用于細胞三維灌流拉伸壓縮培養(yǎng)的生物力學(xué)系統(tǒng)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種用于細胞三維灌流拉伸壓縮培養(yǎng)的生物力學(xué)系統(tǒng)，包括細胞生物支架，用于模擬人體細胞真實的三維生長環(huán)境；生物反應(yīng)器，設(shè)有夾持所述細胞生物支架的夾具及容納所述細胞生物支架的腔體；蠕動泵，用于帶動細胞培養(yǎng)液進入所述生物反應(yīng)器進行灌流；施加載荷裝置，用于對鍵合的所述生物反應(yīng)器中的夾具提供周期性往復(fù)牽拉，進而對細胞施加拉伸或壓縮力學(xué)刺激；控制模塊，與計算機相連，對所述施加載荷裝置進行控制，調(diào)節(jié)樣品長度、拉伸比、往返頻率及往返次數(shù)。本發(fā)明模仿了體內(nèi)真實復(fù)雜的力學(xué)環(huán)境，在實現(xiàn)三維細胞培養(yǎng)的同時，實現(xiàn)可控的灌流拉伸或壓縮力學(xué)環(huán)境對細胞生長影響的定量化研究，探索細胞力學(xué)—生物學(xué)耦合規(guī)律。
【專利說明】用于細胞三維灌流拉伸壓縮培養(yǎng)的生物力學(xué)系統(tǒng)

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種生物力學(xué)的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，具體的講，用于對三維生物彈性支架中細胞的灌流拉伸或壓縮培養(yǎng)試驗，探索細胞力學(xué)一生物學(xué)耦合規(guī)律。

【背景技術(shù)】
[0002]作為生命體基本單元的細胞，一直處在復(fù)雜的三維力學(xué)環(huán)境中。力學(xué)刺激如何調(diào)控細胞骨架，細胞形態(tài)，細胞的增殖、分化等的機制尚不明確。研究表明，影響骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖、分化的力學(xué)因素主要有牽張應(yīng)變、剪切應(yīng)力、壓應(yīng)力、重力等。由于真實生物體內(nèi)環(huán)境復(fù)雜，因此在體外進行細胞的分離、培養(yǎng)及力學(xué)實驗是生物力學(xué)領(lǐng)域重要的研究方法。為考察力學(xué)刺激對細胞的影響，需要在三維環(huán)境的培養(yǎng)過程中施加力學(xué)刺激，研究力學(xué)信號對細胞的調(diào)控機制。
[0003]目前，通常用于生物力學(xué)實驗的力學(xué)刺激主要加載系統(tǒng)有四點彎曲、軸向牽拉、真空作用模型及Flexercell加載系統(tǒng)，這些加載系統(tǒng)主要針對二維膜結(jié)構(gòu)的培養(yǎng)基，通常依靠加載頻率及形變量調(diào)控力學(xué)刺激，對于三維材料的細胞培養(yǎng)并施加載荷的方法和裝置還不常見。裝置設(shè)計的難點在于，如何在三維系統(tǒng)中培養(yǎng)細胞并加以灌流拉伸/壓縮。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是針對目前細胞培養(yǎng)及力學(xué)加載裝置上的不足之處，提出一種三維灌流拉伸或壓縮培養(yǎng)的生物力學(xué)系統(tǒng),觀察三維環(huán)境中灌流拉伸或壓縮力學(xué)刺激對細胞生長影響的定量化研究，探索細胞力學(xué)一生物學(xué)耦合規(guī)律。
[0005]為了解決上述問題，本發(fā)明提供一種用于細胞三維灌流拉伸壓縮培養(yǎng)的生物力學(xué)系統(tǒng)，包括:
[0006]細胞生物支架，用于模擬人體細胞真實的三維生長環(huán)境；
[0007]生物反應(yīng)器，設(shè)有夾持所述細胞生物支架的夾具及容納所述細胞生物支架的腔體；
[0008]蠕動泵，用于帶動細胞培養(yǎng)液進入所述生物反應(yīng)器進行灌流；
[0009]施加載荷裝置，用于對鍵合的所述生物反應(yīng)器中的夾具提供周期性往復(fù)牽拉，進而對細胞施加拉伸或壓縮力學(xué)刺激；
[0010]控制模塊，與計算機相連，對所述施加載荷裝置進行控制，調(diào)節(jié)樣品長度、拉伸比、往返頻率及往返次數(shù)。
[0011]進一步，所述細胞生物支架為彈性多孔結(jié)構(gòu)，孔徑均一、貫通性好；具有良好的生物相容性或生物惰性，對細胞無毒無害；具備一定的機械強度，使其能夠在力的作用下不至于發(fā)生破壞，維持細胞所需要的空間環(huán)境；具備一定的結(jié)構(gòu)變形和恢復(fù)能力。
[0012]進一步，所述生物反應(yīng)器材質(zhì)為生物相容性良好的剛性塑料，由兩個生物容器和彈性支架夾具組成，所述生物容器上有溶液進出口，通過相應(yīng)硅膠管與裝有細胞培養(yǎng)液的藍口瓶相連，在所述蠕動泵作用下形成灌流的循環(huán)回路。
[0013]進一步，所述生物容器包括:
[0014]第一彈性夾持，上端設(shè)計有與施力裝置鍵合的部件，下端具有內(nèi)螺紋；
[0015]第二彈性夾持，兩端具有外螺紋，內(nèi)部為空腔，側(cè)壁具有溶液出入口 ；
[0016]第一彈性緊固件與第二彈性緊固件，所述第一彈性緊固件與第二彈性緊固件可拼接成一個圓環(huán)，所述圓環(huán)端面設(shè)有螺紋孔；
[0017]第三彈性夾持，為具有中心圓孔的端蓋形狀，具有內(nèi)螺紋；
[0018]所述第一彈性緊固件與第二彈性緊固件固定在第二彈性夾持一邊端面上，且所述第一彈性夾持與所述第三彈性夾持可分別旋合到所述第二彈性夾持兩端。
[0019]進一步，所述彈性支架夾具形狀為啞鈴狀，內(nèi)部中空，用于放置所述細胞生物支架；所述彈性支架夾具材料具有良好彈性的同時，具有很好的生物惰性，對細胞無毒；所述彈性支架夾具內(nèi)部腔壁與所述細胞生物支架固化在一起。
[0020]進一步，所述施加載荷裝置包括電機、電機固定法蘭、軸聯(lián)器、滑動軸承、銅滑塊、活動頭、光滑導(dǎo)軌、絲杠、導(dǎo)軌支撐、支撐板；所述電機通過軸聯(lián)器帶動所述絲杠旋轉(zhuǎn)，所述活動頭在絲杠和光滑導(dǎo)軌上做水平方向運動；所述施加載荷裝置由所述電機固定法蘭和導(dǎo)軌支撐安放于所述支撐板上，所述支撐板中部掏空，便于安裝生物反應(yīng)器。
[0021]進一步，所述光滑導(dǎo)軌上設(shè)一滑動軸承，用于保證在拉伸或壓縮過程中，增加水平方向的運動穩(wěn)定性；在拉伸過程中，電機轉(zhuǎn)速可調(diào)，可以實現(xiàn)不同拉伸頻率下的拉伸試驗。
[0022]進一步，通過銷釘將所述生物反應(yīng)器固定在所述活動頭和導(dǎo)軌支撐之間。
[0023]進一步，所述控制模塊在實驗室虛擬工作平臺LabVIEW中運行，先選擇匹配的串口名稱，根據(jù)需要定量調(diào)節(jié)樣品長度、拉伸比、往返頻率及往返次數(shù)；“開始”、“停止”鍵控制裝置的啟動及停止；所述蠕動泵蠕動頻率可控制灌流流速，流速用流量計測得。
[0024]相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有下列技術(shù)效果:
[0025]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的優(yōu)點在于:模仿了體內(nèi)真實復(fù)雜的力學(xué)環(huán)境，在實現(xiàn)三維細胞培養(yǎng)的同時，實現(xiàn)可控的灌流拉伸或壓縮力學(xué)環(huán)境對細胞生長影響的定量化研究，探索細胞力學(xué)一生物學(xué)耦合規(guī)律。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1為本發(fā)明的灌流拉伸或壓縮裝置結(jié)構(gòu)示意圖。
[0027]圖2為本發(fā)明的生物反應(yīng)器拆分圖。

【具體實施方式】
[0028]下文中將結(jié)合附圖對本發(fā)明的實施例進行詳細說明。需要說明的是，在不沖突的情況下，本申請中的實施例及實施例中的特征可以相互任意組合。
[0029]實施例一:
[0030]本發(fā)明提供了如附圖1-2所示的一種用于細胞三維灌流拉伸壓縮培養(yǎng)的生物力學(xué)系統(tǒng)，包括施加載荷裝置、生物反應(yīng)器、彈性細胞支架及程序控制部分等。
[0031]細胞生物支架(圖中未示出)，用于模擬人體細胞真實的三維生長環(huán)境；細胞生物支架為彈性多孔結(jié)構(gòu)，孔徑均一、貫通性好；具有良好的生物相容性或生物惰性，對細胞無毒無害；具備一定的機械強度，使其能夠在力的作用下不至于發(fā)生破壞，維持細胞所需要的空間環(huán)境；具備一定的結(jié)構(gòu)變形和恢復(fù)能力。利用造孔劑與有機溶劑均勻混合，澆注后固化成型，最后去除造孔劑，是制備多孔細胞生物支架材料的一種常用方法。該方法簡單實用，孔隙率高，孔徑可控。在本實施例中，利用聚二甲基硅氧烷(PDMS)與羥基磷灰石(HA)復(fù)合，改進造孔劑法，制備了一種彈性多孔細胞生物支架材料。其中PDMS作為一種生物惰性高分子材料，具有很好的彈性及可加工性。HA是人體中硬組織的主要無機成分，對骨的強度起主要作用。HA組分使材料具有良好的生物相容性，提高了材料的強度。將PDMS與HA按一定比例復(fù)合來制備三維彈性細胞生物支架，使得所制備的三維彈性細胞生物支架材料在保持良好彈性的同時有利于細胞在孔內(nèi)壁黏附。
[0032]如圖2，生物反應(yīng)器，設(shè)有夾持細胞生物支架的夾具及容納細胞生物支架的腔體；生物反應(yīng)器材質(zhì)為生物相容性良好的剛性塑料，由兩個生物容器10和一個彈性支架夾具11組成，生物容器10上有溶液進出口，通過相應(yīng)硅膠管與裝有細胞培養(yǎng)液的藍口瓶相連，在蠕動泵作用下形成灌流的循環(huán)回路。
[0033]生物容器10包括:第一彈性夾持13，上端設(shè)計有與施力裝置鍵合的部件19，通過銷釘將生物反應(yīng)器固定在活動頭9和導(dǎo)軌支撐12之間，下端具有內(nèi)螺紋；第二彈性夾持14，兩端具有外螺紋，內(nèi)部為空腔，側(cè)壁具有溶液出入口 18，下端有凹槽與彈性支架夾具11相連；第一彈性緊固件15與第二彈性緊固件16，第一彈性緊固件15與第二彈性緊固件16可拼接成一個圓環(huán)，圓環(huán)端面設(shè)有螺紋孔，用于固定彈性支架夾具11 ;第三彈性夾持17，為具有中心圓孔的端蓋形狀，具有內(nèi)螺紋；第一彈性夾持13與第三彈性夾持17可分別旋合到第二彈性夾持14兩端，并將第一彈性緊固件15與第二彈性緊固件16固定在第三彈性夾持17與第二彈性夾持14之間，保證了腔體的密封性。
[0034]彈性支架夾具11形狀為啞鈴狀，內(nèi)部中空，用于放置細胞生物支架；彈性支架夾具11材料具有良好彈性的同時，具有很好的生物惰性，對細胞無毒；彈性支架夾具11內(nèi)部腔壁與細胞生物支架固化貼合在一起。彈性支架夾具11和生物容器10固定，然后與拉伸或壓縮裝置鍵合。
[0035]蠕動泵，用于帶動細胞培養(yǎng)液進入生物反應(yīng)器進行灌流。
[0036]施加載荷裝置，用于對鍵合的生物反應(yīng)器中的夾具提供周期性往復(fù)牽拉，進而對細胞施加拉伸或壓縮力學(xué)刺激；施加載荷裝置包括電機2、電機固定法蘭1、軸聯(lián)器3、滑動軸承7、銅滑塊8、活動頭9、光滑導(dǎo)軌4、絲杠5、導(dǎo)軌支撐12、支撐板6 ;電機2通過軸聯(lián)器3帶動絲杠5旋轉(zhuǎn)，活動頭9在絲杠5和光滑導(dǎo)軌4上做水平方向運動；施加載荷裝置由電機固定法蘭I和導(dǎo)軌支撐12安放于支撐板6上，支撐板6中部掏空，便于安裝生物反應(yīng)器。光滑導(dǎo)軌4上設(shè)一滑動軸承7，用于保證在拉伸或壓縮過程中，增加水平方向的運動穩(wěn)定性；在拉伸過程中，電機2轉(zhuǎn)速可調(diào)，可以實現(xiàn)不同拉伸頻率下的拉伸試驗。
[0037]控制模塊，與計算機相連，對施加載荷裝置進行控制，調(diào)節(jié)樣品長度、拉伸比、往返頻率及往返次數(shù)。
[0038]控制模塊在實驗室虛擬工作平臺LabVIEW中運行，先選擇匹配的串口名稱，根據(jù)需要定量調(diào)節(jié)樣品長度、拉伸比、往返頻率及往返次數(shù)；“開始”、“停止”鍵控制裝置的啟動及停止；蠕動泵蠕動頻率可控制灌流流速，流速用流量計測得。
[0039]生物容器10中細胞培養(yǎng)液通過硅膠管與生物反應(yīng)器的溶液進出口 18相連，可進行灌流；在蠕動泵的作用下，溶液由入口進入生物反應(yīng)器，進行溶液灌流實驗，由出口流出，形成一個循環(huán)回路，為細胞的生長提供營養(yǎng)成分，蠕動泵的蠕動頻率控制灌流時溶液流速。同時，通過軟件設(shè)定好實驗參數(shù)，計算機控制施加載荷裝置，通過活動頭9和絲杠5牽引彈性支架夾具11，帶動支架材料及細胞拉伸運動。
[0040]具體實施:三維多孔細胞彈性支架制備如下所示:
[0041]PDMS/HAP漿料制備:乙酸乙酯與PDMS混合，PDMS:乙酸乙酯=3:1 (質(zhì)量比)。加入一定量HAP后球磨混合5h ；
[0042]多孔材料制備:將篩分后的NaCl與PDMS/HAP漿料灌入模具中，在80°C施加一定壓力，2h后固化。將固化后的材料從模具中取出，浸泡于超純水中，超聲處理，每兩小時換水一次，NaCl完全溶解后(1-2天時間)得到所需的彈性多孔材料；所得試樣為直徑為6mm，長度為1mm的圓柱體。
[0043]制備的彈性支架涂上固化液(PDMS及其固化劑道康寧184按照10:1的質(zhì)量比混合)，放入夾具內(nèi)腔，在80攝氏度固化2h;彈性支架夾具材料為醫(yī)用級硅橡膠，質(zhì)軟，有彈性，形狀為啞鈴狀，內(nèi)部中空，空腔直徑6mm，上下底座圓直徑18mm，高度為10mm。
[0044]生物容器10的材質(zhì)為生物相容性良好的的剛性塑料，內(nèi)部空腔可容納5ml — 1ml液體，溶液出入口內(nèi)徑為2mm，外徑為4_，與反應(yīng)器材質(zhì)相同，帶有螺紋，與生物容器螺旋固定，下端圓形凹槽直徑18mm,通過直徑6_的圓形通道與空腔相連。
[0045]將上述材料及藍口瓶、蠕動硅膠管、生物反應(yīng)器等高溫高壓滅菌，超級潔凈臺中將含有大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(rBMSCs)的懸液通過抽真空從支架材料頂部緩慢滴入支架材料，并在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h ;種植后將彈性夾具兩端放直于弟_■彈性夾持14凹槽中，通過第一彈性緊固件15、第二彈性緊固件16及6個螺釘固定，兩端的第一彈性夾持13與第三彈性夾持17采用螺紋螺緊，形成一個密封的通道，第三彈性夾持17為硅膠墊防止局部滲液；溶液出入口 18與硅膠管相連，并用鐵絲固定，硅膠管入口端通過蠕動泵通入藍口瓶，出口端直接通入藍口瓶中，形成灌流回路，蠕動泵蠕動頻率調(diào)節(jié)灌流速率，通過流量計測得；生物反應(yīng)器與施加載荷裝置通過銷釘鍵合，一端固定在導(dǎo)軌支撐12上，一端固定在活動頭9上，電機2通過軸聯(lián)器3帶動絲杠5和活動頭9在光滑導(dǎo)軌4上水平方向運動，從而牽引彈性支架夾具11帶動貼壁的三維多孔彈性細胞生物支架水平運動，對細胞施加拉伸力刺激；施加載荷裝置通過控制模塊與計算機連接，在拉伸控制軟件中選擇對應(yīng)串口名稱，設(shè)定好參數(shù)。本實例樣品長度為10mm，拉伸比10(10% )，往返頻率1HZ，往返次數(shù)21600，蠕動頻率為5HZ ;接通電源，開始細胞三維灌流拉伸培養(yǎng)。
[0046]結(jié)合實驗中的數(shù)據(jù)，并與靜態(tài)培養(yǎng)對照組比較，分析三維動態(tài)流體剪切環(huán)境和拉伸或壓縮刺激對細胞生命活動的影響，同時還可進行不同頻率不同拉伸比下的拉伸或壓縮刺激定量實驗及單獨的灌流實驗，揭示力學(xué)一生物學(xué)耦合規(guī)律。
[0047]以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種用于細胞三維灌流拉伸壓縮培養(yǎng)的生物力學(xué)系統(tǒng)，其特征在于包括: 細胞生物支架，用于模擬人體細胞真實的三維生長環(huán)境； 生物反應(yīng)器，設(shè)有夾持所述細胞生物支架的夾具及容納所述細胞生物支架的腔體； 蠕動泵，用于帶動細胞培養(yǎng)液進入所述生物反應(yīng)器進行灌流； 施加載荷裝置，用于對鍵合的所述生物反應(yīng)器中的夾具提供周期性往復(fù)牽拉，進而對細胞施加拉伸或壓縮力學(xué)刺激； 控制模塊，與計算機相連，對所述施加載荷裝置進行控制，調(diào)節(jié)樣品長度、拉伸比、往返頻率及往返次數(shù)。
2.如權(quán)利要求1所述的一種用于細胞三維灌流拉伸壓縮培養(yǎng)的生物力學(xué)系統(tǒng)，其特征在于: 所述細胞生物支架為彈性多孔結(jié)構(gòu)，孔徑均一、貫通性好；具有良好的生物相容性或生物惰性，對細胞無毒無害；具備一定的機械強度，使其能夠在力的作用下不至于發(fā)生破壞，維持細胞所需要的空間環(huán)境；具備一定的結(jié)構(gòu)變形和恢復(fù)能力。
3.如權(quán)利要求2所述的一種用于細胞三維灌流拉伸壓縮培養(yǎng)的生物力學(xué)系統(tǒng)，其特征在于: 所述生物反應(yīng)器材質(zhì)為生物相容性良好的剛性塑料，由兩個生物容器和彈性支架夾具組成，所述生物容器上有溶液進出口，通過相應(yīng)硅膠管與裝有細胞培養(yǎng)液的藍口瓶相連，在所述蠕動泵作用下形成灌流的循環(huán)回路。
4.如權(quán)利要求3所述的一種用于細胞三維灌流拉伸壓縮培養(yǎng)的生物力學(xué)系統(tǒng)，其特征在于，所述生物容器包括: 第一彈性夾持，上端設(shè)計有與施力裝置鍵合的部件，下端具有內(nèi)螺紋； 第二彈性夾持，兩端具有外螺紋，內(nèi)部為空腔，側(cè)壁具有溶液出入口 ； 第一彈性緊固件與第二彈性緊固件，所述第一彈性緊固件與第二彈性緊固件可拼接成一個圓環(huán)，所述圓環(huán)端面設(shè)有螺紋孔； 第三彈性夾持，為具有中心圓孔的端蓋形狀，具有內(nèi)螺紋； 所述第一彈性緊固件與第二彈性緊固件固定在第二彈性夾持一邊端面上，且所述第一彈性夾持與所述第三彈性夾持可分別旋合到所述第二彈性夾持兩端。
5.如權(quán)利要求4所述的一種用于細胞三維灌流拉伸壓縮培養(yǎng)的生物力學(xué)系統(tǒng)，其特征在于: 所述彈性支架夾具形狀為啞鈴狀，內(nèi)部中空，用于放置所述細胞生物支架；所述彈性支架夾具材料具有良好彈性的同時，具有很好的生物惰性，對細胞無毒；所述彈性支架夾具內(nèi)部腔壁與所述細胞生物支架固化在一起。
6.如權(quán)利要求5所述的一種用于細胞三維灌流拉伸壓縮培養(yǎng)的生物力學(xué)系統(tǒng)，其特征在于: 所述施加載荷裝置包括電機、電機固定法蘭、軸聯(lián)器、滑動軸承、銅滑塊、活動頭、光滑導(dǎo)軌、絲杠、導(dǎo)軌支撐、支撐板；所述電機通過軸聯(lián)器帶動所述絲杠旋轉(zhuǎn)，所述活動頭在絲杠和光滑導(dǎo)軌上做水平方向運動；所述施加載荷裝置由所述電機固定法蘭和導(dǎo)軌支撐安放于所述支撐板上，所述支撐板中部掏空，便于安裝生物反應(yīng)器。
7.如權(quán)利要求6所述的一種用于細胞三維灌流拉伸壓縮培養(yǎng)的生物力學(xué)系統(tǒng)，其特征在于: 所述光滑導(dǎo)軌上設(shè)一滑動軸承，用于保證在拉伸或壓縮過程中，增加水平方向的運動穩(wěn)定性；在拉伸過程中，電機轉(zhuǎn)速可調(diào)，可以實現(xiàn)不同拉伸頻率下的拉伸試驗。
8.如權(quán)利要求7所述的一種用于細胞三維灌流拉伸壓縮培養(yǎng)的生物力學(xué)系統(tǒng)，其特征在于: 通過銷釘將所述生物反應(yīng)器固定在所述活動頭和導(dǎo)軌支撐之間。
9.如權(quán)利要求8所述的一種用于細胞三維灌流拉伸壓縮培養(yǎng)的生物力學(xué)系統(tǒng)，其特征在于: 所述控制模塊在實驗室虛擬工作平臺LabVIEW中運行，先選擇匹配的串口名稱，根據(jù)需要定量調(diào)節(jié)樣品長度、拉伸比、往返頻率及往返次數(shù)；“開始”、“停止”鍵控制裝置的啟動及停止；所述蠕動泵蠕動頻率可控制灌流流速，流速用流量計測得。
【文檔編號】C12M3/00GK104342370SQ201410231024
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2014年5月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月28日
【發(fā)明者】石峰, 藍鼎, 王育人 申請人:中國科學(xué)院力學(xué)研究所