一種基于Taq酶末端轉移酶活性構建T載體的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及基因工程領域中一種載體構建的方法，具體為一種基于TaqDNA聚合酶的末端轉移酶活性構建T載體的方法。主要利用TaqDNA聚合酶末端轉移酶活性在線性化平末端出發(fā)載體的3′-端添加T，然后利用T4DNA連接酶去除3′-端未加T載體自身環(huán)化背景，獲得3′-端具有單個T突出的線性T載體。本發(fā)明獲得的T載體質量穩(wěn)定，自身環(huán)化背景低，克隆效果好，不但適用于小規(guī)模制備，也適用于大規(guī)模生產，將在基因工程領域發(fā)揮重要作用。
【專利說明】一種基于Taq酶末端轉移酶活性構建T載體的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程領域中一種載體構建的方法，具體為一種基于Taq DNA聚合酶末端轉移酶活性構建T載體的方法。
【背景技術】
[0002]T載體是一種方便的克隆PCR產物的線性載體，T-A克隆技術被證明對PCR產物的克隆極具價值。此方法的原理是利用T^i7DNA聚合酶具有非模板依賴性的末端轉移酶活性，可將PCR雙鏈產物的每一條鏈的3'-端加入一個突出的dA堿基，而線性T載體的3'-端正好含有與之互補配對的突出dT堿基，從而實現(xiàn)T-A互補連接。
[0003]目前，經典的T載體構建方法有2種。第一種是先將質粒通過V或I等切口平末端的限制性內切酶線性化，然后利用末端轉移酶或者具有末端轉移酶活性的DNA聚合酶在dTTP或ddTTP環(huán)境中給質粒平末端3'-端添加T。第二種方法是利用限制性內切酶酶切的方法，即在T載體前體中引入2個串聯(lián)的能產生3'-端突出單堿基末端的限制性內切酶如I? I或AM I等識別位點，使用這些酶切割特異性序列后產生的末端為
-端突出單堿基N(N代表任意堿基)，如果將該堿基設計為T，則可以通過酶切T載體前體使其產生2個3'-端突出T堿基而成為T載體。
[0004]目前T載體的構建方法多采用第一種方法，如Promega和TaKaRa公司的產品，以及國內幾家公司的產品。但由于DNA聚合酶末端轉移酶活性主導下的3'-端加T反應是一個動態(tài)平衡的過程，并非所有的質粒3,-端均可添加上T，其加T效率一般35%~55%之間，因此以此方法構建的T載體往往存在大量3'-端未添加T的平端載體。在PCR產物T-A克隆過程中會出現(xiàn)載體自身環(huán)化背景高，PCR產物連接效率低，陽性克隆篩選困難等問題。因此，如何在T^i7DNA聚合酶末端轉移酶活性主導下的3'-端加T反應后，有效去除3'-端未添加T的質粒，以減少T-A克隆過程中載體自身環(huán)化背景，是制備高質量、穩(wěn)定、高效T載體的前提，也是本發(fā)明重點解決的問題。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種基于Taqmk聚合酶的末端轉移酶活性高效構建T載體的方法，利用該方法獲得的T載體質量穩(wěn)定，自身環(huán)化背景低，克隆效果好，不但適用于小規(guī)模制備，也適用于大規(guī)模生產，將在基因工程領域發(fā)揮重要作用。
[0006]實現(xiàn)本發(fā)明的目的包括下列步驟: 步驟1.利用平末端內切酶酶切出發(fā)載體，回收獲得線性化平末端載體；
步驟2.利用Polymerase末端轉移酶活性,在二價金屬陽離子的作用下給線性化平末端載體加T，回收獲得中間T載體；
步驟3.利用T4 DNA Ligase連接步驟2所得中間T載體，去除3'-端未加T載體，回收獲得T載體。
[0007]其中，所述平末端內切酶為V、5ka I, Sca I中任何一種；所述出發(fā)載體為 pBluescript SK(+)、pUC18、PGEM_7Zf (+)中任何一種；所述二價金屬陽離子為 MgCl2、MnCl2、CoCl2、CdCl2中任何一種。所述二價金屬陽離子優(yōu)選I mM濃度的CdCl2。
[0008]出發(fā)載體加入量與平末端內切酶酶量比例為:I Ug出發(fā)載體，加入10 U的平末端內切酶酶量。
[0009]本發(fā)明所構建T載體的方法是利用TacMk聚合酶末端轉移酶活性在線性化平末端出發(fā)載體的3'-端添加T，然后利用T4 DNA連接酶去除3'-端未加T載體自身環(huán)化背景，獲得3,-端具有單個T突出的線性T載體。
[0010]本發(fā)明有益效果:本發(fā)明所述構建T載體的方法簡單高效，利用該方法所獲得的T載體不僅具備出發(fā)載體的優(yōu)點，還包含出發(fā)載體的不同多克隆位點，而且質量穩(wěn)定、無自身環(huán)化背景、克隆效率高，可極大方便PCR產物的T-A克隆(具體結果見實施例3中圖4、圖5)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1為本發(fā)明pBluescript SK (+)載體線性化檢測結果圖。其中:泳道I為pBluescript SK (+)載體,泳道2為線性化的平末端pBluescript SK (+)載體,泳道M為250bp DNA marker (見實施例1)。
[0012]圖2為本發(fā)明中間T載體3'-端加T比例檢測結果圖。圖2中A表示藍、白斑顯色結果；圖2中B表示瓊脂糖凝膠電泳檢測結果，其中:泳道1-5為白斑菌落PCR擴增結果，泳道6-10為藍斑菌落PCR擴增結果，泳道M為DL 2000 DNA marker (見實施例2)。
[0013]圖3為本發(fā)明T載體回收前、后檢測結果圖。圖3中其中:泳道I為回收前T載體，泳道2為回收后T載體，泳道M為250 bp DNA marker (見實施例3)。
[0014]圖4為本發(fā)明T載體與500 bp片段T-A克隆檢測結果圖。圖4中A表示藍、白斑顯色結果；圖4中B表示瓊脂糖凝膠電泳檢測結果，其中:泳道1-10為白斑菌落PCR擴增結果,泳道M為DL 2000 DNA marker (見實施例3)。
[0015]圖5為本發(fā)明T載體與1000 bp片段T-A克隆檢測結果圖。圖5中A表示藍、白斑顯色結果；圖5中B表示瓊脂糖凝膠電泳檢測結果，其中:泳道1-10為白斑菌落PCR擴增結果,泳道M為DL 2000 DNA marker (見實施例3)。
【具體實施方式】
[0016]本發(fā)明實施例公開了一種構建T載體的方法。本領域技術人員可借鑒本文內容，適當改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。需要指出的是，所有類似的替換和修改對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明內。本發(fā)明的方法已經通過優(yōu)化的實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內容】
、精神和范圍內對本文所述的方法進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應用本發(fā)明技術。
[0017]為了進一步理解本發(fā)明，下面結合實施例對本發(fā)明提供的構建T載體的方法進行詳細說明。
[0018]實施例1:線性化平末端載體制備 1.出發(fā)載體線性化反應
以pBluescript SK(+)為出發(fā)載體，使用V (Takara公司)平末端內切酶酶切pBluescript SK(+)載體，在保證內切酶完全切開出發(fā)載體，同時又防止內切酶自身星活性，優(yōu)化了載體加入量與酶量比例為I Ug出發(fā)載體，加入10 U的酶量。
[0019]V酶切反應體系為:
IOXH buffer10 μ L
pBluescript SK (+)載體(50 ng/ μ L) 80 μ L &oR V 內切酶(10 U/μ L)4 yL,
加入滅菌蒸餾水補足體積到100 UL0 37 °C反應2 h，酶切產物取3 yL，l%瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0020]2.檢測結果
如圖1所示，出發(fā)載體pBluescript SK(+)經V內切酶線性化，在瓊脂糖上電泳顯色后可觀察到在3000 bp位置處有I條明顯DNA條帶(泳道2)，而未線性化的超螺旋載體(泳道I)與線性化載體相比，其電泳時的遷移速率明顯較快。
[0021 ] 實施例2:中間T載體制備1.線性化平末端載體加T反應
對實施例1所得V酶切產物進行純化回收，回收后線性化平末端載體濃度稀釋至50 ng/ μ L0使用T^gDNA聚合酶(Takara公司)對線性化平末端載體按下列條件在PTC-200 (Bio-Rad公司)PCR儀進行加T反應，其中加T的二價金屬陽離子從MgCl2、MnCl2、CoCl2、CdCl2中，優(yōu)選出I mM濃度的CdCl2S平末端載體加T金屬陽離子(見表1)。
[0022]表1四種不同濃度金屬陽離子加T效率
【權利要求】
1.一種基于Ai7DNA聚合酶末端轉移酶活性構建T載體的方法，其特征在于:所述方法的步驟包括: 步驟1.利用平末端內切酶酶切出發(fā)載體，回收獲得線性化平末端載體； 步驟2.利用7?沖NA聚合酶的末端轉移酶活性，在二價金屬陽離子的作用下給線性化平末端載體加T，回收獲得中間T載體； 步驟3.利用T4 DNA連接酶連接步驟2所得中間T載體，去除3'-端未加T載體，回收獲得T載體。
2.根據(jù)權利要求1所述的基于7?沖NA聚合酶末端轉移酶活性構建T載體的方法，其特征在于:所述的平末端內切酶為V、5ka I, Sca I中任何一種；所述出發(fā)載體為 pBluescript SK(+)、pUC18、PGEM_7Zf (+)中任何一種；所述二價金屬陽離子為 MgCl2、MnCl2'CoCl2'CdCl2 中任何一種。
3.根據(jù)權利要求1所述的基于TaqDNA聚合酶末端轉移酶活性構建T載體的方法，其特征在于:所述二價金屬陽離子優(yōu)選I mM濃度的CdCl2。
4.根據(jù)權利要求1所述的基于TaqDNA聚合酶末端轉移酶活性構建T載體的方法，其特征在于:出發(fā)載體加入量與平末端內切酶酶量比例為:I Ug出發(fā)載體，加入10 U的平末端內切酶酶量 。
【文檔編號】C12N15/63GK103981200SQ201410231232
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年5月29日 優(yōu)先權日:2014年5月29日
【發(fā)明者】呂新, 李玥仁, 陳麗華, 劉蘭英, 李巍 申請人:福建省農業(yè)科學院中心實驗室