小麥甲硫氨酸亞砜還原酶基因TaMsrB3.1及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種小麥山融3號甲硫氨酸亞砜還原酶基因TaMsrB3.1。本發(fā)明還公開了所述基因TaMsrB3.1在擬南芥和小麥植株中提高其抗鹽/耐旱性的應(yīng)用。實驗結(jié)果表明，本發(fā)明所述轉(zhuǎn)基因植株比非轉(zhuǎn)基因植株的抗鹽/耐旱能力得到了很大程度的提高，為通過基因工程手段提高作物抗鹽/耐旱性提供了理論依據(jù)和實踐基礎(chǔ)。
【專利說明】小麥甲硫氨酸亞砜還原酶基因 TaMsrB3. 1及其應(yīng)用 【技術(shù)領(lǐng)域】
[〇〇〇1] 本發(fā)明屬于生物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種小麥甲硫氨酸亞砜還原酶基因 TaMsrB3. 1及其應(yīng)用。 【背景技術(shù)】
[0002] 干旱和高鹽等逆境是限制植物產(chǎn)量的重要因素。因此，鑒定抗逆相關(guān)基因用于作 物改良是未來抗逆育種的關(guān)鍵策略之一。Msr能被多種非生物脅迫誘導(dǎo)表達，而且MSR可以 清除機體內(nèi)過量的R0S，也可以體外催化因 R0S氧化的R和S型MetSO的還原，暗示其在植 物脅迫應(yīng)答中發(fā)揮作用。
[0003] 小麥作為世界上最重要的糧食作物之一，提高小麥產(chǎn)量一直是科研和育種工作者 們最為關(guān)注的研究課題。然而，近年來農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境不斷惡化，許多土地處于干旱、鹽漬、沼 澤、冷土等逆境中，干旱脅迫與鹽脅迫尤其嚴重影響作物生長發(fā)育和產(chǎn)量。因此加強小麥應(yīng) 對各種非生物脅迫的能力是提高小麥產(chǎn)量最為有效的途徑之一。本實驗室前期將小麥近緣 禾草中耐逆性極強的長穗偃麥草的染色質(zhì)漸滲入小麥濟南177的基因組，創(chuàng)制了一批抗逆 新種質(zhì)資源并從中選育出高產(chǎn)/耐鹽小麥新品種山融3號（SR3)。前期的鹽旱處理SR3幼 苗構(gòu)建的cDNA芯片顯示其中的TaMsrB3. 1有顯著響應(yīng)。Msr在擬南芥、水稻以及一些其他 植物中抗脅迫方面的作用已有初步結(jié)果，但在主要糧食作物小麥中該基因的克隆、功能驗 證尚未見報道。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種抗鹽和抗旱相關(guān)基因一小麥甲硫氨酸亞砜還原酶基 因 TaMsrB3. 1，以及利用該基因在提高植株抗鹽/耐旱性中的應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案是：從小麥山融3號（SR3)中分離得到小麥甲硫氨酸亞砜還原 酶基因 TaMsrB3. 1，在植物真核系統(tǒng)擬南芥中驗證其功能，再在轉(zhuǎn)化小麥實驗中驗證其提高 抗鹽和抗旱性。
[0006] 本發(fā)明所述的小麥甲硫氨酸亞砜還原酶基因 TaMsrB3. 1，其特征在于：所述基因 cDNA序列如SEQ ID No. 1所示。其中，所述小麥是山融3號小麥。
[0007] 本發(fā)明在小麥中克隆的甲硫氨酸亞砜還原酶基因 TaMsrB3. 1與其他物種中的類 似基因相比同源性在40?75%之間。對其保守區(qū)分析發(fā)現(xiàn)，小麥中甲硫氨酸亞砜還原酶基 因 TaMsrB3. 1推導(dǎo)的氨基酸序列含有兩個保守的CxxC，這兩個CxxC用于結(jié)合Zn2+，為酶的 熱穩(wěn)定性和催化活性所必須。和其它同類基因相比，也存在保守序列的多態(tài)性，比如在除了 以上兩個功能相關(guān)的保守序列外，TaMsrB3. 1存在其它位點保守序列的差異，這暗示在小麥 中該基因功能上的分化。
[0008] 本發(fā)明所述小麥甲硫氨酸亞砜還原酶基因 TaMsrB3. 1在提高植株抗鹽/耐旱性中 的應(yīng)用。
[0009] 實驗證實：在逆境處理的條件下，無論是鹽還是旱處理，轉(zhuǎn)入本發(fā)明所述基因 TaMsrB3. 1的植株過表達系的根長相比于野生型差異明顯，在逆境下生長良好，說明該基因 的轉(zhuǎn)化的確增強了植株（小麥）抗鹽/旱的能力。
[〇〇1〇] 本發(fā)明的有益效果：利用現(xiàn)有的植物基因工程技術(shù)，本發(fā)明首次克隆得到了小麥 SR3甲硫氨酸亞砜還原酶基因 TaMsrB3. 1并進行了功能驗證。通過不同誘導(dǎo)子處理顯示該 基因與抗鹽和抗旱密切相關(guān)。故對于該基因 TaMsrB3. 1的研究具有重要理論意義和應(yīng)用前 旦 -5^ 〇 【專利附圖】

【附圖說明】
[0011] 圖 1 :TaMsrA2. 1 基因的cDNA 電泳圖，其中：M為DNAMarker，泳道 1-3 為TaMsrB3. 1 的 cDNA。
[0012] 圖2 :轉(zhuǎn)TaMsrB3. 1基因的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株篩選，綠苗為轉(zhuǎn)基因植株。
[0013] 圖3 :甲硫氨酸亞砜還原酶基因 TaMsrB3. 1在轉(zhuǎn)基因擬南芥中RealTime-PCR表達 分析，Clo-Ο為野生型擬南芥，0E1和2為不同轉(zhuǎn)基因純系。
[0014] 圖4 :轉(zhuǎn)基因的擬南芥中甘露醇處理分析，WT為野生型，0E1和0E2為 RealTime-PCR分析的過表達系。
[0015] 圖5 :轉(zhuǎn)基因的擬南芥中NaCl處理分析，WT為野生型，0E1和0E2為過表達系。
[0016] 圖6 :轉(zhuǎn)基因的擬南芥中控水試驗的析，WT為野生型，0E1和0E2為過表達系。
[0017] 圖7 :轉(zhuǎn)基因小麥PCR篩選電泳結(jié)果，1-22為不同轉(zhuǎn)基因植株，PC為陽性對照，NC 為陰性對照，Μ為DNA Marker。 【具體實施方式】
[0018] 實施例1、TaMsrB3. 1的克隆
[0019] 1. 1提取小麥SR3總RNA
[0020] (1)將SR3植物材料放入研缽中，加入液氮將其研磨成粉；
[0021] (2)待液氮揮發(fā)后，取約100-200mg粉末轉(zhuǎn)入到1. 5ml離心管中，加入1ml Trizol 提取液，渦旋震蕩使樣品充分溶入提取液中，室溫靜置5min ;
[0022] (3)4°C，12, OOOrpm，離心lOmin后，取0· 9ml上清液轉(zhuǎn)移到新的1. 5ml離心管中， 再加入0. 2ml氯仿劇烈振蕩混勻15sec，室溫靜置2-5min ;
[0023] (4)4°C，12, OOOrpm，離心lOmin后，取0· 4ml上清液轉(zhuǎn)移到新的1. 5ml離心管中， 加入0. 4ml異丙醇后混勻，室溫靜置15mim ;
[0024] (5)4°C，12, OOOrpm，離心lOmin,棄上清，用1Π11751%的乙醇洗漆沉淀兩次后，于 4°C，8, OOOrpm，離心 5min ;
[0025] (6)棄上清，開蓋于超凈工作臺中上干燥RNA約2_5min，加入40 μ 1 RNase-Free 水，在60°C中充分溶解RNAlOmin ;
[0026] (7)用紫外分光光度計測RNA樣品的0D值和濃度，A26(i/A28(i達到1. 7-2. 0為佳；瓊 脂糖凝膠電泳檢測的質(zhì)量。
[0027] 1. 2cDNA第一鏈的合成
[0028] (1)向離心管中依次加入下列物質(zhì)（40 μ 1反應(yīng)體系）：
[0029]
[0030]
【權(quán)利要求】
1. 一種小麥甲硫氨酸亞砜還原酶基因 TaMsrB3. 1，其特征在于：所述基因 cDNA的核苷 酸序列如SEQ ID No. 1所示。
2. 如權(quán)利要求1所述小麥甲硫氨酸亞砜還原酶基因 TaMsrB3. 1，其特征在于：所述小麥 是山融3號小麥。
3. 權(quán)利要求1所述小麥甲硫氨酸亞砜還原酶基因 TaMsrB3. 1在提高植株抗鹽/耐旱性 中的應(yīng)用。
4. 如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于：所述植株是小麥或擬南芥。
【文檔編號】C12N15/84GK104046639SQ201410313216
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2014年7月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月2日
【發(fā)明者】陳凡國, 黃舒, 丁鵬程, 張尚立, 夏光敏 申請人:山東大學(xué)