一種人胸腺瘤細(xì)胞系及其用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種人胸腺瘤細(xì)胞系及其用途，屬于腫瘤生物學(xué)領(lǐng)域，人胸腺瘤細(xì)胞系,命名為Thy0517，在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的保藏號(hào)為CGMCC?No.9328。本發(fā)明的一種人胸腺瘤細(xì)胞系Thy0517主要優(yōu)勢在于：與原發(fā)腫瘤組織有著相似的蛋白表達(dá)，同時(shí)也具有染色體異常核型，具有體外成瘤能力的腫瘤細(xì)胞特性。可在體外連續(xù)傳代培養(yǎng)而保持胸腺瘤腫瘤細(xì)胞特性不變，適合作為研發(fā)胸腺瘤相關(guān)藥物的細(xì)胞材料。本發(fā)明的細(xì)胞系表達(dá)EGFR陽性，EGFR陽性表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、血管生成、粘附、侵襲和轉(zhuǎn)移，此細(xì)胞系可以用來作為一個(gè)研究以EGFR作為靶標(biāo)的靶向藥物研究的有力的工具細(xì)胞。
【專利說明】一種人胸腺瘤細(xì)胞系及其用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種人胸腺瘤細(xì)胞系及其用途，屬于腫瘤生物學(xué)領(lǐng)域，尤其是涉及一 種人胸腺瘤細(xì)胞系Thy0517及其用途。

【背景技術(shù)】
[0002] 胸腺是免疫系統(tǒng)的中樞器官，是T細(xì)胞發(fā)育、分化和成熟的場所，其功能是將部分 淋巴細(xì)胞分化成T淋巴細(xì)胞。胸腺和人體其他器官一樣，可發(fā)生良性或惡性腫瘤。胸腺瘤 是前縱膈最常見的腫瘤，占成人前縱膈腫瘤的30%，是起源于胸腺上皮或顯示向胸腺上皮 細(xì)胞分化的腫瘤（不論非腫瘤性淋巴細(xì)胞是否存在）。胸腺瘤在中國發(fā)病率較高，好發(fā)于 55-56歲年齡組。雖然胸腺瘤患者死亡率低，但胸腺瘤患者第二種癌的發(fā)生率增加。在臨床 特征上，胸腺瘤常伴有重癥肌無力、純紅再障、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病。胸腺瘤 患者中約有1/4患者伴發(fā)重癥肌無力。胸腺瘤的形成引起胸腺微環(huán)境的改變，有可能是胸 腺瘤合并重癥肌無力的原因，胸腺瘤伴重癥肌無力病情通常比單純重癥肌無力嚴(yán)重，需要 依賴免疫抑制劑治療。胸腺瘤病因尚不清楚，有研究報(bào)道EB病毒在胸腺瘤發(fā)病中起著一定 作用。
[0003] 為了研究腫瘤的生物學(xué)特性，評(píng)價(jià)體外模型的適應(yīng)性，腫瘤細(xì)胞系已經(jīng)成為一種 重要的研究工具。近幾十年來，大量的人腫瘤細(xì)胞系被分離并用于長期培養(yǎng)，這些細(xì)胞系為 腫瘤的分子水平研究提供了重要的模型。但由于胸腺瘤組織的特殊性、有效可用的胸腺瘤 標(biāo)本的缺乏以及建立連續(xù)性細(xì)胞培養(yǎng)的技術(shù)困難，致使科研人員長久以來一直無法獲取胸 腺瘤細(xì)胞系，極大地限制了胸腺瘤細(xì)胞學(xué)水平的研究。
[0004] 由于缺乏胸腺瘤體外研究模型，尤其是缺乏胸腺瘤細(xì)胞系，所以導(dǎo)致胸腺瘤的體 外功能檢測只能受限于有限的短期原代培養(yǎng)。針對這些有限的短期原代培養(yǎng)物，研究人員 分析了胸腺瘤的微衛(wèi)星不穩(wěn)定狀態(tài)。一些學(xué)者從分子機(jī)理水平開展了一項(xiàng)針對胸腺瘤的靶 向治療策略的評(píng)價(jià)，免疫組織化學(xué)顯示表皮生長因子受體（EGFR)在胸腺瘤中表達(dá)增高，在 一些病人中EGFR靶向治療是有效的。也有學(xué)者將EGFR抑制劑用于胸腺瘤的治療，而且還 有學(xué)者發(fā)現(xiàn)環(huán)氧合酶-2 (C0X-2)或KIT基因可能會(huì)成為胸腺瘤二線化療的靶點(diǎn)。這些初步 研究表明，部分靶向藥物對胸腺瘤治療有效，但是由于缺乏體外胸腺瘤細(xì)胞系的功能檢測， 很多新的靶向治療能用于其他腫瘤，但在胸腺瘤中還未進(jìn)行。因此，為了更好地在體外對胸 腺瘤的分子信號(hào)傳導(dǎo)通路進(jìn)行研究，需要建立可長期反復(fù)使用的胸腺瘤細(xì)胞系。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種能夠在體外長期傳代培養(yǎng)的、性質(zhì)穩(wěn)定的一種人胸腺瘤 細(xì)胞系。
[0006] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種人胸腺瘤細(xì)胞系制備胸腺瘤診斷試劑的用途。
[0007] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種人胸腺瘤細(xì)胞系制備胸腺瘤動(dòng)物模型的用途。
[0008] 本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種人胸腺瘤細(xì)胞系作為藥物靶點(diǎn)用于開發(fā)抑制胸 腺瘤藥物的用途。
[0009] 本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供一種人胸腺瘤細(xì)胞系用于胸腺瘤的體外研究的用途。
[0010] 本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：
[0011] 一種人胸腺瘤細(xì)胞系，命名為Thy0517,在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通 微生物中心的保藏號(hào)為CGMCC No. 9328。
[0012] 一種人胸腺瘤細(xì)胞系Thy0517制備胸腺瘤診斷試劑的用途。
[0013] 一種人胸腺瘤細(xì)胞系Thy0517制備胸腺瘤動(dòng)物模型的用途。
[0014] 一種人胸腺瘤細(xì)胞系Thy0517作為藥物靶點(diǎn)用于開發(fā)抑制胸腺瘤藥物的用途。
[0015] 一種人胸腺瘤細(xì)胞系Thy0517用于胸腺瘤的體外研究的用途。
[0016] 本發(fā)明的一種人胸腺瘤細(xì)胞系Thy0517主要優(yōu)勢在于：
[0017] (1)本發(fā)明細(xì)胞系與原發(fā)腫瘤組織有著相似的蛋白表達(dá)，同時(shí)也具有染色體異常 核型，具有體外成瘤能力的腫瘤細(xì)胞特性。
[0018] (2)本發(fā)明的細(xì)胞系可在體外連續(xù)傳代培養(yǎng)而保持胸腺瘤腫瘤細(xì)胞特性不變，適 合作為研發(fā)胸腺瘤相關(guān)藥物的細(xì)胞材料。
[0019] (3)本發(fā)明的細(xì)胞系EGFR表達(dá)陽性，EGFR陽性表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、血管 生成、粘附、侵襲和轉(zhuǎn)移，此細(xì)胞系可以用來作為一個(gè)研究以EGFR作為靶標(biāo)的靶向藥物研 究的有力的工具細(xì)胞。
[0020] 本發(fā)明的一種人胸腺瘤細(xì)胞系，命名為Thy0517,已于2014年6月25日保藏在中 國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（CGMCC)，其保藏編號(hào)為CGMCC No. 9328,建 議的分類名為：胸腺瘤細(xì)胞系。并已存活。保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)， 中國科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼100101。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021] 圖1為本發(fā)明一種人胸腺瘤細(xì)胞系Thy0517 (CGMCC No. 9328)倒置光學(xué)顯微鏡下 生長的細(xì)胞圖像（200倍）。
[0022] 圖2為本發(fā)明一種人胸腺瘤細(xì)胞系Thy0517 (CGMCC No. 9328)的細(xì)胞生長曲線。
[0023] 圖3為本發(fā)明一種人胸腺瘤細(xì)胞系Thy0517 (CGMCC No. 9328)的染色體的一種影 像圖。
[0024] 圖4為本發(fā)明一種人胸腺瘤細(xì)胞系Thy0517 (CGMCC No. 9328)種植在BALB/C免疫 缺陷裸鼠腋部皮下移植瘤組織的形態(tài)圖（HE染色，200倍）。

【具體實(shí)施方式】
[0025] 以下通過附圖和具體實(shí)施例詳細(xì)說明本發(fā)明技術(shù)方案，以下實(shí)施例僅用以說明本 發(fā)明的技術(shù)方案而并不以此限定本發(fā)明的實(shí)施范圍。
[0026] 實(shí)施例1人胸腺瘤細(xì)胞系的建立
[0027] 本發(fā)明人胸腺瘤細(xì)胞系Thy0517是一株中國北方人AB型胸腺瘤的細(xì)胞系，來源于 一位50歲男性胸腺瘤合并重癥肌無力患者的胸腺瘤組織?；颊咴诮邮苁中g(shù)前未接受任何 化療、放療等治療。人胸腺瘤細(xì)胞系Thy0517,是從病理類型為AB型胸腺瘤的胸腺瘤病人胸 腺瘤組織切除物中培養(yǎng)所得。
[0028] 具體步驟為：
[0029] (1)組織塊機(jī)械分離：將手術(shù)切除的胸腺瘤組織以無菌剪刀和手術(shù)刀迅速分離到 0. 5立方厘米大小，用含100U/ml青霉素、100ug/ml鏈霉素的PBS緩沖液浸泡低溫移至生物 安全柜,再用含l〇〇U/ml青霉素、100ug/ml鏈霉素的PBS緩沖液反復(fù)清洗組織，再浸泡于含 10(^/1111青霉素、1001^/1111鏈霉素、10%胎牛血清的高糖01^1培養(yǎng)基中，用無菌剪刀輕柔分 離，盡量去除包膜和結(jié)締組織，得到胸腺瘤實(shí)質(zhì)組織；
[0030] (2)組織塊接種：使用無菌剪刀把步驟（1)所得的組織剪成1立方毫米的組織塊， 用含100U/ml青霉素、100ug/ml鏈霉素的PBS緩沖液清洗組織塊。讓組織塊沉淀，去除上清 液，在含l〇〇U/ml青霉素、100ug/ml鏈霉素、10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中懸浮組織 塊，用無菌眼科鑷子輕柔夾取腫瘤組織，送入25平方厘米細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，用彎頭吸管將組 織塊在瓶底上均勻攤開，每小塊間隔5mm左右，共鋪入20塊，鋪完組織塊后，置37°C，5% C02 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)至組織塊貼附，再緩慢向培養(yǎng)瓶中加5ml含100U/ml青霉素、lOOug/ ml鏈霉素、10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，得到組織塊游出細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)，直 至細(xì)胞融合度達(dá)80%以上；
[0031] (3)對步驟（2)所得的游出細(xì)胞進(jìn)行純化，去除成纖維細(xì)胞等雜質(zhì)細(xì)胞，純化后 的胸腺瘤細(xì)胞在含l〇〇U/ml青霉素、100ug/ml鏈霉素、10%胎牛血清的高糖01^1培養(yǎng)基 中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37°C，氣體環(huán)境為5% C02,95%空氣，濕度為飽和濕度，每2天更換一 次培養(yǎng)液，每4天傳代一次，連續(xù)培養(yǎng)并傳代超過12個(gè)月，得到細(xì)胞系，命名為Thy0517。 將細(xì)胞系保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（CGMCC)，其保藏編號(hào)為 CGMCCNo. 9328。
[0032] 實(shí)施例2人胸腺瘤細(xì)胞系Thy0517的檢測鑒定
[0033] 1、形態(tài)觀察
[0034] 主要觀察細(xì)胞的一般形態(tài)，如大體形態(tài)，核漿比例、粘附特性等。
[0035] 倒置光學(xué)相差顯微鏡下觀察人胸腺瘤細(xì)胞系Thy0517如圖1所示，可見細(xì)胞呈多 角形，核大，胞漿豐富，細(xì)胞間連接緊密，貼壁生長。
[0036] 2、免疫細(xì)胞化學(xué)檢測細(xì)胞標(biāo)記蛋白
[0037] 采用SP法進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，免疫細(xì)胞化學(xué)染色SP試劑盒及抗體購自北京 中杉金橋生物技術(shù)有限公司，所用的抗體為：CK7、CK8/18、CK19、CK-pan、CD24、BCL-2、P63、 Vimentin、EMA、EGFR 和 CD99。
[0038] 具體步驟按試劑盒說明書進(jìn)行：在顯微鏡下觀察染色結(jié)果。
[0039] 免疫組化檢測結(jié)果判斷方法：+++，>70 %陽性細(xì)胞；++，30 % -70 %陽性細(xì)胞；+， 〈30%陽性細(xì)胞；一，陰性反應(yīng)。
[0040] 本發(fā)明人胸腺瘤細(xì)胞系Thy0517的免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示，人胸腺瘤細(xì)胞系 Thy0517與來源的胸腺瘤組織有著相似的蛋白表達(dá)，其突出的表達(dá)特征為EGFR陽性表達(dá)， 這是一個(gè)表皮生長因子受體，其陽性表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、血管生成、粘附、侵襲和 轉(zhuǎn)移，Thy0517可以用來作為一個(gè)研究以EGFR作為靶標(biāo)的靶向藥物研究的有力的工具細(xì) 胞。
[0041] 3、細(xì)胞計(jì)數(shù)法繪制細(xì)胞生長曲線
[0042] (1)待檢測的細(xì)胞系用0· 25%胰蛋白酶消化后，用含100U/ml青霉素、100ug/ml鏈 霉素、10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為8000個(gè)/ml，接種到2個(gè)24孔板中 的36個(gè)孔中，每孔加入lml細(xì)胞懸液；
[0043] (2)從接種時(shí)間起，每隔24小時(shí)棄去3孔中的培養(yǎng)基，加入0.25%胰蛋白酶消化， 混懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)3孔內(nèi)的細(xì)胞密度的平均值，每孔計(jì)數(shù)3次，取平均值，其余孔內(nèi)的細(xì)胞繼 續(xù)培養(yǎng)，直至第12日；自始至終每2天更換一次培養(yǎng)基。
[0044] (3)繪制細(xì)胞生長曲線：以培養(yǎng)時(shí)間（天數(shù)）為橫坐標(biāo)，細(xì)胞數(shù)目為縱坐標(biāo)，標(biāo)出 各對應(yīng)點(diǎn)并連成線，就可獲得細(xì)胞生長曲線。
[0045] 本發(fā)明人胸腺瘤細(xì)胞系Thy0517的生長曲線如圖2所示，其對數(shù)生長期為6天。
[0046] 根據(jù)細(xì)胞生長曲線計(jì)算本發(fā)明人胸腺瘤細(xì)胞系Thy0517的細(xì)胞群體倍增時(shí)間為 37h。
[0047] 4、細(xì)胞核型分析
[0048] 檢測核型特點(diǎn)、染色體數(shù)量等。
[0049] (1)將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞加入秋水仙素，使秋水仙素終濃度0. lug/ml，繼續(xù) 培養(yǎng)3h ;
[0050] (2)將細(xì)胞消化后轉(zhuǎn)入10ml尖頭離心管，lOOOrpm，離心lOmin，去上清，加入 0.075mol/L的KC110ml，37°C孵育30min后，再向離心管內(nèi)加入新鮮固定液（冰醋酸（v): 甲醇（v) = 3:1) lml,混勻，lOOOrpm，離心 lOmin，去上清；
[0051] (3)緩緩加入新鮮固定液10ml，輕輕吹勻，室溫固定20min，離心，去上清，再固定； lOOOrpm，離心lOmin，棄上清；
[0052] (4)加入新鮮固定液250ul，輕輕吹勻得懸液，在距離載玻片15cm的高度，滴一滴 懸液，空氣充分干燥，新鮮Giemsa染色，自來水沖洗，晾干后二甲苯透明，中性樹膠封固，油 鏡下觀察染色體形態(tài)并計(jì)數(shù)。
[0053] 本發(fā)明人胸腺瘤細(xì)胞系Thy0517的染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目均表現(xiàn)異常，呈異倍體或 多倍體，計(jì)數(shù)和分析1〇〇個(gè)細(xì)胞分裂相，染色體數(shù)目分布在27-138條之間，染色體眾數(shù)為 65-70條，主干系為亞三倍體。如圖3所示。
[0054] 5、異體動(dòng)物接種
[0055] 向異體動(dòng)物體內(nèi)接種細(xì)胞懸液，觀察成瘤能力。
[0056] (1)向編號(hào)為1、2、3、4、5的5只4周齡的BALB/C裸鼠（購于中國人民解放軍軍事 醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）的消毒前肢腋下皮膚，注射人胸腺瘤細(xì)胞系Thy0517懸液，每只 1〇〇萬個(gè)人胸腺瘤細(xì)胞，注射后輕輕按壓，勿使流出；
[0057] (2)第14天，5只裸鼠均在注射區(qū)域出現(xiàn)一直徑2mm的白色突起，第30天，可見腫 瘤呈分葉狀生長，腫瘤長徑為15mm-18mm，麻醉后處死裸鼠，取出編號(hào)為2號(hào)的移植瘤組織 經(jīng)包埋切片HE染色形態(tài)如圖4所示，可見異種移植的細(xì)胞核大深染，核仁明顯，具有腫瘤細(xì) 胞的特征。
[0058] 制備篩選出具有抑制和殺傷Thy0517細(xì)胞的抗體，以此抗體作為抗胸腺瘤藥物的 主要成分。
[0059] 本發(fā)明人胸腺瘤細(xì)胞系Thy0517的用途，還包括但不限于以下用途：
[0060] 人胸腺瘤細(xì)胞系Thy0517制備胸腺瘤診斷試劑的用途。
[0061] 人胸腺瘤細(xì)胞系Thy0517用于胸腺瘤的體外研究的用途。
[0062] 人胸腺瘤細(xì)胞系Thy0517能在體外連續(xù)長期傳代，在體外培養(yǎng)一年半，傳代150多 代，細(xì)胞仍然生長增殖活躍。
【權(quán)利要求】
1. 一種人胸腺瘤細(xì)胞系，其特征在于，命名為Thy0517,在中國微生物菌種保藏管理委 員會(huì)普通微生物中心的保藏號(hào)為CGMCC No. 9328。
2. 權(quán)利要求1所述的一種人胸腺瘤細(xì)胞系制備胸腺瘤診斷試劑的用途。
3. 權(quán)利要求1所述的一種人胸腺瘤細(xì)胞系制備胸腺瘤動(dòng)物模型的用途。
4. 權(quán)利要求1所述的一種人胸腺瘤細(xì)胞系作為藥物靶點(diǎn)用于開發(fā)抑制胸腺瘤藥物的 用途。
5. 權(quán)利要求1所述的一種人胸腺瘤細(xì)胞系用于胸腺瘤的體外研究的用途。
【文檔編號(hào)】C12N5/09GK104087554SQ201410312866
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年7月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月2日
【發(fā)明者】張鵬, 王元國 申請人:張鵬