基于Caco-2細胞對納米氧化鋅的生物安全性評價方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種基于Caco-2細胞對納米氧化鋅的生物安全性評價方法，包括細胞常規(guī)培養(yǎng)、細胞傳代、細胞凍存、細胞復蘇、將細胞進行染毒處理、進行形態(tài)學觀察和細胞活性檢測等步驟，本發(fā)明對于探討納米氧化鋅的腸道毒性具有一定的理論意義，并為食品用納米氧化鋅限量標準的制定提供參考，為進一步研究食品用納米氧化鋅的安全問題提供可靠的科學依據(jù)，為其它納米材料的安全性評價提供參考。為納米氧化鋅的安全使用提供理論支撐。
【專利說明】基于Caco-2細胞對納米氧化鋅的生物安全性評價方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于食品安全檢測領域，具體是一種基于Caco-2細胞對納米氧化鋅的生 物安全性評價方法。

【背景技術】
[0002] 從當前的研究進展可知，活性氧自由基的產(chǎn)生引起機體氧化應激改變是現(xiàn)今所熟 知的納米材料的毒性機制。從納米材料的特性來看：粒徑越小，其比表面積越大，反應的活 性位點就越多，更容易產(chǎn)生具有高反應能力的自由基。另外，不同納米材料理化性質(zhì)不同、 受測生物體中代謝活動有差異，因此不同納米材料的致毒機制也不盡相同。除氧化應激機 制外，鋅離子的釋放、炎癥反應應答和表面靜電作用等因素都可參與其毒性作用。
[0003] 活性氧自由基是是含有氧的化學反應分子，包括氧離子和過氧化物。作為正常代 謝反應的副產(chǎn)物，在信號轉(zhuǎn)導，維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)方面起著重要作用。然而，在環(huán)境因子影響 下（比如紫外照射或者加熱)。R0S水平顯著增加。這可能導致細胞結構的明顯的破壞，被稱 做氧化應激反應。
[0004] 正常狀態(tài)下，細胞會通過A-1微球蛋白，超氧化物歧化酶，過氧化氫酶，乳糖過氧 化物酶，谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化物還原蛋白來保護細胞免受氧化應激性損傷。其中 胞內(nèi)的一些小分子物質(zhì)例如維生素 C、維生素 E，尿酸和谷胱甘肽對于細胞抗氧化性也起重 要的作用。但在氧化應激條件下，活性氧自由基大量產(chǎn)生，對于細胞損傷主要包括：DNA損 傷、多不飽和脂肪酸氧化、氨基酸氧化和通過氧化輔酶因子使酶失活。最早的研究主要圍繞 富勒烯的水懸濁液處理魚腦組織產(chǎn)生氧化應激反應和脂質(zhì)超氧化反應。進一步研究發(fā)現(xiàn)富 勒烯和其他無機的納米材料(氧化鋅、二氧化鈦和氧化銅）也能引起氧化應激反應，在光照 刺激下可以產(chǎn)生更多的R0S，導致更嚴重的細胞毒性。Ye課題組發(fā)現(xiàn)金屬鉻通過還原反應 產(chǎn)生R0S參與細胞凋亡早期，p53蛋白可以與金屬鉻產(chǎn)生協(xié)同作用進入到細胞凋亡晚期。研 究已表明R0S是p53介導細胞凋亡信號通路的下游信號因子，金屬鉻可以誘導p53蛋白的 活化，做為腫瘤抑制蛋白，促進細胞凋亡。
[0005] 鋅是生物體必不可少的微量元素，機體有良好的調(diào)控體系可以平衡體內(nèi)的鋅，而 且鋅離子本身化學性質(zhì)顯惰性，因此通常鋅都被認為是無毒的。但納米氧化鋅作為金屬毒 性中較強的一類納米材料，引起了人們的關注。Kao等總結了納米氧化鋅釋放Zn2+對細胞 產(chǎn)生的毒性機制。前期，納米氧化鋅通過內(nèi)吞作用進入胞內(nèi)的內(nèi)含體，內(nèi)含體在低濃度的pH 下，釋放鋅離子到細胞質(zhì)中。到了后期，線粒體大量吸收鋅離子，導致線粒體內(nèi)的鋅離子增 力口，致使線粒體膜破損，激活Caspase-3,產(chǎn)生凋亡同時釋放LDH。
[0006] Brunner等采用多種金屬氧化物染毒間脾瘤細胞MST0-211H和小鼠成纖維細胞 NIH/3T3。結果表明納米氧化鋅在進入細胞后，納米氧化鋅溶解出鋅離子用于NIH/3T3毒 性。Wiseman等研究表明鋅離子濃度的升高可以導致肺動脈內(nèi)皮細胞線粒體損傷。同時表 明鋅離子可以激活R0S大量產(chǎn)生，誘導的氧化損傷并進一步反饋于鋅離子釋放。Deniels研 究發(fā)現(xiàn)鋅離子可以參與到MAP-激酶途徑，產(chǎn)生活性氧，造成神經(jīng)瘤細胞存活率降低，特別 是在高濃度的鋅離子，4 h后即可明顯觀察到細胞抑制率升高。
[0007] 在納米復合材料的安全性評價中，有許多不確定性變量。主要存在以下問題：一、 關于染毒的劑量是納米材料風險與危害評估的主要問題。在經(jīng)典的毒性實驗中，將細胞或 者組織暴露在一定劑量的染毒物，短時間內(nèi)即可檢測細胞的形態(tài)學變化、胞內(nèi)外酶活的變 化，基因的差異性表達等。實驗中的劑量效應是關鍵的因素，劑量可以用來評估藥物治療和 靶細胞或靶器官承受的濃度上限。大量的研究結果說明關于染毒物的劑量導致毒性一有毒 的物質(zhì)在低濃度下是無毒的，無毒的物質(zhì)在高濃度下也可以對機體產(chǎn)生危害。那么科學規(guī) 范的安全性評價就是采用科學公認的研究方法對納米材料劑量、暴露途徑和時間、確定粒 徑大小和形狀這些變量的進行詳細描述，同時增加實驗的可重復性。正在興起的高通量和 計算機編程的方法應用于拍攝和表征納米材料用于毒性檢測，同時研究材料特征和生物習 性之間的關系。也為計算機研究人員提供了條件來設計合適的軟件來描述納米材料，還可 與毒理學家合作設計新的實驗思路。既可以增加毒理實驗的重復性，同時方便研究結果之 間相互比較。
[0008] 根據(jù) IS0(The International Organization for Standardization) ΙΟ"3-5 國際 標準醫(yī)療器材的生物安全性評估一體外毒性的檢測的毒性評價：毒性的效應可以分為定性 評價和定量評價。定性的毒性評價包括觀察細胞形態(tài)，細胞的空泡化，細胞溶解，細胞膜完 整性，根據(jù)細胞的染毒程度可以分為無毒性、輕微毒性、中等毒性、嚴重毒性。定量的毒性評 價包括：檢測細胞死亡、細胞生長抑制率、細胞增殖抑制率和克隆形成率。采用客觀的方法 統(tǒng)計細胞數(shù)量，蛋白質(zhì)數(shù)量，酶的釋放，染料標記細胞。生物相容性檢測對生物材料進行生 物安全性評價，納米材料對宿主是異物，在體內(nèi)必定會產(chǎn)生某些應答或出現(xiàn)排異現(xiàn)象。體外 分析方法或動物實驗可以用于合理地預測在人體的反應，但目前還不能做到這一點。細胞 學檢測是目前用于毒性評價、生物材料檢測和環(huán)境材料接觸檢測的主要方法。盡管體外模 型與體內(nèi)觀察之間常在相關性和可預見性上欠佳，但目前還沒有從材料合成到動物模型的 科學的判斷標準。而且在細胞水平上的研究仍然知之甚少：納米顆粒如何與細胞膜相互作 用，他們?nèi)绾伪晦D(zhuǎn)運進細胞、溶酶體、線粒體、細胞核，以及他們之間相互作用的結果。在人 體器官水平上，亟待解決的問題是納米顆粒進入人體后的肺外轉(zhuǎn)運和遷移的毒理動力學。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的是提供一種基于Caco-2細胞對納米氧化鋅的生物安全性評價方 法。
[0010] 一種基于Caco-2細胞對納米氧化鋅的生物安全性評價方法，其特征在于包括如 下步驟： 1) 細胞常規(guī)培養(yǎng)：將Caco-2細胞培養(yǎng)于含有2. 9 mg/ml L-谷氨酰胺，1 mg/ml鏈霉 素，100 unit/ml青霉素，10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基，每2天進行細胞換液，取對數(shù)期 Caco-2細胞進行實驗； 2) 細胞傳代：Caco-2細胞為貼壁細胞，培養(yǎng)3-4天后，細胞覆蓋瓶底80%-90%時，采用 0. 25%胰酶37 °C消化，鏡檢觀察，待少量細胞懸浮，多數(shù)細胞邊緣透明時加入新培養(yǎng)基吹吸 進行終止消化，混合懸液以1/2 -1/3的比例進行分瓶傳代； 3) 細胞凍存：細胞覆蓋瓶底80% - 90%，采用胰酶消化成單細胞懸液，2000 rpm離心5分 鐘，棄上清，緩慢加入凍存液，吹吸混勻，分裝到滅菌凍存管中，可放入墊有棉花的泡沫盒中 直接-80°C超低溫冰箱過夜，次日轉(zhuǎn)移到液氮中凍存； 4) 細胞復蘇：從液氮中取出凍存細胞，加入10 ml完全培養(yǎng)基混合，2000 rpm 5 min離 心，棄上清，再加入10 ml完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，次日換液； 5) 將細胞進行染毒處理； 6) 進行形態(tài)學觀察和細胞活性檢測。
[0011] 所述的一種基于Caco-2細胞對納米氧化鋅的生物安全性評價方法，其特征在 于步驟5)中所述將細胞進行染毒處理包括如下步驟：取處于對數(shù)生長期的Caco-2,加入 0. 25%胰酶消化，細胞懸液為2 X 105/ml，200 μ 1接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h，三種粒徑的 納米氧化鋅按照稀釋濃度6. 25,12. 5, 25, 50和100 μ g/ml加入96孔板中，分別培養(yǎng)24小 時，同時設置不含納米氧化鋅的DMEM培養(yǎng)細胞作為對照組。
[0012] 所述的一種基于Caco-2細胞對納米氧化鋅的生物安全性評價方法，其特征在于 步驟6)中細胞活性檢測包括如下步驟：收集對數(shù)期細胞，調(diào)整細胞懸液密度至2 X 105/ml， 96孔板中每孔加入200 μ 1 DMEM完全培養(yǎng)液，5% C02, 37 °C孵育，細胞生長12 h后，加入濃 度梯度的三種粒徑的納米氧化鋅，設置4個復孔，分別染毒12 h，24 h和36 h，吸棄含有納米 氧化鋅的染毒上清液，用PBS沖洗2-3次，加入0. 05 mg/ml，lx PBS稀釋的200 μ 1 MTT染 色液繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄掉ΜΤΤ上清液，加入150 μ 1 DMS0,置搖床上低速震蕩10 min，使紫色 結晶物充分溶解，在酶標儀570 nm測定吸光度，同時設置調(diào)零組：DMEM，MTT染色液，DMS0， 對照組：Cac〇-2細胞，DMEM，MTT染色液，DMS0,使用SPSS 16. 0軟件對實驗結果進行統(tǒng)計分 析，計算P〈 〇· 〇1的差異顯著性，MTT細胞活性=(Aexp-Aneg) / (A con-A neg)，其中，Aexp 代表試驗組，Aneg代表調(diào)零組，Aeon代表實驗對照組。
[0013] 所述的一種基于Caco-2細胞對納米氧化鋅的生物安全性評價方法，其特征在于 步驟1)中的細胞培養(yǎng)條件是5% C02 , 37 °C恒溫。
[0014] 所述的一種基于Caco-2細胞對納米氧化鋅的生物安全性評價方法，其特征在于 步驟3)中所述凍存液采用如下配方：50%胎牛血清，40% DMEM培養(yǎng)液，10%二甲基亞砜 DMS0。
[0015] 本發(fā)明的基于Caco-2細胞對納米氧化鋅的生物安全性評價方法，對于探討納米 氧化鋅的腸道毒性具有一定的理論意義，并為食品用納米氧化鋅限量標準的制定提供參 考，為進一步研究食品用納米氧化鋅的安全問題提供可靠的科學依據(jù)，為其它納米材料的 安全性評價提供參考。為納米氧化鋅的安全使用提供理論支撐。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016] 圖1是納米氧化鋅對Caco-2細胞形態(tài)的影響圖； 圖2是納米氧化鋅染毒Caco-2細胞12h后細胞活力比較圖； 圖3是納米氧化鋅染毒Caco-2細胞24h后細胞活力比較圖； 圖4是納米氧化鋅染毒Caco-2細胞36h后細胞活力比較圖； 圖5是25 Pg/ml氧化鋅染毒Caco-2細胞活力比較圖； 圖6是5(^g/ml氧化鋅染毒Caco-2細胞活力比較圖。

【具體實施方式】
[0017] 材料 細胞株 人結腸腺癌上皮Caco-2細胞 中科院上海細胞生物研究所 主要試劑 納米氧化鋅顆粒 杭州萬景新有限公司 L-谷氨酰胺 Hyclone分裝 青霉素 美國Sigma分裝 鏈霉素 美國Sigma分裝 絲裂霉素 C 瑞士 Roche分裝 DMEM 美國Hyclone公司 二甲基亞砜（DMS0) 美國Hyclone公司胎牛血清 杭州四季青生物技術有限公司 lOxPBS 碧云天生物技術有限公司 MTT試劑盒 碧云天生物技術有限公司 0.25%胰酶 碧云天生物技術有限公司1. 5ml, 15ml，50ml離心管 美國Corning公司 25cm和75cm細胞瓶 美國Corning公司 6孔板，24孔板和96孔板 美國Corning公司 主要儀器 JEM-1011型透射電鏡 日本JE0L公司 倒置生物顯微鏡 日本Olympus公司 Genios酶標儀 瑞士 TECAN公司 超純水設備 美國Millipore公司 SW-CJ-1F超凈工作臺 中國蘇州凈化公司 HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 中國精達儀器 LD5_2A尚心機 北點醫(yī)用尚心機J^ 二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱 美國Thermo公司 實驗方法 細胞培養(yǎng) 細胞常規(guī)培養(yǎng)：Cac〇-2細胞培養(yǎng)于含有2. 9 mg/ml L-谷氨酰胺，1 mg/ml鏈霉素，100 unit/ml青霉素，10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基。細胞培養(yǎng)條件設置為5% C02, 37 °C恒 溫。每2天進行細胞換液，取對數(shù)期Caco-2細胞進行實驗。
[0018] 細胞傳代：Caco-2細胞為貼壁細胞。培養(yǎng)3-4天培養(yǎng)后，細胞覆蓋瓶底80%-90% 時，采用0. 25%胰酶37 °C消化。鏡檢觀察，待少量細胞懸浮，多數(shù)細胞邊緣透明時加入新培 養(yǎng)基吹吸進行終止消化。混合懸液以1/2 -1/3的比例進行分瓶傳代。
[0019] 細胞凍存：細胞覆蓋瓶底80% - 90%，采用胰酶消化成單細胞懸液，2000 rpm離心5 分鐘，棄上清。緩慢加入凍存液（50%胎牛血清，40% DMEM培養(yǎng)液，10%二甲基亞砜DMS0)， 吹吸混勻，分裝到滅菌凍存管中?？煞湃雺|有棉花的泡沫盒中直接_80°C超低溫冰箱過夜， 次曰轉(zhuǎn)移到液氮中凍存。
[0020] 細胞復蘇：從液氮中取出凍存細胞，加入10 ml完全培養(yǎng)基混合，2000 rpm 5 min離 心，棄上清。再加入10 ml完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，次日換液。
[0021] 細胞染毒處理 處于對數(shù)生長期的Caco-2,加入0. 25%胰酶消化，細胞懸液為2 X 105/ml。200 μ 1接 種于96孔板中，培養(yǎng)24 h。三種粒徑的納米氧化鋅按照稀釋濃度（6. 25,12. 5, 25, 50和100 μ g/ml)加入96孔板中，分別培養(yǎng)24小時，同時設置不含納米氧化鋅的DMEM培養(yǎng)細胞作為 對照組。
[0022] 形態(tài)學觀察 處于對數(shù)生長期的細胞，采用三種納米氧化鋅(濃度為6. 25,12. 5, 25, 50和100 Pg/ mL)染毒24 h，倒置顯微鏡下鏡檢。對照組細胞只加入相應不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。
[0023] 細胞活性檢測 實驗方法：收集對數(shù)期細胞，調(diào)整細胞懸液密度（2 X 105/ml)，96孔板中每孔加入200 μ 1 DMEM完全培養(yǎng)液，5% C02 , 37 °C孵育，細胞生長12 h后，加入濃度梯度的三種粒徑的納米 氧化鋅，設置4個復孔，分別染毒12 h，24 h和36 h，吸棄含有納米氧化鋅的染毒上清液，用 PBS沖洗2-3次，加入200 μ 1 MTT染色液（0· 05 mg/ml，lx PBS稀釋）繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄掉 MTT上清液，加入150 μ 1 DMS0,置搖床上低速震蕩10 min，使紫色結晶物充分溶解。在酶標 儀570 nm測定吸光度。同時設置調(diào)零組（DMEM，MTT染色液，DMS0)，對照組（Caco-2細胞， DMEM，MTT染色液，DMS0)。使用SPSS 16. 0軟件對實驗結果進行統(tǒng)計分析，計算p〈 0. 01的 差異顯著性。
[0024] MTT 細胞活性=(Aexp-Aneg) / (A con_A neg) 其中，Aexp代表試驗組，Aneg代表調(diào)零組，Aeon代表實驗對照組。
[0025] 結果 細胞形態(tài)學觀察 納米氧化鋅對Caco-2細胞形態(tài)的影響如圖1所示，其中A :空白組，B :50Pg/mL絲裂霉 素 C，C :25 Pg/mL 26 nm納米氧化鋅，D: 100Pg/mL 26 nm納米氧化鋅。納米氧化鋅與陽性對 照藥物分別作用Caco-2細胞24 h后，鏡檢拍照可知，對照組細胞生長良好，細胞貼壁牢固， Caco-2細胞為50-60 μπι呈梭形或多角形，形成單層細胞模型（圖1A)。如圖1B所示絲裂 霉素 C作為陽性對照藥物染毒Caco-2細胞后結果表示細胞數(shù)量明顯減少，細胞變圓，和細 胞濃度變稀，抑制作用明顯。如圖1 B經(jīng)25 Pg/mL的氧化鋅染毒，細胞形態(tài)尚無明顯變化， 細胞折光率變差，細胞表面變"臟"。鏡下可見一些細胞變圓，變圓發(fā)亮，細胞呈不規(guī)則形態(tài)。 100 Pg/mL的氧化鋅附著細胞周圍，一些細胞變小、變圓，呈壞死的形態(tài)，細胞不同程度地破 碎，出現(xiàn)空泡化。鏡下細胞貼壁力下降，細胞數(shù)量減少，視野中出現(xiàn)黑色的團聚納米氧化鋅 顆粒。
[0026] 染毒Caco-2細胞12小時細胞存活率 Caco-2細胞經(jīng)不同濃度的三種納米氧化鋅處理12h后，細胞活性比較隨納米氧化鋅濃 度升高而降低。表1表示在低劑量水平上（6. 25 Pg/mL和12. 5 Pg/mL)三種納米氧化鋅的 細胞存活率與對照組無明顯差異。隨著劑量的增加（>25Pg/mL)，實驗組的細胞存活率嚴重 降低。在一定濃度范圍內(nèi)（彡50 Pg/mL)，62 nm氧化鋅的細胞存活率高于26 nm和90 nm氧 化鋅，差異具有統(tǒng)計學意義（P〈〇. 01 )。
[0027] 表1納米氧化鋅染毒Caco-2細胞12小時后MTT 0D值與細胞存活率（RGR)

【權利要求】
1. 一種基于CaC〇-2細胞對納米氧化鋅的生物安全性評價方法，其特征在于包括如下 步驟： 1) 細胞常規(guī)培養(yǎng)：將Caco-2細胞培養(yǎng)于含有2. 9 mg/ml L-谷氨酰胺，1 mg/ml鏈霉 素，100 unit/ml青霉素，10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基，每2天進行細胞換液，取對數(shù)期 Caco-2細胞進行實驗； 2) 細胞傳代：Caco-2細胞為貼壁細胞，培養(yǎng)3-4天后，細胞覆蓋瓶底80%-90%時，采用 0. 25%胰酶37 °C消化，鏡檢觀察，待少量細胞懸浮，多數(shù)細胞邊緣透明時加入新培養(yǎng)基吹吸 進行終止消化，混合懸液以1/2 -1/3的比例進行分瓶傳代； 3) 細胞凍存：細胞覆蓋瓶底80% - 90%，采用胰酶消化成單細胞懸液，2000 rpm離心5分 鐘，棄上清，緩慢加入凍存液，吹吸混勻，分裝到滅菌凍存管中，可放入墊有棉花的泡沫盒中 直接_80°C超低溫冰箱過夜，次日轉(zhuǎn)移到液氮中凍存； 4) 細胞復蘇：從液氮中取出凍存細胞，加入10 ml完全培養(yǎng)基混合，2000 rpm 5 min離 心，棄上清，再加入10 ml完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，次日換液； 5) 將細胞進行染毒處理； 6) 進行形態(tài)學觀察和細胞活性檢測。
2. 如權利要求1所述的一種基于Caco-2細胞對納米氧化鋅的生物安全性評價方法，其 特征在于步驟5)中所述將細胞進行染毒處理包括如下步驟：取處于對數(shù)生長期的Caco-2， 加入0. 25%胰酶消化，細胞懸液為2 X 105/ml，200 μ 1接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h，三種粒 徑的納米氧化鋅按照稀釋濃度6. 25,12. 5, 25, 50和100 μ g/ml加入96孔板中，分別培養(yǎng) 24小時，同時設置不含納米氧化鋅的DMEM培養(yǎng)細胞作為對照組。
3. 如權利要求1所述的一種基于Caco-2細胞對納米氧化鋅的生物安全性評價方法，其 特征在于步驟6)中細胞活性檢測包括如下步驟：收集對數(shù)期細胞，調(diào)整細胞懸液密度至2 X 105/ml，96孔板中每孔加入200 μ 1 DMEM完全培養(yǎng)液，5% C02 , 37 °C孵育，細胞生長12 h后， 加入濃度梯度的三種粒徑的納米氧化鋅，設置4個復孔，分別染毒12 h，24 h和36 h，吸棄 含有納米氧化鋅的染毒上清液，用PBS沖洗2-3次，加入0. 05 mg/ml，lx PBS稀釋的200 μ 1 ΜΤΤ染色液繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄掉ΜΤΤ上清液，加入150 μ 1 DMSO,置搖床上低速震蕩10 min， 使紫色結晶物充分溶解，在酶標儀570 nm測定吸光度，同時設置調(diào)零組：DMEM，MTT染色液， DMS0,對照組：Cac〇-2細胞，DMEM，MTT染色液，DMS0,使用SPSS 16. 0軟件對實驗結果進行 統(tǒng)計分析，計算P〈 〇. 01的差異顯著性，MTT細胞活性=(Aexp-Aneg)/ (A con-Aneg)，其中， Aexp代表試驗組，Aneg代表調(diào)零組，Aeon代表實驗對照組。
4. 如權利要求1所述的一種基于Caco-2細胞對納米氧化鋅的生物安全性評價方法，其 特征在于步驟1)中的細胞培養(yǎng)條件是5% C02 , 37 °C恒溫。
5. 如權利要求1所述的一種基于Caco-2細胞對納米氧化鋅的生物安全性評價方法，其 特征在于步驟3)中所述凍存液采用如下配方：50%胎牛血清，40% DMEM培養(yǎng)液，10%二甲 基亞諷DMS0。
【文檔編號】C12Q1/02GK104059961SQ201410247688
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年6月6日 優(yōu)先權日:2014年6月6日
【發(fā)明者】關榮發(fā), 康天舒, 王彥波, 伍義行, 呂飛, 張進杰 申請人:中國計量學院