用下用蒸餾水洗滌3次，以除去未反應(yīng)的離子及生成的膠體釕 顆粒。重懸于蒸餾水中，得到Fe 203@Ru懸濁液。離心分離，超純水洗滌，產(chǎn)物于70°C條件下 干燥2天，得到三氧化二鐵納米修飾的納米硒。通過TEANAI-10型透射電子顯微鏡觀察，結(jié) 果如圖1A所示。得到納米粒子的分散體系，其粒徑在120?130nm。該納米粒子能在室溫 下穩(wěn)定存在，容易保存。
[0039] 實(shí)施例2 :三氧化二鐵納米修飾的納米硒的制備
[0040] 將20mg γ _Fe203納米粒子研磨均勻后分散于160mL蒸饋水中，超聲使其均勻分 散于蒸饋水中。lmin后，在轉(zhuǎn)速為170r/min的機(jī)械攪拌速度下，加入11. 6mg接著加入 Na2Se03,0 . 0 29g硫普羅寧。可以看到懸濁液逐漸由淺紅色變?yōu)樯罴t色。反應(yīng)完成后，在磁 場(chǎng)作用下用蒸餾水洗滌3次，以除去未反應(yīng)的離子及生成的膠體硒顆粒。重懸于蒸餾水中， 得到Fe 203@Se懸濁液。離心分離，超純水洗滌，產(chǎn)物于70°C條件下干燥2天，得到三氧化二 鐵納米修飾的納米硒。其形貌通過TEANAI-10型透射電子顯微鏡觀察，如圖1B所示。其粒 徑在160?170nm。該納米粒子能在室溫下穩(wěn)定存在，各易保存。
[0041] 實(shí)施例3 :磁性納米材料對(duì)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的毒性檢測(cè)
[0042] 本實(shí)驗(yàn)選擇購自ATCC公司的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs)。所試樣品編號(hào)為： Fe203@Ru (三氧化二鐵納米修飾的納米釕）、Fe203@Se (三氧化二鐵納米修飾的納米硒）和氟 化鈉。
[0043] (l)MTT測(cè)試方法
[0044] 取生長(zhǎng)良好的第3代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，調(diào)整活細(xì)胞濃度為2 X104/mL加于96 孔培養(yǎng)板，每孔1〇〇 μ L，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h待貼壁后，再分別加入不同濃度磁性納米材料 水溶液100 μ L，陰性對(duì)照為等體積生理鹽水，陽性對(duì)照為氟化鈉，加樣組和對(duì)照組均設(shè)4個(gè) 復(fù)孔，置37°C，5% C02培養(yǎng)72h，然后加入MTT (5mg/mL) 20 μ L/孔，5h后離心棄上清液，加入 二甲基亞砜（DMS0) 100μ L/孔，振蕩lOmin左右，用酶標(biāo)儀在570nm波長(zhǎng)下測(cè)定0D值。計(jì) 算細(xì)胞存活率。
[0045] 細(xì)胞存活率（％ )=加藥孔的實(shí)際0D值/陰性對(duì)照孔的0D值；
[0046] 取生長(zhǎng)良好的第3代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，調(diào)整活細(xì)胞濃度為2 X104/mL加于96 孔培養(yǎng)板，每孔1〇〇 μ L，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h待貼壁后，再分別加入不同濃度磁性納米材料 水溶液100 μ L，陰性對(duì)照為等體積生理鹽水，陽性對(duì)照為氟化鈉，加樣組和對(duì)照組均設(shè)4個(gè) 復(fù)孔，置37°C，5 % C02培養(yǎng)8天，每3天換液1次培養(yǎng)基，每天ΜΤΤ法檢測(cè)對(duì)照組和誘導(dǎo)組 的細(xì)胞存活數(shù)。
[0047] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。本實(shí)施例采用MTT細(xì)胞活性測(cè)定法來測(cè)定納米粒子對(duì)MSCs的 細(xì)胞毒性效應(yīng)。當(dāng)MSCs用濃度低于5 μ Μ的納米粒子培養(yǎng)72小時(shí)后，細(xì)胞活性幾乎無變 化；當(dāng)MSCs用濃度大約為40 μ Μ的納米粒子處理后，細(xì)胞活性降低了將近20%。據(jù)此，選 擇5 μ Μ的納米粒子濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。納米粒子對(duì)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的作用具有 濃度依賴性，在5 μ Μ時(shí)對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖沒有影響；40 μ Μ時(shí)對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖 有抑制作用。由圖2Β可以看出第3?8天細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，無明顯的時(shí)間依賴性。該實(shí)驗(yàn)結(jié) 果表明，本發(fā)明的Fe 203@Ru和Fe203@Se在5 μ Μ時(shí)對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖沒有影響，證明本 發(fā)明的Fe203@Ru和Fe20 3@Se在該濃度下對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞幾乎無毒性。
[0048] (2)細(xì)胞凋亡檢測(cè)分析
[0049] 取生長(zhǎng)良好的第3代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，以2X 105個(gè)/mL的密度接種于6孔 板中，選5 μ Μ濃度的Fe203@Ru和Fe203@Se作用于MSCs細(xì)胞。培養(yǎng)72h后，胰酶消化，離心 (lOOOr · mirT1，5min)用PBS洗2次，加入Annexin V/PI，避光染色15min，上流式細(xì)胞儀檢 測(cè)，分析細(xì)胞凋亡比例。本實(shí)驗(yàn)采用流式雙染法分析三種納米粒子對(duì)MSCs細(xì)胞凋亡的能 力，按實(shí)驗(yàn)方法分組如下：control，NaF，F(xiàn)e 203@Ru和Fe203@Se。結(jié)果如圖2C，橫坐標(biāo)為染料 Annexin V的熒光強(qiáng)度變化，縱坐標(biāo)為染料碘化吡啶（PI)的熒光強(qiáng)度變化。對(duì)照組細(xì)胞凋 亡率不到5%，NaF組和加藥組凋亡率沒有明顯增加，說明Fe 203@Ru和Fe203@Se不會(huì)通過凋 亡或壞死誘導(dǎo)MSCs的死亡。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明的Fe 203@Ru和Fe203@Se在5 μ Μ濃度 下對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞凋亡沒有影響，證明本發(fā)明的Fe203@Ru和Fe 203@Se對(duì)間充質(zhì)干細(xì) 胞幾乎無毒性。
[0050] (3)細(xì)胞周期檢測(cè)分析
[0051] 取生長(zhǎng)良好的第3代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，以2X 105個(gè)/mL的密度接種于6孔板 中，選5 μ Μ的Fe203@Ru和Fe203@Se作用MSCs細(xì)胞。培養(yǎng)72h后，收集培養(yǎng)細(xì)胞，1000r/min 離心5min，棄去培養(yǎng)液。用預(yù)冷PBS液重懸細(xì)胞，離心，lOOOr/min離心5min，重復(fù)兩次；將 收集的細(xì)胞團(tuán)用4°C預(yù)冷的75%乙醇固定，4°C保存，冰盒送檢。樣本上機(jī)前作如下處理： 1、將加入固定液的細(xì)胞懸液離心后，棄去固定液，用PBS洗兩次；2、加入200 μ L PI綜合染 液（ΡΗ7. 4)置4°C冰箱中，染色25min ;3、400目的篩網(wǎng)過濾1次，應(yīng)用流式細(xì)胞儀激發(fā)波長(zhǎng) 488nm，發(fā)射波長(zhǎng)630nm，檢測(cè)，計(jì)數(shù)10000個(gè)細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞周期和DNA含量分析。按實(shí)驗(yàn)方 法分組如下：control，NaF，F(xiàn)e 203@Ru 和 Fe203@Se。結(jié)果如圖 2D，F(xiàn)e203@Ru 和 Fe203@Se 不會(huì) 引起細(xì)胞周期變化。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明的Fe203@Ru和Fe20 3@Se在5 μ Μ濃度時(shí)對(duì)間充 質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞周期沒有影響，證明本發(fā)明的Fe203@Ru和Fe 203@Se對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞幾乎無 毒性。
[0052] (4)活性氧（R0S)檢測(cè)分析
[0053] 將生長(zhǎng)良好的第3代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞消化處理后接種于12孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng) 24h后分別加入5 μ Μ的Fe203@Ru和Fe203@Se置于37°C，5% C02的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72h。后 繼處理如下：1、收集細(xì)胞：用300 μ L0. 25%胰酶對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化，相同體積的培養(yǎng)液終止， 收集包括漂浮在培養(yǎng)基上的細(xì)胞；2、離心：1000r/min，5min，棄上清；3、染色：加入200μ L DCFH-DA染液，混勻，37°C避光孵育15min后利用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞內(nèi)的活性氧進(jìn)行定量檢 測(cè)。結(jié)果顯示，經(jīng)Fe 203@Ru和Fe203@Se處理后R0S水平?jīng)]有顯著變化（圖2E)。該實(shí)驗(yàn)結(jié) 果表明，本發(fā)明所述的Fe 203@Ru和Fe203@Se在5 μ Μ濃度時(shí)對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的R0S水平?jīng)]有 影響，證明本發(fā)明的Fe203@Ru和Fe 203@Se對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞幾乎無毒性。
[0054] 實(shí)施例4 :成骨實(shí)驗(yàn)
[0055] 取第3代的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，按1 X 104個(gè)/mL接種在6孔培養(yǎng)板中，37°C，5% C02飽和濕度條件下培養(yǎng)，DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，棄去培養(yǎng)基，換為成 骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中分別加入Fe 203@Ru或Fe203@Se (最終濃度為5 μ M)，對(duì)人臍帶間充 質(zhì)樣干細(xì)胞向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化，每2?3天換液1次，在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng) 狀態(tài)。后續(xù)處理如下：1、培養(yǎng)2周，棄上清，PBS洗滌3次，每次5min ;2、置4%多聚甲醛固 定10min ;3、PBS洗滌2次，每次lmin ;4、以10mg/mL茜素紅染色10min ;5、去染液，PBS洗滌 3次，置倒置顯微鏡下觀察，拍照。結(jié)果顯示成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)1周，干細(xì)胞原始形態(tài)逐漸消失， 呈多角形，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)顆粒狀物質(zhì)增多，折光性強(qiáng)，誘導(dǎo)第2周后，細(xì)胞呈集落樣生長(zhǎng)，細(xì)胞質(zhì) 內(nèi)充滿顆粒，經(jīng)茜素紅染色呈陽性反應(yīng)，細(xì)胞內(nèi)顆粒樣物質(zhì)被染成深紅色，考慮細(xì)胞內(nèi)鈣結(jié) 節(jié)形成（圖3A)。圖3A的結(jié)果表明，本發(fā)明制備的磁性納米具有促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分 化的作用，說明本發(fā)明的磁性納米能夠作為促進(jìn)干細(xì)胞成骨分化的藥物。
[0056] 實(shí)施例5 :成脂實(shí)驗(yàn)
[0057] 取第3代的人臍帶間充質(zhì)樣干細(xì)胞，細(xì)胞按1. 5 X 104個(gè)/mL接種在6孔培養(yǎng)板中， 37°C，5% C02飽和濕度條件下培養(yǎng)，DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，棄去培養(yǎng) 基，換為成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中加入Fe 203@Ru或Fe203@Se (最終濃度為5 μ M)，每3天換 液，培養(yǎng)18天，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞狀態(tài)。后續(xù)處理如下：1、棄上清，PBS洗滌3次，每 次5min ;2、置4%多聚甲醒固定lOmin ;3、PBS洗漆2次，每次lmin ;4、新鮮配制5mg/ml油 紅0染色30min ;5、去染液，70%乙醇浸洗2min，PBS洗滌2次，倒置顯微鏡下觀察，拍照。結(jié) 果顯示細(xì)胞內(nèi)空泡折光性強(qiáng)，出現(xiàn)在成脂誘導(dǎo)5天，意味著小脂滴已形成，約18天后細(xì)胞內(nèi) 空泡樣變?cè)黾?，部分出現(xiàn)相互融合，干細(xì)胞的形態(tài)也發(fā)生改變，細(xì)胞由長(zhǎng)梭形變短、變粗，油 紅"0"染色顯示細(xì)胞內(nèi)有大量脂質(zhì)被染為紅色（圖3B)。圖3B的結(jié)果表明，本發(fā)明制備的 磁性納米具有抑制間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化的作用，說明本發(fā)明的磁性納米能夠作為抑制干 細(xì)胞成脂分化的藥物。
[0058] 上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1. 一種磁性納米材料在促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中的應(yīng)用，其特征在于：其中磁性 納米材料為活性成分，其具有促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞分化成成骨細(xì)胞的作用。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的磁性納米材料在促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中的應(yīng)用，其特 征在于：所述的磁性納米材料為三氧化二鐵納米修飾的納米釕和三氧化二鐵納米修飾的納 米硒中的至少一種。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的磁性納米材料在促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中的應(yīng)用，其特 征在于：所述的三氧化二鐵納米修飾的納米釕通過如下方法制備得到：往三氧化二鐵納米 粒子溶液中攪拌滴加三氯化釕溶液，再加入硫普羅寧，待懸濁液由紅色變?yōu)樽攸S色，磁性分 離、水洗滌，得到三氧化二鐵納米修飾的納米釕。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的磁性納米材料在促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中的應(yīng)用，其 特征在于：所述三氧化二鐵納米粒子溶液濃度為8?15wt % ;所述三氯化釕溶液的濃度為 0. 04?0. 05M ;所述三氧化二鐵納米粒子與三氯化釕的質(zhì)量比為1:1. 5?1:2 ;所用三氯化 釕與硫普羅寧的摩爾比為1:1?1:10。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的磁性納米材料在促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中的應(yīng)用，其特 征在于：所述的三氧化二鐵納米修飾的納米硒通過如下方法制備得到：往三氧化二鐵納米 粒子溶液中攪拌加入亞硒酸鈉，再加入硫普羅寧，待懸濁液由紅色變?yōu)樯罴t色，磁性分離、 洗滌，得到三氧化二鐵納米修飾的納米硒。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的磁性納米材料在促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中的應(yīng)用，其特 征在于：所述三氧化二鐵納米粒子溶液濃度為8?15wt% ;所用三氧化二鐵納米粒子與亞 硒酸鈉的質(zhì)量比為1. 5:1?2:1 ;所用亞硒酸鈉與硫普羅寧的摩爾比為1:1?1:4。
【文檔編號(hào)】C12N5/0775GK104099295SQ201410320190
【公開日】2014年10月15日 申請(qǐng)日期:2014年7月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月7日
【發(fā)明者】劉杰, 劉瑩, 劉亞楠, 鄭楚萍 申請(qǐng)人:暨南大學(xué)