一種α-酮酸脫羧酶KIVD-LL及其編碼基因和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種α-酮酸脫羧酶KIVD-LL及其編碼基因和應(yīng)用。α-酮酸脫羧酶KIVD-LL的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。α-酮酸脫羧酶編碼基因kivd-LL的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。本發(fā)明通過基因工程的方法，獲得了對α-酮異戊酸與α-酮異已酸均具有較高脫羧活力的α-酮酸脫羧酶KIVD-LL，該酶在生物合成異戊醇工業(yè)中具有較大的應(yīng)用潛力。
【專利說明】-種α -酮酸脫羧酶Kl VD-LL及其編碼基因和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種α -酮酸脫羧酶KIVD-LL及其編碼基因 和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】：
[0002] 長鏈醇類不僅是一種重要的化工原料，用于有機(jī)合成，同時也被認(rèn)為一類新興的 能源替代品。3-甲基-1-丁酮（異戊醇），是酒精發(fā)酵副產(chǎn)物"雜醇油"的主要成分，其在 化學(xué)制藥、溶劑、香精、有機(jī)合成等行業(yè)有著非常廣泛的用途。異戊醇是我國規(guī)定允許使用 的香精，也可以用合成鎮(zhèn)靜催眠藥，還是應(yīng)用廣泛的有機(jī)溶劑和化學(xué)分析試劑。此外，作為 新興燃料，異戊醇比乙醇、丙醇、丁醇和正異醇具有更良好的燃料特性。
[0003] 長鏈醇的合成主要有生物合成法和化學(xué)合成法，由于生物合成的安全性和環(huán)保性 而倍受人們關(guān)注。長鏈醇的生物合成主要依賴于微生物中的Ehrlich途徑，該途徑包括轉(zhuǎn) 氨作用、脫羧反應(yīng)、還原反應(yīng)等三個步驟。合成長鏈醇的轉(zhuǎn)氨作用是將氨基酸的氨基基團(tuán)轉(zhuǎn) 移后生成代謝過程中間產(chǎn)物一各類α-酮酸。這些α-酮酸成為不同酮酸脫羧酶作用的底 物，生成相應(yīng)的醛類物質(zhì)，接著通過氧化或還原反應(yīng)進(jìn)一步生成終產(chǎn)物酸或者醇，酮酸脫羧 酶的脫羧反應(yīng)是Ehrlich途徑中的關(guān)鍵反應(yīng)步驟。
[0004] 目前已知的酮酸脫羧酶多數(shù)存在于酵母、真菌等微生物中，在細(xì)菌中也有發(fā)現(xiàn)。近 年來，對酵母中各類酮酸脫羧酶已經(jīng)有了初步的了解，這些酶的功能也陸續(xù)得到驗證。目 前，已經(jīng)鑒定出一系列來源于不同微生物的酮酸脫羧酶，根據(jù)其功能與作用特點進(jìn)行了分 類，初步分為丙酮酸脫羧酶（EC4. 1. 1. 1)，苯丙酮酸脫羧酶（EC4. 1. 1. 43)，支鏈-2-酮基脫 羧酶（EC4. 1. 1. 72)，2-氧戊二酸脫酶（酮戊二酸）（EC4. 1. 1. 71)，吲哚-3-丙酮酸脫羧酶 (EC4. 1. 1. 74)等。由于其底物作用的高度特異性，支鏈-2-酮基脫羧酶成為支鏈醇生物合 成的限速酶。
[0005] 除了對這些酮酸脫羧酶進(jìn)行分類與定性研究，對某些特定酶的酶學(xué)特性也做了深 入細(xì)致的分析。目前已有的α-酮酸脫羧酶酶學(xué)特性的研究主要有丙酮酸脫羧酶、α-酮 異戊酸脫羧酶和苯丙酮酸脫羧酶。其中關(guān)于α-酮異戊酸脫羧酶的專利與文獻(xiàn)有：de la 卩1&23 1等報道的來源于1^(：1:〇(3〇(^118 13(31^8正?1^730(1-酮異戊酸脫羧酶，該酶對3-甲 基-2-酮基-丁酸（酮異戊酸）具有最大酶活力為80. 7U/mg蛋白，其次為4-甲基-2-酮 基-戊酸（酮異已酸）（18. 3U/mg蛋白）和3-甲基-2-酮基戊酸（異亮氨酸酮酸）（13. 5U/ mg蛋白），約為其最大酶活力的22%和16%;Smit BA等報道了來源于Lactococcus lactis B1157的α -酮酸脫羧酶KdcA，該酶也對酮異戊酸表現(xiàn)出最大酶活力，酮異已酸和異亮氨酸 酮酸的酶活力僅為其最高活力的30%左右。由上可見，已有的α-酮異戊酸脫羧酶均對酮 異戊酸具有較高的底物專一作用性，目前并沒有發(fā)現(xiàn)對酮異已酸（產(chǎn)物為異戊醇）具有較 高脫羧活力的α-酮酸脫羧酶。
[0006] 基于Ehrlich途徑和氨基酸代謝途徑的綜合應(yīng)用，對包括大腸桿菌、酵母、芽孢桿 菌、乳酸菌等不同微生物進(jìn)行基因重組改造來生產(chǎn)長鏈醇的專利和文獻(xiàn)報道非常之多。然 而，由于已知的α-酮酸脫羧酶的最佳作用底物均為酮異戊酸，從而導(dǎo)致重組菌株更傾向 于異丁醇的生物合成?；诿傅拇呋瘜Ｒ恍?，獲得對酮異已酸具有高度特異性的酮酸脫羧 酶，對高效生物合成異戊醇至關(guān)重要。


【發(fā)明內(nèi)容】
：
[0007] 本發(fā)明的第一個目的是提供一種能高效脫羧應(yīng)用的α -酮酸脫羧酶KIVD-LL。
[0008] 本發(fā)明的α -酮酸脫羧酶KIVD-LL，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID Ν0. 2所 /_J、1 ο
[0009] 本發(fā)明的第二個目的是提供一種編碼上述α-酮酸脫羧酶KIVD-LL的基因 酮酸脫羧酶編碼基因 kivd-LL)，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0010] 一種包含上述編碼上述α -酮酸脫羧酶KIVD-LL的基因的重組載體。
[0011] 一種包含上述重組載體的重組菌株。
[0012] 本發(fā)明的第三個目的是提供α-酮酸脫羧酶KIVD-LL在α-酮酸脫羧中的應(yīng)用。
[0013] 優(yōu)選，α-酮酸脫羧酶KIVD-LL在α-酮異已酸脫羧中的應(yīng)用。
[0014] 本發(fā)明提供的α -酮酸脫羧酶編碼基因 kivd-LL，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1 所示。該α-酮酸脫羧酶編碼基因 kivd-LL含有1647bp核苷酸，編碼的α-酮酸脫羧酶 KIVD-LL理論分子量為61. lkDa。
[0015] 將本發(fā)明的α-酮酸脫羧酶編碼基因 kivd-LL插入到表達(dá)載體pET28a(+)合適 的限制性酶切位點之間，使其核苷酸序列可操作的與表達(dá)調(diào)控序列相連接。作為本發(fā)明的 一個最優(yōu)選的實施方案，優(yōu)選為將本發(fā)明的α -酮酸脫羧酶編碼基因 kivd-LL插入到質(zhì)粒 pET28a(+)上的BamHI和Sail限制性酶切位點之間，使該核苷酸序列位于T7啟動子的下游 并受其調(diào)控，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-kivd_LL。
[0016] 本發(fā)明還提供了包含上述α-酮酸脫羧酶基因 kivd-LL的重組菌株，優(yōu)選所述 菌株為大腸桿菌、酵母菌、棒狀桿菌、芽孢桿菌或乳酸桿菌，進(jìn)一步優(yōu)選為重組菌株BL21/ kivd-LL〇
[0017] 將α-酮酸脫羧酶基因 kivd-LL序列及推導(dǎo)出的氨基酸序列在GenBank中進(jìn)行 BLAST比對，該基因與來源于Lactococcus lactis IFPL730的α-酮酸脫羧酶Kivd氨基酸 序列一致性為98%。雖然二者的同源性較高，然而本發(fā)明提出的α-酮酸脫羧酶KIVD-LL 的功能與Kivd有很大區(qū)別。含有本發(fā)明提出的α-酮酸脫羧酶KIVD-LL的重組E.coli菌 株能在LB發(fā)酵培養(yǎng)基中特異性高產(chǎn)異戊醇，在37°C發(fā)酵2h逐漸產(chǎn)生異戊醇，24h濃度達(dá)到 104mg/L，而異丁醇產(chǎn)量只有24mg/L。即使在M9發(fā)酵培養(yǎng)基中，該重組菌株產(chǎn)生的異戊醇產(chǎn) 量也與異丁醇相當(dāng)，發(fā)酵12h后異丁醇和異戊醇濃度可分別達(dá)到210和199mg/L，是已報道 的只含有酮酸脫羧酶的重組菌株異戊醇濃度（19h發(fā)酵后得到的異戊醇濃度為56mg/L)的 3. 75 倍。
[0018] 用0. 6mM IPTG對本發(fā)明的重組E. coli BL21/kivd-LL菌株進(jìn)行誘導(dǎo)產(chǎn)酶，用 Ni-NTA親和純化柱誘導(dǎo)得到的α -酮酸脫羧酶KIVD-LL粗酶液進(jìn)行純化，得到純度達(dá)到 90%以上的α-酮酸脫羧酶KIVD-LL。測定α-酮酸脫羧酶KIVD-LL對α-酮異戊酸與 α -酮異已酸的酶活力，結(jié)果顯示KIVD-LL對二者的酶活力分別為26. 77和21. 24 μ mol mirTW1?？梢钥闯霰景l(fā)明的α-酮酸脫羧酶KIVD-LL降解α-酮異已酸的脫羧能力可達(dá)到 酮異戊酸的80%。目前，已報道的α-酮酸脫羧酶Kivd均對酮異戊酸表現(xiàn)出最大酶活力，對 酮異已酸的脫羧活性只有酮異戊酸的30%左右，由于本發(fā)明提出α -酮酸脫羧酶KIVD-LL 表現(xiàn)出對α -酮異已酸獨特的高效脫羧能力，使得重組菌株BL21/kivd_LL在生物合成異戊 醇中具有重要的應(yīng)用價值。
[0019] 本發(fā)明通過基因工程的方法，獲得了對α-酮異戊酸與α-酮異已酸均具有較高 脫羧活力的α -酮酸脫羧酶KIVD-LL，該酶在生物合成異戊醇工業(yè)中具有較大的應(yīng)用潛力。

【專利附圖】

【附圖說明】：
[0020] 圖1是本發(fā)明實施例中的α -酮酸脫羧酶基因重組質(zhì)粒pET28a-kivd-LL的構(gòu)建 模式圖。
[0021] 圖2是本發(fā)明的α -酮酸脫羧酶基因 kivd-LL的凝膠電泳圖，M :marker ;1，2, 3 : kivd-LL目的片段。
[0022] 圖3是本發(fā)明的α -酮酸脫羧酶重組質(zhì)粒pET28a-kivd-LL的BamHI，Sal I雙酶 切電泳圖，M :DL5000DNA marker ;K :重組質(zhì)粒 pET28a-kivd-LL 的 BamH I，Sal I 雙酶切產(chǎn) 物。
[0023] 圖4是本發(fā)明的E. coli BL21 (DE3)表達(dá)α -酮酸脫羧酶、及酶純化的SDS-PAGE 電泳圖，M :marker ;1 :含pET28a-kivd_LL質(zhì)粒的Ε. coli胞內(nèi)總蛋白；2-5，Ni-NTA純化過 程洗脫液。
[0024] 圖5是本發(fā)明含重組質(zhì)粒pET28a-kivd-LL的E. coli BL21 (DE3)重組菌株LB培 養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物分析。
[0025] 圖6是本發(fā)明的含重組質(zhì)粒pET28a-kivd-LL的E. coli BL21 (DE3)重組菌株M9 培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物分析。
[0026] 圖7是本發(fā)明的重組α -酮酸脫羧酶的底物特異性。

【具體實施方式】：
[0027] 以下實施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。
[0028] 實驗材料和試劑
[0029] 1、菌株及載體：本發(fā)明從乳酸乳球菌（Lactococcus lactis subsp. lactis)(保存 于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心，其保藏號為CICC6246,可以從該保藏中心購買）中克隆 得到一種ct -酮酸脫羧酶kivd-LL基因。大腸桿菌表達(dá)載體pET28a (+)購自于Novagen公 司，菌株E. coli transl-Tl和E. coli BL21(DE3)購自于北京全式金生物技術(shù)有限公司。
[0030] 2、酶類及其它生化試劑：Taq酶、內(nèi)切酶、T4DNA連接酶購自TaKaRa公司。細(xì)菌基 因組DNA提取試劑盒購自Tiangen公司，3-甲基-2-酮基-丁酸（α-酮異戊酸）、4_甲 基-2-酮基-戊酸（α -酮異已酸）購自Sigma公司，其它均為國產(chǎn)試劑（均可從普通生化 試劑公司購買得到）。
[0031] 3、培養(yǎng)基：
[0032] (l)Lactococcus lactis subsp. lactis 培養(yǎng)基為 MRS 培養(yǎng)基：1 % 釀蛋白，1 % 牛肉膏，0.5%酵母提取物，0.5%乙酸鈉，0.2%檸檬酸二鈉，0.1%吐溫80,0.2%1(2冊0 4， 0. 02% MgS04 · 7H20,0. 005% MnS04 · H20, pH6. 8,121°C滅菌 20min ;固體培養(yǎng)基為液體培養(yǎng) 基加入2 %的瓊脂粉。
[0033] (2)大腸桿菌培養(yǎng)基LB(1%蛋白胨、0. 5%酵母提取物、l%NaCl，pH7. 0)，121°C滅 菌 20min。
[0034] (3) M9發(fā)酵培養(yǎng)基：
[0035] 5XM9 鹽溶液：Na2HP04 · 7Η2012· 8g ;ΚΗ2Ρ043· 0g ;NaC10. 5g，NH4C11. 0g，加雙蒸水 200mL 溶解，121°C滅菌 15min ;
[0036] 1M 1%504與說CaCl2，分別配制并高壓滅菌備用；20%葡萄糖溶液用0· 22μπι濾器 過濾除菌備用。
[0037] Μ9 工作液：5 X Μ9 鹽溶液 200mL ; 1Μ MgS042mL ; 20 % 的葡萄糖溶液 500mL ; 1Μ 的 CaCl20. lmL ;加滅菌雙蒸水至1000mL。
[0038] 說明：以下實施例中未作具體說明的分子生物學(xué)實驗方法，均參照《分子克隆實驗 指南》（第三版）J.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進(jìn)行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說明書 進(jìn)行。
[0039] 實施例1乳酸乳球菌Lactococcus lactis subsp. Lactis基因組的提取：
[0040] 乳酸乳球菌 Lactococcus lactis subsp. lactis 的培養(yǎng)：
[0041] 將菌種劃線接種至MRS固體平板，37°C培養(yǎng)48h，挑單菌落于2. 5mL MRS液體培養(yǎng) 基中，37°C 200rpm過夜培養(yǎng)。
[0042] 乳酸乳球菌 Lactococcus lactis subsp. Lactis 基因組的提?。?br> [0043] (1)取菌體培養(yǎng)基于lOOOOrpm離心lmin收集菌體，加入180μ L溶菌酶，37°C消化 2h。
[0044] (2)加入4μ L核酸內(nèi)切酶A(100mg/mL)溶液，振蕩15s，室溫放置5min，向管中加 入20 yL蛋白酶K溶液，均勻混合。
[0045] (3)加入220 μ L緩沖液GB，顛倒混勻后置金屬浴中70°C、10min，原混濁液變澄清， 短暫離心去除管壁上的液滴；
[0046] (4)向EP管中加入220 μ L無水乙醇，渦旋振蕩30s，溶液中可能出現(xiàn)白色絮狀沉 淀；
[0047] (5)將EP管中的溶液（包括絮狀沉淀）轉(zhuǎn)移至一個干凈的濾柱（spin column) 中，12000rpm離心30s，棄去吸附膜下的液體，再將濾柱放回收集管中；
[0048] (6)向濾柱中加入500 μ L緩沖液⑶，12000rpm離心30s，棄去吸附膜下的液體，再 將濾柱放回收集管中；
[0049] (7)向濾柱中加入700 μ L Washing Buffer, 12000rpm離心30s，棄去吸附膜下的 液體，再將濾柱放回收集管中；
[0050] (8)向濾柱中加入500 μ L Washing Buffer，12000rpm離心30s，棄去吸附膜下的 液體，再將濾柱放回收集管中；
[0051] (9)將濾柱12000rpm離心2min，棄去收集管，將濾柱轉(zhuǎn)移至干凈的1. 5mL EP管中， 常溫下靜置2?3min ;
[0052] (10)待吸附膜上殘余的Washing Buffer完全揮發(fā)，滴加50 μ L60°C預(yù)熱的TE緩 沖液至吸附膜中央，室溫靜置3min后，12000rpm離心2min，用移液槍將EP管中的液體吸回 至吸附膜中央，重復(fù)離心后，棄去濾柱，收集基因組DNA的TE緩沖液保存于-20°C備用，由此 得到乳酸乳球菌的基因組DNA。
[0053] 實施例2乳酸乳球菌Lactococcus lactis subsp. Lactis α -麗酸脫竣酶編碼基 因 kivd-LL的克隆
[0054] 根據(jù)乳酸乳球菌α -酮酸脫羧酶基因 kivd在NCBI數(shù)據(jù)庫中的信息，設(shè)計引物 Kivd-BF和Kivd-SR，以乳酸乳球菌的基因組DNA為模板擴(kuò)增kivd-LL序列。
[0055] Kivd-BF ：CGGGATCCGATGTATACAGTAGGAGATTACC
[0056] Kivd-SR ：GCGTCGACTTATGATTTATTTTGTTCAGC
[0057] PCR 反應(yīng)參數(shù)為：94°C變性 5min;然后 94°C變性 30sec，52°C退火 30sec，72°C延 伸2min，共30個循環(huán)，72°C保溫lOmin。得到一個約1700bp片段（其凝膠電泳圖如圖2所 示），將該片段回收后與pEASY-blunt zero載體相連得到克隆載體pEASY-kivd-LL送華大 基因測序。通過BLAST比對，結(jié)果確認(rèn)獲得的片段為α-酮酸脫羧酶基因 kivd-LL，其核苷 酸序列如SEQ ID NO. 1所示，該α-酮酸脫羧酶基因 kivd-LL含有1647bp，編碼的α-酮酸 脫羧酶KIVD-LL的氨基酸序列如SEQ ID Ν0. 2所示，理論分子量為61. lkDa。該α -酮酸 脫竣酶基因 kivd-LL在GenBank中進(jìn)行BLAST比對，該基因與來源于Lactococcus lactis IFPL730的α -酮酸脫羧酶Kivd氨基酸序列一致性為98%。
[0058] 實施例3重組α -酮酸脫羧酶的制備與純化
[0059] 用BamHI和Sail對含α -酮酸脫羧酶基因 kvid-LL的克隆載體pEASY-kivd-LL 進(jìn)行酶切，并與同樣酶切后的表達(dá)載體pET28a(+)用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 E. coli Transl-Tl感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化得到的陽性克隆子轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，提取得 到重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-kivd-LL(質(zhì)粒構(gòu)建模式圖如圖1所示，其BamHI, Sal I雙酶切電 泳圖如圖3所示）。
[0060] 將重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-kivd-LL轉(zhuǎn)化到E. coli BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，在抗性 培養(yǎng)基上篩選陽性克隆子。取含有重組質(zhì)粒pET28a-kivd-LL的BL21(DE3)菌株，接種于 100mL LB液體培養(yǎng)基中，37°C、200rpm振蕩培養(yǎng)2-3h，0D6(KI達(dá)到約0. 6-1后，加入終濃度 0· 6mM IPTG，于 30°C、200rpm 誘導(dǎo)培養(yǎng) 8-10h。
[0061] 將誘導(dǎo)后的培養(yǎng)基離心收集菌體，用適量的pH6. 0磷酸緩沖液重懸菌體，超聲波 破碎儀對菌體進(jìn)行破碎，離心去除細(xì)胞碎片，得到的可溶總蛋白液用SDS-PAGE檢測α-酮 酸脫羧酶KIVD-LL的表達(dá)，蛋白電泳結(jié)果表明，在約61kDa位置（圖4)能看到比對照有明 顯更粗的條帶，說明α -酮酸脫羧酶KIVD-LL在大腸桿菌中得到表達(dá)。
[0062] 由于表達(dá)載體pET28a(+)含有6個His標(biāo)簽，通過Ni-NTA親和層析柱純化即可以 得到純度較高的α-酮酸脫羧酶KIVD-LL酶液。具體步驟如下：
[0063] 所需緩沖液：
[0064] NPI-10:50mM NaH2P04, 300mM NaCl, 10mM 咪唑，ρΗ8· 0 ;
[0065] NPI-250:50mM NaH2P04, 300mM NaCl, 250mM 咪唑，ρΗ8· 0。
[0066] 1) IPTG 誘導(dǎo)后得到的 E. coli BL21/kivd_LL 菌體 12000rpm 離心 2min，去除上清；
[0067] 2)菌體用適量的NPI-10重懸菌體，用超聲波破碎菌體；
[0068] 3)破碎后的液體12000rpm離心10min，取上清，即得到粗酶液；
[0069] 4)取2mL粗酶液，上柱至Ni-NTA親和層析柱，收集穿透峰；
[0070] 5)用2mL NPI-10至NPI-250洗脫液進(jìn)行梯度上柱將蛋白洗脫，分段收集各洗脫 液；
[0071] 6)用SDS-PAGE檢測洗脫液中蛋白純度。
[0072] 實施例4 α -酮酸脫羧酶KIVD-LL大腸桿菌重組菌株的LB發(fā)酵液產(chǎn)物分析
[0073] 將含有重組質(zhì)粒pET28a-kivd-LL的Ε. coli BL21 (DE3)重組菌株接種到10mL液 體LB發(fā)酵培養(yǎng)基中37°C、200rpm過夜活化培養(yǎng)。新鮮的種子液按0. 5%接種量轉(zhuǎn)接至 100mL液體LB發(fā)酵培養(yǎng)基，于37°C、200rpm搖瓶培養(yǎng)2-3h，0D6QQ約為0· 6-1. 0,加入終濃度 為0. 6mM IPTG進(jìn)行產(chǎn)酶發(fā)酵誘導(dǎo)，然后37°C、200rpm下?lián)u床培養(yǎng)，隔一定時間取樣，用氣相 色譜法測定發(fā)酵產(chǎn)物濃度。
[0074] 發(fā)酵產(chǎn)物測定方法：發(fā)酵液12000rpm離心lOmin去除蛋白以及不溶性雜質(zhì)，上清 用0.22μπι濾器過濾后進(jìn)樣。發(fā)酵產(chǎn)物測定采用島津GC2014氣相色譜儀，程序為：分流比 1:50,上樣量1 μ L，柱溫60°C平衡3min，30°C /min升溫至200°C并保持3min，載氣為氬氣。
[0075] 結(jié)果如圖5所示，含有本發(fā)明的α -酮酸脫羧酶KIVD-LL的重組E. coli菌株能在 LB發(fā)酵培養(yǎng)基中特異性高產(chǎn)異戊醇，在37°C發(fā)酵2h逐漸產(chǎn)生異戊醇，24h濃度達(dá)到104mg/ L，而異丁醇產(chǎn)量只有24mg/L。
[0076] 實施例5 α -酮酸脫羧酶ΚΙVD-LL大腸桿菌重組菌株的M9發(fā)酵產(chǎn)物分析
[0077] 將含有重組質(zhì)粒pET28a-kivd-LL的E. coli BL21 (DE3)重組菌株接種到10mL液 體LB發(fā)酵培養(yǎng)基中37°C、200rpm過夜活化培養(yǎng)。將新鮮的種子液按0. 5%接種量轉(zhuǎn)接至 100mL液體M9發(fā)酵培養(yǎng)基，于37°C、200rpm搖瓶培養(yǎng)2-3h，0D6QQ約為0. 6-1. 0,加入終濃度 為0. 6mM IPTG進(jìn)行產(chǎn)酶發(fā)酵誘導(dǎo)，然后37°C、200rpm下?lián)u床培養(yǎng)，隔一定時間取樣，用氣相 色譜法測定發(fā)酵產(chǎn)物的濃度。
[0078] 發(fā)酵產(chǎn)物測定方法同實施例4。
[0079] 結(jié)果如圖6所示，在M9發(fā)酵培養(yǎng)基中，含有重組質(zhì)粒pET28a-kivd_LL的E. coli BL21 (DE3)重組菌株產(chǎn)生的異戊醇產(chǎn)量也與異丁醇相當(dāng)，發(fā)酵12h后異丁醇和異戊醇濃度 可分別達(dá)到210和199mg/L，是已報道的只含有酮酸脫羧酶的重組菌株異戊醇濃度（19h發(fā) 酵后得到的異戊醇濃度為56mg/L)的3. 75倍。
[0080] 實施例6重組α -酮酸脫羧酶KIVD-LL的活性分析
[0081] lmL標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系：含有50mM磷酸緩沖液（ρΗ6. 0)，lOmMa -酮異戊酸，5mM MgCl2， 1. 5mM硫胺素焦磷酸，適量a -酮酸脫羧酶KIVD-LL酶液，37°C反應(yīng)20min，加入適量體積6N HC1至pH約為3. 0-2. 0終止反應(yīng)，于液相色譜測定異丁醛的生成量。1個酶活單位（U)定 義為在給定條件下，每分鐘每mg蛋白轉(zhuǎn)化a-酮異戊酸生成的異丁醛的量（μ mol)。
[0082] 測的a -酮酸脫羧酶KIVD-LL的酶活力為26. 77 μ mol mir^mg-1。
[0083] 實施例7重組a -酮酸脫羧酶KIVD-LL的底物特異性分析
[0084] 按實施例6中l(wèi)mL標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)進(jìn)行，底物分別為10mmol/L a -酮異戊酸和a -酮異 已酸，pH6. 0,37°C反應(yīng)20min，液相色譜測定產(chǎn)物異丁醛和異戊醛的生成量。
[0085] 結(jié)果如圖7所示。測定a-酮酸脫羧酶KIVD-LL對a-酮異戊酸與a-酮異已酸 的酶活力，結(jié)果顯示a -酮酸脫羧酶KIVD-LL對二者的酶活力分別為26. 77和21. 24 μ mol mirTW1。可以看出本發(fā)明的a-酮酸脫羧酶KIVD-LL降解a-酮異已酸的脫羧能力可達(dá) 到a-酮異戊酸的80%。目前，已報道的a-酮酸脫羧酶Kivd均對a-酮異戊酸表現(xiàn)出最 大酶活力，對酮異已酸的脫羧活性只有酮異戊酸的30%左右，由于本發(fā)明提出a -酮酸脫 羧酶KIVD-LL表現(xiàn)出對酮異已酸獨特的高效脫羧能力，使得重組菌株BL21/kivd-LL在生物 合成異戊醇中具有重要的應(yīng)用價值。
【權(quán)利要求】
1. 一種α-酮酸脫羧酶KIVD-LL，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
2. -種編碼權(quán)利要求1所示的α-酮酸脫羧酶KIVD-LL的α-酮酸脫羧酶編碼基因 kivd-LL，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
3. -種包含權(quán)利要求2所述的α-酮酸脫羧酶編碼基因 kivd-LL的重組載體。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組載體，其特征在于，所述的重組載體中的表達(dá)載體為 pET28a(+)。
5. -種包含權(quán)利要求3所述的重組載體的重組菌株。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組菌株，其特征在于，所述的重組菌株的宿主菌株為大腸 桿菌或谷氨酸棒桿菌。
7. 權(quán)利要求1所述的α -酮酸脫羧酶KIVD-LL在α -酮酸脫羧中的應(yīng)用。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，α-酮酸脫羧酶KIVD-LL在α-酮異已酸 脫羧中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N9/88GK104195125SQ201410309574
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年7月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月1日
【發(fā)明者】袁振宏, 許敬亮, 陳小燕, 楊柳, 莊新姝, 張宇, 粱翠誼 申請人:中國科學(xué)院廣州能源研究所