專利名稱：一種梅花鹿過氧化氫酶及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種梅花鹿過氧化氫酶及其制備方法。
背景技術(shù)：
過氧化氫酶(Hydrogen Peroxidase)又稱觸酶(Catalase, CAT),是一類廣泛存在于動物、植物和微生物體內(nèi)的末端氧化酶。真核生物的過氧化氫酶存在于紅細胞及某些組織內(nèi)的過氧化體中，是過氧化物酶體的標志酶，約占過氧化物酶體酶總量的40%。哺乳動物組織中過氧化氫酶含量差異很大，以肝臟中含量最高，結(jié)締組織中含量最低。過氧化氫酶的主要作用就是催化H2O2分解為H2O和02，使H2O2不致于和O2在鐵螯合物的作用下反應(yīng)生成非常有害的-0H，從而使細胞免于遭受毒害，它是生物防御體系的關(guān)鍵酶之一。鑒于含有過氧化物酶的抗氧化復(fù)合物可用于治療，故認為過氧化氫酶也可用于治療氧化損傷疾病。過氧化氫酶自1950年就開始應(yīng)用在工業(yè)生產(chǎn)中，廣泛用于生物、醫(yī)藥、臨床醫(yī)學(xué)和食品領(lǐng)域中的某些分析測定，以及食品和乳制品工業(yè)、紡織工業(yè)、環(huán)保產(chǎn)業(yè)、制漿和造紙工業(yè)，在醫(yī)療器械的消毒、葡萄糖酸的生產(chǎn)等方面也有越來越多的應(yīng)用。目前商業(yè)化的動物源過氧化氫酶，主要以牛肝提取物為主。梅花鹿為我國 傳統(tǒng)的珍貴藥用動物，其產(chǎn)品在我國擁有悠久的藥用歷史。例如鹿茸，入藥已有2000多年的歷史，是一味名貴的滋補強壯的中藥。明代李時珍《本草綱目》中記載有“鹿茸能生津補髓，養(yǎng)血益陽，強筋健骨，益氣強志”。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，進一步證明了鹿茸的藥理作用非常廣泛，具有調(diào)節(jié)機體新陳代謝、促進各種生理機能活動的作用。目前，梅花鹿過氧化氫酶基因為未知序列，尚未見報道?？寺÷乖催^氧化氫酶，并對其基因序列進行分析，并表達重組蛋白，無論是在工業(yè)化應(yīng)用領(lǐng)域，還是探究其藥理價值，都具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
為獲得梅花鹿過氧化氫酶基因序列并表達其重組蛋白，本發(fā)明提供了一種梅花鹿過氧化氫酶及其制備方法，本發(fā)明成功的克隆得到梅花鹿過氧化氫酶基因，對其基因序列進行分析并表達了其重組蛋白，無論是在工業(yè)化應(yīng)用領(lǐng)域，還是探究其藥理價值，都具有重要意義。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案
本發(fā)明首先提供了一種梅花鹿過氧化氫酶基因，所述梅花鹿過氧化氫酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述梅花鹿過氧化氫酶基因編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。 所述梅花鹿過氧化氫酶基因來源于梅花鹿。本發(fā)明還提供了一種梅花鹿過氧化氫酶基因的克隆方法，其特征在于所述梅花鹿過氧化氫酶基因的克隆方法如下(1)從新鮮梅花鹿肝臟中分離提取總RNA，將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再用PCR擴增；擴增結(jié)束后取PCR產(chǎn)物進行電泳檢測，并回收凝膠中的目標基因；
(2)將步驟(I)所得目標基因進行DNA序列測定，并對該目標基因進行序列和功能分析，最終確定梅花鹿過氧化氫酶基因；
步驟(I)中所述的從新鮮梅花鹿肝臟中分離提取總RNA的具體步驟如下
A.從低溫中取出新鮮梅花鹿的肝臟組織，在液氮中將IOOmg組織碾磨成粉末，趁液氮尚未揮發(fā)光時，將粉末轉(zhuǎn)移到1. 5ml Ep管中，加入1. Oml的Trizol ；
B.用Iml針筒，26-G號針頭抽吸勻漿液兩次以剪切基因組DNA，然后直接從針筒中將樣品轉(zhuǎn)移到無菌1. 5ml Ep管中；
C.加入200ml氯仿/異戊醇或氯仿，劇烈振蕩混勻30秒；所述氯仿/異戊醇的體積比為 24 :1 ；
D.臺式離心機上，12,OOOrpm,室溫離心5 min ；
E.轉(zhuǎn)移上清液到RNase-free1.5ml Ep管里，加入等體積異丙醇，室溫放置5 min ；
F.臺式離心機上，12,OOOrpm,室溫離心5min ； G.小心移去上清液，防止RNA沉淀丟失；
H.用70%酒精洗滌兩次，每次700μ 1，12，OOOrpm,室溫離心2min ；1.盡可能徹底地吸走上清，防止RNA沉淀丟失；
J.真空離心干燥3-5 min，或在室溫下使酒精完全揮發(fā)；
K.沉淀用30-50 μ I DEPC-H2O溶解。若沉淀難溶，68°C處理10 min ；
L.凝膠電泳，確定RNA的完整性和污染情況；
步驟(I)中所述的mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA的具體步驟如下
a.在PCR管中配制如下混合液共10μ1:
總 RNA I μ I
50 μ M Oligo dT (18) Primer I μ IdNTPs Mixture I μ I
其余為RNase free ddH20 ;所述dNTPs Mixture中各喊基的濃度為IOmM ；
b.65°C保溫5min后迅速在冰上冷卻2min以上；
c.離心數(shù)秒鐘使模版RNA和弓I物等物質(zhì)的混合液聚集于PCR管底部；
d.在上述PCR管中配置如下反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液,總體積為20μ1:
上述混合液10 μ I
5Χ PrimeScript Buffer 4 μ I40U/μ I RNase Inhibitor O. 5 μ I
200U/μ I PrimeScript Reverse Transcriptase 100 200untis 其余為 RNase free ddH20 ；
e.42°C 保溫 30 60min ；
f.70°C保溫15分鐘后冰上冷卻，得到的cDNA溶液可直接用于PCR擴增；
所述PCR擴增時所設(shè)計的引物為
Cat+ :5，-GCATCGCCACTCAGACAT-3，
Cat- :5’ - CGATCCGTGGGTACAGG-3’。
本發(fā)明還提供了一種梅花鹿過氧化氫酶，所述梅花鹿過氧化氫酶是由所述的梅花鹿過氧化氫酶基因編碼翻譯而成。本發(fā)明另外還提供了一種梅花鹿過氧化氫酶的制備方法，所述制備方法包括如下步驟1.梅花鹿過氧化氫酶基因的亞克隆；
.梅花鹿過氧化氫酶基因的表達采用畢赤酵母表達系統(tǒng)進行蛋白表達，構(gòu)建梅花鹿過氧化氫酶基因的重組表達載體，轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌后，提取畢赤酵母菌基因組DNA，PCR驗證轉(zhuǎn)化結(jié)果，培養(yǎng)陽性畢赤酵母菌，發(fā)酵并用甲醇誘導(dǎo)梅花鹿過氧化氫酶的表達；對表達產(chǎn)物進行功能測定，最終確定成功獲得梅花鹿過氧化氫酶；構(gòu)建重組載體所選用的質(zhì)粒是pPICZaC，所述畢赤酵母菌為GSl 15。所述步驟(i)中梅花鹿過氧化氫酶基因的亞克隆所用的引物如下
Pcat2+ CAAATCGATTATGGCGGACAACCGGGATC
Pcat- TGTTTCTAGAAGATTAGCTTTCTCCCTT ；
所述引物Pcat2+帶有Clal酶切位點，即上述序列的下劃線部分；
所述引物Pcat-帶有Xbal酶切位點，即上述序列的下劃線部分；
所述步驟(ii)中重組表達載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌的具體步驟如下
a.將畢赤酵母宿主菌株于100mlYPD培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)至0D600為1. 1-1. 3 ；
b.1500g-1700g離心5min收集菌體，將離心管倒置在吸水紙上輕拍數(shù)下，充分棄上
清；·
c.加入IOOml冰浴的高純水，于振蕩器上振蕩混勻；
d.離心，棄上清，再加IOOml高純水洗滌一次；
e.離心，棄上清，加20ml冰浴的IM山梨醇洗滌一次；
f.離心,棄上清,菌體置于冰浴中,加入約100- 200 μ I山梨醇，并混勻；
g.吸取100- 150 μ I感受態(tài)細胞添加到線性化的DNA中，用移液器吹吸混勻；
h.將上述樣品于冰浴中靜置5min,轉(zhuǎn)移入2mm電轉(zhuǎn)化杯中，放置于BioradMicropluser電轉(zhuǎn)儀上,使用儀器內(nèi)嵌的預(yù)設(shè)畢赤酵母電轉(zhuǎn)化程序“Pic”電擊一次；1.立即向電擊杯中加入Iml山梨醇，將全部液體轉(zhuǎn)入IOml離心管中，30°C靜置lh，然后加入Iml YPD培養(yǎng)基，300C，200rpm振蕩培養(yǎng)lh，取50 — 200 μ I菌液涂布于添加有終濃度100 μ g/mL的Zeocin抗生素的YPD培養(yǎng)基平板；培養(yǎng)3天，至單菌落形成；所述YPD培養(yǎng)基配方為1%酵母浸膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖；
所述畢赤酵母菌基因組DNA的提取步驟如下
使用裂解液提取基因組，裂解液配方2% (v/v)Triton X-100, 1% (w/v)SDS, IOOmMNaCl，pH8. O IOmM Tris base, pH8. 0 ImM EDTA ;具體實驗操作步驟如下
a.過夜培養(yǎng)IOml重組畢赤酵母菌液至0D600值為2_3；
b.2000rpm/min離心沉降細胞，然后以等體積的無菌蒸餾水洗滌，所述無菌蒸餾水預(yù)
先4°C保存；
c.將細胞沉淀在200μ I裂解緩沖液中重懸，然后加入約200 μ I的1:1苯酚/氯仿混和液；
d.漩渦震蕩l_2min;e.加入200μ I的TE緩沖液，倒置混合6-10次；
f.在微型離心機中以13000rpm/min的速度離心樣品5min；
g.將上層的水相轉(zhuǎn)移到干凈的微量離心管中；
h.加入400μ I氯仿；1.同步驟f離心；
j.將上層的水相轉(zhuǎn)移到新的微量離心管中； k.加Iml乙醇,翻轉(zhuǎn)混勻；1.在微型離心機中以13000rpm/min的速度離心2min ； m.棄上清液，用Iml的70%乙醇洗滌沉淀； η.完全棄去上清液，并將沉淀在室溫下干燥；
ο.在400 μ I含有終濃度為2 μ g/ml的核糖核酸酶的TE緩沖液中重懸浮沉淀； p. 37°C孵育 IOmin ； q.重復(fù)步驟i一 I ； r.在50 μ I TE緩沖液中重懸沉淀；
所述畢赤酵母菌發(fā)酵誘導(dǎo)梅花鹿過氧化氫酶表達的具體步驟為
a.將Zeocin抗性平板上的畢赤酵母單克隆接種于5mL的YPD培養(yǎng)基中，于恒溫搖床上30°C，220rpm振蕩培養(yǎng)12 16h ；
b.將上述培養(yǎng)液接種于50mL的YP培養(yǎng)基中，30°C，220rpm振蕩培養(yǎng)2h；
c.向培養(yǎng)物中添加100%的甲醇，使其終濃度達到O.5% ；甲醇每隔24h添加一次；
d.每隔24小時取出ImL的培養(yǎng)液，冷凍于_80°C冰箱；
e.發(fā)酵培養(yǎng)96h后，結(jié)束發(fā)酵，`取出培養(yǎng)液，離心，去除沉淀，SDS-PAGE電泳分析上清
液；
所述YP培養(yǎng)基配方為1%酵母浸膏，2%蛋白胨；
所述表達產(chǎn)物進行功能測定的步驟如下
使用市售雙氧水進行活性的定性檢測取一定體積的上述表達后的發(fā)酵上清液，滴加入雙氧水中；以未誘導(dǎo)的不添加甲醇的重組子發(fā)酵上清液、空宿主畢赤酵母GS115的發(fā)酵上清液以及空白的YP液體培養(yǎng)基為對照，以等體積同樣滴加入雙氧水中，觀察現(xiàn)象。有過氧化氫酶活性的樣品組產(chǎn)生氣泡。本發(fā)明的顯著優(yōu)點本發(fā)明提供了一種過氧化氫酶及其制備方法，本發(fā)明首次成功表達了梅花鹿過氧化氫酶，無論是在工業(yè)化應(yīng)用領(lǐng)域，還是探究其藥理價值，都具有重要意義。本發(fā)明畢赤酵母菌基因組DNA的提取步驟的優(yōu)點在于不需要使用物理方法(超聲波處理、液氮研磨、反復(fù)凍融等)或者酶法(蝸牛酶、幾丁質(zhì)酶、溶壁酶、溶菌酶處理等等)來破碎酵母細胞，更加簡便，節(jié)約時間，節(jié)約成本。


圖1為梅花鹿總RNA提取電泳 圖2為過氧化氫酶基因PCR電泳結(jié)果；其中泳道I為過氧化氫酶基因PCR結(jié)果；泳道M 為 TaKaRa 250bp DNA ladder marker ；
圖3為核酸測序得到的DNA序列所翻譯出的氨基酸序列編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)
果;
圖4為核酸測序得到的DNA序列所翻譯出的氨基酸序列的親疏水性分析結(jié)果；
圖5為核酸測序得到的目的基因核酸序列進化樹；
圖6為核酸測序得到的DNA序列所翻譯出的氨基酸序列進化樹；
圖7為鹿源與牛源的過氧化氫酶蛋白質(zhì)序列比對分析結(jié)果；其中CatD為梅花鹿過氧化氫酶蛋白質(zhì)序列；Bos Taurus為黃牛過氧化氫酶蛋白質(zhì)序列；
圖8為質(zhì)粒與PCR產(chǎn)物酶切電泳圖；其中M為TaKaRa 250bp DNA ladder marker ；1為Clal和Xbal酶切后并純化的亞克隆cat基因片段；2為Clal和Xbal酶切后并純化的pPICZ a C 質(zhì)粒；
圖9為菌落PCR電泳結(jié)果；其中M為TaKaRa 250 bp DNA ladder marker ； 1-5為菌落PCR產(chǎn)物；
圖10為重組質(zhì)粒單酶切電泳結(jié)果；其中M為TaKaRa 250bp DNA ladder marker ；I為Sacl單酶切重組質(zhì)粒；
圖11為基因組模板PCR擴增結(jié)果；其中M為TaKaRa 250bp DNA ladder marker ；1為cat基因；
圖12為發(fā)酵上清液SD S-PAGE電泳結(jié)果；其中M為TaKaRa broad protein marker ；1為pPICZ a C-cat-GS115發(fā)酵上清液；
圖13為過氧化氫酶活性測定標準曲線。
具體實施例方式下面通過具體實施示例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進一步說明，但是不能以此限制本發(fā)明的范圍。實施例1
本實施例的供試材料為新鮮梅花鹿QCervus)肝臟,購自福州市西營里市場。本
發(fā)明所用的實驗材料如無特別說明均為市售購買產(chǎn)品。I梅花鹿過氧化氫酶基因(cat)序列的克隆和測序.1.1梅花鹿Total RNA的提取,具體步驟如下
A.從低溫中取出鹿的肝臟組織，在液氮中將約IOOmg組織碾磨成粉末，趁液氮尚未揮發(fā)光時，將粉末轉(zhuǎn)移到1. 5ml Ep管中，加入1. Oml的Trizol。B.用Iml針筒，26-G號(6#)針頭抽吸勻漿液兩次以剪切基因組DNA，然后直接從針筒中將樣品轉(zhuǎn)移到無菌1.5ml Ep管中。C.加入200ml氯仿/異戊醇(24 I)或氯仿，劇烈振蕩混勻30秒。D.臺式離心機上，12, OOOrpm,室溫離心5分鐘。E.轉(zhuǎn)移上清液到RNase-free 1.5ml Ep管里，加入等體積異丙醇，室溫放置5分鐘。F.臺式離心機上，12，OOOrpm,室溫離心5min。G.小心移去上清液，防止RNA沉淀丟失。
H.用70%酒精洗滌兩次，每次700 μ 1，12，OOOrpm,室溫離心2min。1.盡可能徹底地吸走上清，防止RNA沉淀丟失。J.真空離心干燥3-5分鐘，或在室溫下使酒精完全揮發(fā)。K.沉淀用30-50 μ I DEPC-H20溶解。若沉淀難溶，68°C處理10分鐘。L.凝膠電泳，確定RNA的完整性和污染情況。梅花鹿肝臟Total RNA提取的凝膠電泳圖像如圖1所示，其中28SrRNA、18S rRNA條帶清晰可見，泳道前沿隱約能見5S rRNA條帶，說明Total RNA提取質(zhì)量較好，無明顯降解，可直接用于逆轉(zhuǎn)錄。1. 2逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA第一鏈
逆轉(zhuǎn)錄體系包括dNTPs、mRNA、RNA抑制劑、引物及逆轉(zhuǎn)錄酶，根據(jù)酶(MMLV或AMV)種類不同決定反應(yīng)溫度、pH值和時間。參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種，即引物、酶、dNTPs、模板和緩沖液(其中需要添加Mg2+)。PCR反應(yīng)共分3個步驟進行
A. DNA變性(90°C -96°C ):雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA。B.退火(25°C -65°C):系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。C.延伸(70°C -75°C):在Taq酶(在72°C左右Taq酶具有最高活性)的作用下，以dNTPs為原料，從引物的5'端一3'端延伸，合成與模板互補的DNA鏈。

本研究中RT-PCR的具體操作如下
a.在PCR 管中配制如下混合液共 10 μ1:Total RNA I μ I, Oligo dT (18) Primer(50 μ Μ) I μ I>dNTPs Mixture (IOmM each) I μ I>RNase free ddH20 Up to 10 μ I ；
b.65°C保溫5min后迅速在冰上冷卻2min以上。c.離心數(shù)秒鐘使模版RNA和引物等物質(zhì)的混合液聚集于PCR管底部。d.在上述PCR管中配置如下反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液
上述模版RNA/引物等的混合液10μ1、5Χ PrimeScript Buffer 4μ1、
RNase Inhibitor (40U/ μ1)0. 5μ1> PrimeScript Reverse Transcriptase (200U/μ I) 100 200untis
Rnase free ddH20 Up to 20 μ I ；
e.42°C 保溫 30 60min。f. 70°C保溫15分鐘后冰上冷卻，得到的cDNA溶液可直接用于PCR擴增。1. 3 cDNA的PCR擴增按下述組成配制PCR反應(yīng)液，全量50μ1。本研究中所有的PCR實驗，引物均用高純水配置為10 μ M工作液濃度。PCR 反應(yīng)液體系上述 cDNA 溶液 2μ1 ;dNTPs Mixture (2. 5mM each) 8M-1 ；Forward Primer (10 μ M)lM-l ；Reverse Primer (10 μ M)lM-l ； 10X PCR Buffer (Mg2+ Plus)5M-1 ；DNA polymerase (5U/M-1) 0. 5M-1 ;其余為水。PCR 程序如下94°C，4min、94°C，45s ；50 6(TC，30s ；72°C，90s,72°C，lOmin、
4°C ;循環(huán)數(shù)為35。根據(jù)Genbank報道的部分哺乳動物過氧化氫酶基因序列(ΝΜ_001035386，AB038231，NM_001752, NM_012520)，通過ClastalW進行序列對位排列，查找保守區(qū)，設(shè)計如下引物
Cat+ (SEQ ID NO. 3) :5’ GCATCGCCACTCAGACAT 3’，Cat- (SEQ ID NO. 4):5’ CGATCCGTGGGTACAGG 3’ 進行 PCR。RT-PCR 最終結(jié)果如圖 2所示，成功擴增出一條大約1. 5KB的目的條帶。1. 4純化回收目的DNA :本研究采用TIANGEN公司的雙功能DNA純化回收試劑盒純化回收目的DNA，具體步驟參照該產(chǎn)品的使用說明書TIANGEN公司雙功能DNA純化回收試劑盒(TIANGEN公司雙功能DNA純化回收試劑盒)。1. 5目的DNA與T載體連接T載體連接反應(yīng)液體系如下Τ載體50ng ;純化的DNA片段 10-50ng ;T4 DNA 連接酶 2-3weiss units ; IOX 連接緩沖液 Ιμ ；ddH20Up to10 μ I ;在PCR管中混合各種物質(zhì)，16°C保溫30min即可。1. 6轉(zhuǎn)化與測序?qū)載體連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化大腸桿菌T0P10，挑取單菌落，并將其命名為pGEM-cat,送交測序公司(Invitrogen Custom Service)使用T7和SP6測序引物測序。2梅花鹿過氧化氫酶基因的核酸序列和氨基酸序列的的特征和功能分析
上述PCR產(chǎn)物測序結(jié)果全長1717bp序列詳見序列表(SEQ ID NO.1)，通過Blast比對，確定其中1584bp為梅花鹿過氧化氫酶基因編碼區(qū)(CDS)。梅花鹿過氧化氫酶基因編碼527個氨基酸(氨基酸序列詳見序列表SEQ ID NO. 2),其中61個Strongly Basic (+) AminoAcids (K, R)，65 個 Strongly Acidic(-) Amino Acids (D, E)，167 個 Hydrophobic AminoAcids (A, I, L, F, ff, V)，以及 127 個 Polar Amino Acids (N, C, Q, S, T, Y)。使用Expasy對梅花鹿過氧化氫酶的蛋白質(zhì)序列進行分析，其編碼蛋白的理論計算分子量為60027. 4 Da ltons，理論計算等電點為6. 67，預(yù)測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中不含有二硫鍵，在蛋白質(zhì)序列中，如圖3所示，有一段FdReripERvvHakGAG序列具有過氧化氫酶家族活性中心的顯著特征，另有一段序列RLFAYpDTH具有過氧化氫酶家族亞鐵血紅素的顯著特征。使用Kyte&Doolittle算法對梅花鹿過氧化氫酶的蛋白質(zhì)序列進行親疏水性分析，結(jié)果如圖4所示，表明在第140-160位殘基和第310-320位殘基附近有典型的疏水性區(qū)域。在第1-20位殘基附近有一個典型的親水性區(qū)域。此蛋白整體是親水性的。親水性的蛋白一般適合采用異源蛋白表達系統(tǒng)進行重組蛋白表達。過氧化氫酶蛋白二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測采用PHD方法，梅花鹿過氧化氫酶預(yù)測結(jié)果如表I所示。蛋白質(zhì)序列中440位 500位的序列為alpha-螺旋，大部分結(jié)構(gòu)呈無規(guī)卷曲，出現(xiàn)少量的beta折疊。表I 二級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果
二級結(jié)構(gòu)a-螺旋beta折疊無規(guī)卷曲
預(yù)測百分比C5/。) 20 Ι β ο
對梅花鹿過氧化氫酶的核酸序列進行分子進化分析，構(gòu)建核酸進化樹，采用NJ算法，其結(jié)果如圖5所示，由圖可知，梅花鹿過氧化氫酶的核酸序列與NM_001035386.1 (Bostaurus catalase)以及 GQ204786.1 (Capra hircus catalase)的同源關(guān)系最近，說明過氧化氫酶的基因序列，在鹿、牛、羊等反芻動物中高度保守，而與NM_130912. KDanio reriocatalase)的同源關(guān)系相去甚遠，由此可見，在該基因的分子進化過程中，陸生哺乳動物與魚類具有很大的分化，這與自然界物種進化的規(guī)律是相一致的。圖6為梅花鹿過氧化氫酶蛋白質(zhì)序列NJ進化樹，由此圖同樣可知，ΝΡ_001030463.1 (catalase [Bos taurus])>ACS88258.1 (catalase [Capra hircus])與本課題所克隆的基因同源關(guān)系最近，和上述核酸進化樹的結(jié)論相一致。與其同源關(guān)系最遠的是家蠶的過氧化氫酶蛋白序列NP_001036912.1 (catalase [Bombyx mori])。對梅花鹿過氧化氫酶蛋白質(zhì)序列和與其序列同源性關(guān)系最接近的Bos taurus(黃牛)過氧化氫酶蛋白質(zhì)序列進行比對，結(jié)果如圖7所示，二者具有98%的同源性，但是在序列內(nèi)部，有9個位點的氨基酸組成存在差異。3梅花鹿過氧化氫酶蛋白質(zhì)的基因工程表達和功能(酶活性)的測定。3.1梅花鹿過氧化氫酶基因的表達
梅花鹿過氧化氫酶基因采用畢赤酵母表達系統(tǒng)進行蛋白表達，選用的質(zhì)粒是pPICZ α C，宿主酵母菌為GS115。首先，設(shè)計以下一對PCR引物進行過氧化氫酶基因亞克隆(產(chǎn)物大小為1600bp)
Pcat2+ (SEQ ID NO. 5) CAAATCGATTATGGCGGACAACCGGGATC (Clal)
Pcat- (SEQ ID NO. 6) TGTTTCTAGAAGATTAGCTTTCTCCCTT (Xbal)；
引物分別帶有Clal和Xbal酶切位點，以之前構(gòu)建的pGEM_cat質(zhì)粒作為模板，PCR擴增之后，使用Clal和Xbal內(nèi)切酶對PCR產(chǎn)物進行酶切，pPICZ a C質(zhì)粒也用這兩種酶進行雙酶切，純化回收酶切產(chǎn)物，電泳檢測結(jié)果如圖8所示，條帶分子量大小均正確，梅花鹿過氧化氫酶基因長度約1. 6Kb，線性化pPICZ a C質(zhì)粒長度約3. 6Kb。之后，使用T4 DNA連接酶連接上述基因和質(zhì)粒，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌。3. 2菌落PCR篩選 本研究采用了一種簡便快速的方法來鑒定重組子，即菌落PCR，該方法直接以大腸桿菌單菌落或者菌液作為模板進行PCR擴增，以擴增條帶的有無以及分子量大小判斷重組子的正確性。菌落PCR的具體步驟如下，首先，在PCR管中配置如表2所示的反應(yīng)液。表2菌落PCR反應(yīng)液成分
權(quán)利要求
1.一種梅花鹿過氧化氫酶基因，其特征在于所述梅花鹿過氧化氫酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種梅花鹿過氧化氫酶基因，其特征在于所述梅花鹿過氧化氫酶基因編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種梅花鹿過氧化氫酶基因，其特征在于所述梅花鹿過氧化氫酶基因來源于梅花鹿。
4.一種如權(quán)利要求1所述的一種梅花鹿過氧化氫酶基因的克隆方法，其特征在于所述梅花鹿過氧化氫酶基因的克隆方法如下 (1)從新鮮梅花鹿肝臟中分離提取總RNAJfmRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再用PCR擴增；擴增結(jié)束后取PCR產(chǎn)物進行電泳檢測，并回收凝膠中的目標基因； (2)將步驟(I)所得目標基因進行DNA序列測定，并對該目標基因進行序列和功能分析，最終確定梅花鹿過氧化氫酶基因。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種梅花鹿過氧化氫酶基因的克隆方法，其特征在于步驟(O中所述的從新鮮梅花鹿肝臟中分離提取總RNA的具體步驟如下 A.從低溫中取出新鮮梅花鹿的肝臟組織，在液氮中將IOOmg組織碾磨成粉末，趁液氮尚未揮發(fā)光時，將粉末轉(zhuǎn)移到1. 5ml Ep管中，加入1. Oml的Trizol ； B.用Iml針筒，26-G號針頭抽吸勻漿液兩次以剪切基因組DNA，然后直接從針筒中將樣品轉(zhuǎn)移到無菌1. 5ml Ep管中； C.加入200ml氯仿/異戊醇或氯仿，劇烈振蕩混勻30秒；所述氯仿/異戊醇的體積比為 24 :1 ; D.臺式離心機上，12000rpm,室溫離心5min ；E.轉(zhuǎn)移上清液到RNase-free1.5ml Ep管里，加入等體積異丙醇，室溫放置5 min ； F.臺式離心機上，12000rpm,室溫離心5min； G.小心移去上清液，防止RNA沉淀丟失； H.用70%酒精洗滌兩次，每次700μ 1，12000rpm,室溫離心2min ；1.盡可能徹底地吸走上清，防止RNA沉淀丟失； J.真空離心干燥3-5 min，或在室溫下使酒精完全揮發(fā)； K.沉淀用30-50 μ I DEPC-H2O溶解；若沉淀難溶，68°C處理10 min ； L.凝膠電泳檢測，確定RNA的完整性和污染情況； 步驟(I)中所述的mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA的具體步驟如下 a.在PCR管中配制如下混合液共10μ1:總 RNA I μ I ` 50 μ M Oligo dT (18) Primer I μ IdNTPs Mixture I μ I 其余為RNase free ddH20 ;所述dNTPs Mixture中各脫氧核糖核苷三磷酸濃度為`1OmM ； b.65°C保溫5min后迅速在冰上冷卻2min以上； c.離心數(shù)秒鐘使模版RNA和弓I物等物質(zhì)的混合液聚集于PCR管底部； d.在上述PCR管中配置如下反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液,總體積為20μ1:上述混合液10 μ I `5 X PrimeScript Buffer 4 μ I `40U/μ I RNase Inhibitor O. 5 μ I`200U/μ I PrimeScript Reverse Transcriptase 100 200untis其余為 RNase free ddH20 ； e.42°C 保溫 30 60min ； f.70°C保溫15分鐘后冰上冷卻，得到的cDNA溶液可直接用于PCR擴增。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種梅花鹿過氧化氫酶基因的克隆方法，其特征在于所述PCR擴增時所設(shè)計的引物為Cat+ :5，-GCATCGCCACTCAGACAT-3，Cat- :5’ - CGATCCGTGGGTACAGG-3’。
7.一種梅花鹿過氧化氫酶，其特征在于所述梅花鹿過氧化氫酶是由如權(quán)利要求1-3中任一所述的梅花鹿過氧化氫酶基因編碼翻譯而成。
8.如權(quán)利要求7所述的一種梅花鹿過氧化氫酶的制備方法，其特征在于所述制備方法包括如下步驟 (i)梅花鹿過氧化氫酶基因的亞克??； ( )梅花鹿過氧化氫酶基因的表達采用畢赤酵母表達系統(tǒng)進行蛋白表達，構(gòu)建梅花鹿過氧化氫酶基因的重組表達載體，轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌后，提取畢赤酵母菌基因組DNA，PCR驗證轉(zhuǎn)化結(jié)果，培養(yǎng)陽性畢赤酵母菌，發(fā)酵并用甲醇誘導(dǎo)梅花鹿過氧化氫酶的表達；對表達產(chǎn)物進行功能測定，最終確定成功獲得梅花鹿過氧化氫酶；構(gòu)建重組載體所選用的質(zhì)粒是pPICZaC，所述畢赤酵母菌為GSl 15。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種梅花鹿過氧化氫酶的制備方法，其特征在于所述步驟(i)中梅花鹿過氧化氫酶基因的亞克隆所用的引物如下Pcat2+ CAAATCGATTATGGCGGACAACCGGGATCPcat- TGTTTCTAGAAGATTAGCTTTCTCCCTT ； 所述引物Pcat2+帶有Clal酶切位點，即上述序列的下劃線部分； 所述引物Pcat-帶有Xbal酶切位點，即上述序列的下劃線部分。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種梅花鹿過氧化氫酶的制備方法，其特征在于所述步驟( )中重組表達載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌的具體步驟如下 a.將畢赤酵母宿主菌株于100mlYPD培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)至0D600為1. 1-1. 3 ； b.1500g-1700g離心5min收集菌體，將離心管倒置在吸水紙上輕拍數(shù)下，充分棄上清； c.加入IOOml冰浴的高純水，于振蕩器上振蕩混勻； d.離心，棄上清，再加IOOml高純水洗滌一次； e.離心，棄上清，加20ml冰浴的IM山梨醇洗滌一次； f.離心,棄上清,菌體置于冰浴中，加入約100- 200 μ I山梨醇，并混勻； g.吸取100- 150 μ I感受態(tài)細胞添加到線性化的DNA中，用移液器吹吸混勻； h.將上述樣品于冰浴中靜置5min,轉(zhuǎn)移入2mm電轉(zhuǎn)化杯中，放置于BioradMicropluser電轉(zhuǎn)儀上,使用儀器內(nèi)嵌的預(yù)設(shè)畢赤酵母電轉(zhuǎn)化程序“Pic”電擊一次；i.立即向電擊杯中加入Iml山梨醇，將全部液體轉(zhuǎn)入IOml離心管中，30°C靜置lh，然后加入Iml YPD培養(yǎng)基，300C，200rpm振蕩培養(yǎng)lh，取50 — 200 μ I菌液涂布于添加有終濃度100 μ g/mL的Zeocin抗生素的YPD培養(yǎng)基平板；培養(yǎng)3天，至單菌落形成；所述YPD培養(yǎng)基配方為1%酵母浸膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖； 所述畢赤酵母菌基因組DNA的提取步驟如下使用裂解液提取基因組，裂解液配方2% (v/v) Triton X-100，1% (w/v) SDS, IOOmM NaCl, ρΗ8. O IOmM Tris base, ρΗ8· O ImMEDTA ;具體實驗操作步驟如下 a.過夜培養(yǎng)IOml重組畢赤酵母菌液至0D600值為2_3； b.2000rpm/min離心沉降細胞，然后以等體積的無菌蒸餾水洗滌，所述無菌蒸餾水預(yù)先4°C保存； c.將細胞沉淀在200μ I裂解緩沖液中重懸，然后加入約200 μ I的1:1苯酚/氯仿混和液； d.漩渦震蕩l_2min； e.加入200μ I的TE緩沖液，倒置混合6-10次； f.在微型離心機中以13000rpm/min的速度離心樣品5min； g.將上層的水相轉(zhuǎn)移到干凈的微量離心管中； h.加入400μ I氯仿；1.同步驟f離心； j.將上層的水相轉(zhuǎn)移到新的微量離心管中； k.加Iml乙醇,翻轉(zhuǎn)混勻；1.在微型離心機中以13000rpm/min的速度離心2min ； m.棄上清液，用Iml的70%乙醇洗滌沉淀； n.完全棄去上清液，并將沉淀在室溫下干燥； ο.在400 μ I含有終濃度為2 μ g/ml的核糖核酸酶的TE緩沖液中重懸浮沉淀； p. 37°C孵育 IOmin ； q.重復(fù)步驟i一 I ； r.在50 μ I TE緩沖液中重懸沉淀； 所述畢赤酵母菌發(fā)酵誘導(dǎo)梅花鹿過氧化氫酶表達的具體步驟為 a.將Zeocin抗性平板上的畢赤酵母單克隆接種于5mL的YPD培養(yǎng)基中，于恒溫搖床上30°C，220rpm振蕩培養(yǎng)12 16h ； b.將上述培養(yǎng)液接種于50mL的YP培養(yǎng)基中，30°C，220rpm振蕩培養(yǎng)2h； c.向培養(yǎng)物中添加100%的甲醇，使其終濃度達到O.5% ；甲醇每隔24h添加一次； d.每隔24小時取出ImL的培養(yǎng)液，冷凍于_80°C冰箱； e.發(fā)酵培養(yǎng)96h后，結(jié)束發(fā)酵，取出培養(yǎng)液，離心，去除沉淀，SDS-PAGE電泳分析上清液； 所述YP培養(yǎng)基配方為1%酵母浸膏，2%蛋白胨； 所述表達產(chǎn)物進行功能測定的步驟如下 使用市售雙氧水進行活性的定性檢測取一定體積的上述表達后的發(fā)酵上清液，滴加入雙氧水中；以未誘導(dǎo)的不添加甲醇的重組子發(fā)酵上清液、空宿主畢赤酵母GS115的發(fā)酵上清液以及空白 的YP液體培養(yǎng)基為對照，取同體積滴加入雙氧水中，觀察現(xiàn)象；有過氧化氫酶活性的樣品組產(chǎn)生氣泡。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種梅花鹿過氧化氫酶及其制備方法，本發(fā)明提供的梅花鹿過氧化氫酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，梅花鹿過氧化氫酶基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本發(fā)明成功克隆得到此前未見報道的梅花鹿過氧化氫酶基因序列。通過序列比對，可以知道，梅花鹿過氧化氫酶基因在哺乳動物中是高度保守的，通過生物信息學(xué)分析，可知該基因長度適中，帶有典型的過氧化氫酶結(jié)構(gòu)域，對應(yīng)的蛋白質(zhì)序列具有較好的親水性，適合異源重組蛋白表達，之后采用畢赤酵母表達系統(tǒng)，成功實現(xiàn)了該基因的重組表達。梅花鹿過氧化氫酶的獲得無論是在工業(yè)化應(yīng)用領(lǐng)域，還是探究其藥理價值，都具有重要意義。
文檔編號C12N9/08GK103060344SQ20131003180
公開日2013年4月24日 申請日期2013年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月29日
發(fā)明者林峻 申請人:福州大學(xué)