專利名稱：細(xì)胞色素c氧化酶復(fù)合體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種2-酮基-L-古洛糖酸的重組生產(chǎn)及其中有用的生物材料。
細(xì)胞色素C氧化酶(細(xì)胞色素aa3；EC1.9.3.1)是在線粒體及許多細(xì)菌中的有氧呼吸電子傳遞系統(tǒng)中一種末端氧化酶。該酶是一種跨細(xì)胞質(zhì)膜復(fù)合體，其催化最終的電子傳出；周質(zhì)表面的亞鐵細(xì)胞色素C(電子供體)的再氧化/細(xì)胞質(zhì)表面的分子氧(電子受體)向水的還原。這些反應(yīng)與質(zhì)子跨膜排出偶連，且這種偶連對(duì)于由底物氧化的生物能量?jī)?chǔ)存是必不可少的。
不同類型的細(xì)胞色素復(fù)合體，例如，aa3,a1,caa3,o,bo,co,bd-型，已經(jīng)被證實(shí)其具有末端氧化酶的功能；已經(jīng)報(bào)道了一些末端氧化酶的純化及表征。Matsushita等報(bào)道了醋化醋桿菌(Acetobacter aceti)IFO3283含有兩個(gè)末端氧化酶，細(xì)胞色素a1及o，并且對(duì)細(xì)胞色素a1進(jìn)行了純化及表征(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)97:9863,1990；細(xì)菌學(xué)雜志174:122,1992)。Matsushita等同時(shí)也報(bào)道了從葡糖桿菌屬(Gluconobacter)中分離純化細(xì)胞色素o(生物化學(xué)生物物理學(xué)通報(bào)，894:304,1987)。Tayama等也揭示了醋化醋桿菌(A.aceti)中的末端氧化酶(細(xì)胞色素a1)基因(JP93-317054)；他們純化的氧化酶包括四個(gè)亞基(其分子量分別為72,34,21及13kDa)，且含有血紅素a及b。醋桿菌屬及葡糖桿菌屬中的氧化酶同屬醌醇氧化酶。細(xì)胞色素aa3(細(xì)胞色素C氧化酶)已從牛心，酵母，及包括脫氮副球菌(Paracoccousdenitrificans)(Solioz等，生物學(xué)化學(xué)雜志，257:1579-1582,1982)及類球紅細(xì)菌(Rhodobacter sphaeroides)(Hosler等，生物學(xué)化學(xué)雜志.,267:24264-24272,1992)的細(xì)菌中純化。
哺乳動(dòng)物(線粒體)細(xì)胞色素C氧化酶(aa3型)復(fù)合體含有13種不同的亞基；三種核心亞基Ⅰ,Ⅱ及Ⅲ(COⅠ,Ⅱ及Ⅲ)由線粒體DNA編碼，而其余的10種為核來源。細(xì)菌aa3型細(xì)胞色素C氧化酶也含有3種核心亞基，其與線粒體核心亞基同源。然而，據(jù)報(bào)道，純化時(shí)COⅢ容易丟失，結(jié)果導(dǎo)致制品中只含有COⅠ及COⅡ(Ludwig等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，77:196-200,1980)。隨著電化學(xué)質(zhì)子梯度的產(chǎn)生，含有2種亞基(COⅠ及COⅡ)的細(xì)胞色素C氧化酶復(fù)合體顯示出一種氧化還原活性。在使用脫氮副球菌(Haltia等，歐洲分子生物學(xué)雜志，10:2015-2021,1991)及類球紅細(xì)菌(Cao等，基因，101:133-137,1991)的情況中，兩亞基型(COⅠ/COⅡ)型及三亞基型(COⅠ/Ⅱ/Ⅲ)復(fù)合體分別由不同的純化方法分離。從遺傳學(xué)角度來講，編碼COⅡ及Ⅲ的基因位于操縱子中，而編碼COⅠ的基因位于獨(dú)立位點(diǎn)(Raitio等，歐洲分子生物學(xué)雜志，9:2825-2833,1987；Shapleigh等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，89:4786-4790,1992)。
如上所述末端氧化酶在有氧條件下的生長(zhǎng)中在還原分子氧過程中起到關(guān)鍵作用，在有氧發(fā)酵時(shí)，含有末端氧化酶的呼吸鏈對(duì)于完成底物氧化以產(chǎn)生氧化產(chǎn)物發(fā)揮了作用，在本申請(qǐng)中，其對(duì)于提高呼吸鏈的效率以有效氧化發(fā)酵至關(guān)重要。
氧化葡糖桿菌DSM4025由L-山梨糖經(jīng)L-山梨酮產(chǎn)生的2-酮基-L-古洛糖酸(以下稱2KGA)，是L-抗壞血酸生產(chǎn)工藝過程中的一個(gè)重要的中間產(chǎn)物(T.Hoshino等，EP 0366922 A)。底物L(fēng)-山梨糖至2KGA的氧化被認(rèn)為是通過呼吸電子傳遞鏈完成的。催化最終電子排至分子氧的末端氧化酶很可能是在2KGA生產(chǎn)系統(tǒng)及其他氧化還原組份中的一個(gè)動(dòng)力學(xué)速率限制步驟。
負(fù)責(zé)從L-山梨糖形成2KGA的原初脫氫酶已被分離(T.Hoshino等，EP606621 A)，然后該基因被克隆及測(cè)序；發(fā)現(xiàn)了四個(gè)同工酶(T.Hoshino等，EP832974 A)，且他們的直接電子受體細(xì)胞色素c551被純化，其基因被克隆(T.Hoshino等，EP 0869175 A)。然而，末端氧化酶卻未分離，其基因未克隆。
本發(fā)明的目的就是提供一種物質(zhì)，其可以提高細(xì)胞色素C氧化酶的數(shù)量及質(zhì)量，且改善在使新的細(xì)胞色素C氧化酶的基因可得的情況下由細(xì)胞色素C氧化酶完成的氧化發(fā)酵。保藏號(hào)為No.DSM4025的微生物氧化葡糖桿菌(Gluconobacter oxydans)，其為一個(gè)來源優(yōu)選實(shí)例，其提供了本發(fā)明的新的細(xì)胞色素C氧化酶及其遺傳物質(zhì)。
本發(fā)明提供了一種新的細(xì)胞色素C氧化酶復(fù)合體，其從自然界進(jìn)行分離或用遺傳工程手段制備。這樣一種具有細(xì)胞色素C氧化酶活性的酶復(fù)合體是可獲得的，或者得自起源于被鑒定為氧化葡糖桿菌DSM4025的微生物的生物學(xué)或遺傳物質(zhì)，或者得自具有氧化葡糖桿菌DSM4025鑒定特征的微生物的生物學(xué)和/或分類學(xué)上同源的培養(yǎng)物。這樣本發(fā)明提供了一種新的細(xì)胞色素C氧化酶復(fù)合體，其用做呼吸鏈中介導(dǎo)電子傳遞的關(guān)鍵成分。
這里作為例證的一種細(xì)胞色素氧化酶C復(fù)合體顯示出如下的物理化學(xué)特性(ⅰ)顯示出至少兩種核心亞基Ⅰ(coⅠ)及Ⅱ(CoⅡ)的存在，其中使用SDS-PAGE分析手段所獲得的COⅠ的表觀分子量大約是43+/-10kDa；COⅡ的表觀分子量大約是36+/-10kDa，且(ⅱ)吸收光譜顯示出aa3-型細(xì)胞色素C氧化酶；其在還原型減去氧化型的差別光譜上表現(xiàn)為605+/-1nm峰。這樣一種細(xì)胞色素C氧化酶復(fù)合體可以被提供為基本上均質(zhì)的分離物，它來自鑒定為氧化葡糖桿菌DSM4025的微生物的培養(yǎng)物，或者具有氧化葡糖桿菌DSM4025鑒定特征的微生物的生物學(xué)和/或分類學(xué)上同源的培養(yǎng)物。
本發(fā)明的一種新的細(xì)胞色素C氧化酶復(fù)合體同樣可以以一種重組酶的形式提供，其可以包括一個(gè)重組多肽作為核心亞基Ⅰ(COⅠ)，其中的重組多肽可以選自含有具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的多肽，及那些具有與所述序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列且能夠?yàn)閺?fù)合體提供細(xì)胞色素C氧化酶活性的多肽。更進(jìn)一步講，其它兩個(gè)亞基Ⅱ(COⅡ)及Ⅲ(COⅢ)可以為重組多肽，其選自含有如SEQ ID NOs:4,6和/或8所示的氨基酸序列的多肽，及那些含有具有與所述任一種氨基酸序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列且能夠?yàn)閺?fù)合體提供細(xì)胞色素C氧化酶活性的多肽。
作為本發(fā)明的另一方面，各自核心亞基，即COⅠ,COⅡ及COⅢ可以以重組多肽形式提供，其用于本發(fā)明的新的細(xì)胞色素C氧化酶復(fù)合體的組份。
這里作為例證的COⅠ為一重組多肽，其包含于細(xì)胞色素C氧化酶復(fù)合體，其中多肽包含有如SEQ lD No:2所示的氨基酸序列，或者該多肽具有與所述氨基酸序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列且能夠?yàn)閺?fù)合體提供細(xì)胞色素C氧化酶活性。一個(gè)重組的COⅠ可以為能夠?yàn)槿绫景l(fā)明所述的復(fù)合體提供細(xì)胞色素C氧化酶活性的一種多肽，其被一種重組DNA片段編碼，所述DNA片段包含選自下述組份的DNA序列(a)如SEQ ID No:1所示的DNA序列，及(b)編碼具有如SEQ ID No:2所示氨基酸序列或者具有與所述氨基酸序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列的多肽的DNA序列。
這里同樣作為例證的COⅡ?yàn)橹亟M多肽，其包含于本發(fā)明的細(xì)胞色素C氧化酶復(fù)合體，其中多肽包含如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，或者該多肽具有與所述氨基酸序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列且能夠?yàn)閺?fù)合體提供細(xì)胞色素C氧化酶活性。重組的COⅡ可以為能夠向如本發(fā)明所述的復(fù)合體提供細(xì)胞色素C氧化酶活性的一種多肽，其被一種重組DNA片段編碼，所述DNA片段包含選自下述組份的DNA序列(a)如SEQ ID NO:3所示的DNA序列，及(b)編碼具有如SEQ ID NO:4所示氨基酸序列或者具有與所述氨基酸序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列的多肽的DNA序列。
而且，這里作為例證的COⅢ為重組多肽，其包含于本發(fā)明的細(xì)胞色素C氧化酶復(fù)合體。這類多肽包含有如SEQ ID NOs:6及8中任一個(gè)或兩者所示的氨基酸序列，或者該多肽具有與上述SEQ ID No6和8的氨基酸序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列且能夠?yàn)閺?fù)合體提供細(xì)胞色素C氧化酶活性。一個(gè)重組的COⅢ可以為能夠向如本發(fā)明所述的復(fù)合體提供細(xì)胞色素C氧化酶活性的一種多肽，其被一種重組DNA片段編碼，所述DNA片段包含選自下述組份的DNA序列(a)如SEQ ID NO:5所示的DNA序列，(b)如SEQ ID NO:7所示的DNA序列，(c)編碼具有如SEQ ID NO:6所示氨基酸序列，或者具有與所述氨基酸序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列的多肽的DNA序列，及(d)編碼具有如SEQ ID NO:8所示氨基酸序列，或者具有與所述氨基酸序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列的多肽的DNA序列。
作為本發(fā)明的又一方面，提供了用遺傳工程手段制備各個(gè)核心亞基即COⅠ,COⅡ及COⅢ有用的重組DNA片段。這些重組多肽對(duì)于包含在本發(fā)明的新細(xì)胞色素C氧化酶復(fù)合體的組份是非常有用的。正如如上解釋的那樣，這些多肽應(yīng)該能夠?yàn)楸景l(fā)明的復(fù)合體提供細(xì)胞色素C氧化酶活性。
這兒例證的COⅠ的重組DNA片段是一種編碼包含在細(xì)胞色素C氧化酶復(fù)合體的多肽的DNA片段，且包括一種選自下述的DNA序列(a)如SEQ ID NO:1所示的DNA序列，及(b)編碼具有如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列或者具有與所述氨基酸序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列的多肽的DNA序列。
這里同樣作為例證的COⅡ的重組DNA片段是一種編碼包含在細(xì)胞色素C氧化酶復(fù)合體的多肽的DNA片段，且包括一種選自下述組份的DNA序列(a)如SEQ ID NO:3所示的DNA序列，及(b)編碼具有如SEQ ID NO:4所示氨基酸序列或者具有與所述氨基酸序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列的多肽的DNA序列。
而且，這里同樣作為例證的COⅢ的重組DNA片段是一種編碼包含在細(xì)胞色素C氧化酶復(fù)合體的多肽的DNA片段，且包括一種或多種選自下述組份的DNA序列(a)如SEQ ID NO:5所示的DNA序列，及(b)編碼具有如SEQ ID NO:7所示DNA序列或，(c)編碼具有如SEQ ID NO:6所示氨基酸序列或者具有與所述氨基酸序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列的多肽的DNA序列，及(d)編碼具有如SEQ ID NO:8所示氨基酸序列或者具有與所述氨基酸序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列的多肽的DNA序列。
此外，作為本發(fā)明的另一方面，其提供了一種含有一種或多種上述重組DNA片段的表達(dá)載體，其中載體對(duì)于在生物體如原核或真核宿主細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)是適宜的。
更進(jìn)一步說，提供一個(gè)重組生物體是本發(fā)明的另一方面，所述生物體導(dǎo)入了上述表達(dá)載體。本發(fā)明的這樣一個(gè)重組生物體對(duì)于本發(fā)明的重組細(xì)胞色素C氧化酶復(fù)合體的遺傳制備是非常有用的，且可用于在合適的培養(yǎng)基中從L-山梨糖或D-山梨糖醇制備2KGA的工藝。本發(fā)明所述重組生物體的宿主細(xì)胞可以是真核來源的，最好是哺乳動(dòng)物或植物細(xì)胞，也可以是原核來源的。這些宿主細(xì)胞特別是可以從細(xì)菌中獲得，最好是氧化葡糖桿菌DSM4025或者具有氧化葡糖桿菌DSM4025鑒定特征的微生物的生物學(xué)和/或分類學(xué)上同源的培養(yǎng)物。
本發(fā)明也可直接用于生產(chǎn)細(xì)胞色素C氧化酶的工藝，其包括在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述本發(fā)明重組生物體，特別是含有這里所例證的優(yōu)選DNA序列的重組生物體，且從培養(yǎng)基中回收細(xì)胞色素C氧化酶。
更進(jìn)一步，本發(fā)明也可直接用于從L-山梨糖或D-山梨糖醇中制備2KGA的工藝，其包括在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述本發(fā)明的重組生物體，且從培養(yǎng)物中回收2KGA。
下述圖及詳細(xì)說明可以進(jìn)一步闡述本發(fā)明。


圖1顯示的是氧化葡糖桿菌DSM4025的aa3型細(xì)胞色素C氧化酶的吸收光譜圖。在室溫下蛋白質(zhì)濃度為0.08mg/ml的含有0.5％蔗糖單月桂酸及5％甘油的25mM Na-HEPES(pH7.5)中記錄光譜。[A]顯示的是氧化型的光譜，[B]顯示的是還原型的光譜，[C]顯示的是還原型減去氧化型的差異光譜。
圖2顯示的是通過SDS-PAGE分析的純化的氧化葡糖桿菌DSM4025的細(xì)胞色素C氧化酶aa3。通過與2％SDS,50mM二硫赤蘚糖醇，62.5mMTris-HCl(pH6.8)及10％甘油在37℃下孵育5小時(shí)變性該純化酶(在0.5mg/ml蛋白質(zhì)濃度下)。按照Laemmli(自然，227:680-685,1970)的方法在12.5％丙烯酰胺濃度下進(jìn)行電泳，使用的緩沖液含有25mM Tris,0.192M甘氨酸，及0.1％SDS。A和B分別是6及3微克純化酶，C是低分子量預(yù)染色的SDS-PAGE標(biāo)準(zhǔn)液(Bio-Rad實(shí)驗(yàn)室，CA，美國(guó))。
圖3顯示的是來自于氧化葡糖桿菌DSM4025的COⅠ的部分氨基酸序列與來自其它生物的序列之對(duì)比。
圖4顯示的是來自于氧化葡糖桿菌DSM4025的COⅡ的部分氨基酸序列與來自其它生物的序列之對(duì)比。
圖5顯示的是來自于氧化葡糖桿菌DSM4025的COⅢ的部分氨基酸序列與來自其他生物的序列之對(duì)比。
圖6顯示的是來自于氧化葡糖桿菌DSM4025的細(xì)胞色素C氧化酶復(fù)合體的部分COⅠ,Ⅱ及Ⅲ基因的PCR擴(kuò)增的引物。
圖7顯示的是分別含有"COⅠ"及"COⅡ及Ⅲ"基因的8.0kb PstⅠ及9.3kb EcoRⅠ片段的物理圖譜。
圖8顯示的是來自于氧化葡糖桿菌DSM4025的完整的COⅠ氨基酸序列與來自其他生物的序列之對(duì)比。
圖9顯示的是用于表達(dá)來自于氧化葡糖桿菌DSM4025的細(xì)胞色素C氧化酶復(fù)合體的基因的pVKcoxes的遺傳圖譜。
本發(fā)明的新型細(xì)胞色素C氧化酶復(fù)合體屬于這樣的蛋白質(zhì)家族，其功能為一個(gè)末端氧化酶及其基因。更為確切的講，本發(fā)明的新型細(xì)胞色素C氧化酶可用作一個(gè)末端氧化酶氧化細(xì)胞色素C，脫氫酶的電子受體例如乙醇及乙醛脫氫酶(AADH)，因此在呼吸鏈中可用作介導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移的核心成份。本發(fā)明的細(xì)胞色素C氧化酶復(fù)合體可以是從自然界進(jìn)行分離的，或者借助遺傳工程的方式制備的。這樣的一個(gè)具有細(xì)胞色素C氧化酶活性的酶復(fù)合體可從起源于鑒定為氧化葡糖桿菌DSM4025的微生物的生物材料獲得，或者從具有氧化葡糖桿菌DSM4025鑒別特征的微生物的生物學(xué)和/或分類學(xué)上同源培養(yǎng)物獲得。
正如這兒所使用術(shù)語“具有氧化葡糖桿菌DSM4025鑒別特征的微生物的生物學(xué)和/或分類學(xué)上同源的培養(yǎng)物”指的是一種具有氧化葡糖桿菌DSM4025的下述14種特征中至少12種特征的微生物(a)從L-山梨糖生產(chǎn)2-KGA；(b)將乙醇氧化成乙酸；(c)將D-葡萄糖氧化成D-葡糖酸及2-酮基-D-葡糖酸；(d)顯示多元醇的生酮作用；(e)在pH為4及5甘露醇肉湯培養(yǎng)基中顯示出菌膜及菌環(huán)生長(zhǎng)(24小時(shí)培養(yǎng))，而且，在pH為4.5葡萄糖肉湯培養(yǎng)基中表現(xiàn)出菌膜生長(zhǎng)，(f)基本上不氧化甘油成二羥丙酮，(g)從山梨糖醇及葡糖二酸生產(chǎn)2-酮基-D-葡糖二酸，而不能從葡萄糖、果糖、葡萄糖酸、甘露醇或者2-酮基-D-葡糖酸生產(chǎn)，(h)呈多態(tài)狀，無明顯的緶毛，(i)從果糖中產(chǎn)生褐色色素，(j)當(dāng)與巨大芽孢桿菌(B.megaterium)或其細(xì)胞提取液共同培養(yǎng)時(shí)表現(xiàn)出好的長(zhǎng)勢(shì)，(k)對(duì)于鏈霉素敏感，(l)具有圓形末端的桿狀，(m)平均細(xì)胞直徑大約為0.3-0.6毫米，(n)平均細(xì)胞長(zhǎng)度大約為1-1.5毫米，且如HPLC所測(cè)，該微生物用HPLC進(jìn)行測(cè)量在培養(yǎng)基中以至少0.01g/L的2-KGA水平從L-山梨糖生產(chǎn)2-KGA。除此之外，詞組“具有氧化葡糖桿菌DSM4025鑒別特征的微生物的生物學(xué)上和/或分類學(xué)上同源的培養(yǎng)物”應(yīng)該被理解為涵蓋一種包含這樣的多核苷酸序列的微生物，該多核苷酸序列在高度嚴(yán)格的條件下可與另一編碼選自SEQ ID NO:2,4,6，及8的多肽之多核苷酸序列進(jìn)行雜交，正如本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的那樣，基于氨基酸序列的同源性就可鑒別該微生物。本發(fā)明的細(xì)胞色素C氧化酶復(fù)合體顯示出下列物理-化學(xué)特征該復(fù)合體顯示出aa3型細(xì)胞色素C氧化酶在還原型減去氧化型差別光譜上的吸收波長(zhǎng)，在605+/-1nm的吸收峰；在SDS-PAGE上，包含在細(xì)胞色素C氧化酶復(fù)合體的兩個(gè)多肽的表觀分子量大約為43+/-10kDa及36+/-10kDa。
本發(fā)明的一個(gè)新的重組酶復(fù)合體可以使用遺傳物質(zhì)進(jìn)行制備，所述遺傳物質(zhì)即起源于鑒定為氧化葡糖桿菌DSM4025的微生物或者具有氧化葡糖桿菌DSM4025鑒別特征的生物學(xué)上和/或分類學(xué)上同源的微生物的培養(yǎng)物的重組DNA片段。這樣一種新的細(xì)胞色素C氧化酶復(fù)合體可以包含至少一種重組多肽作為核心亞基之一。作為所述復(fù)合體核心亞基Ⅰ的重組多肽可以選自如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，和那些具有與上述序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列且能夠?yàn)閺?fù)合體提供細(xì)胞色素C氧化酶活性的多肽。同樣，另外的核心亞基Ⅱ(COⅡ)及Ⅲ(COⅢ)之一或者二者均可為重組多肽。COⅡ可以選自有如SEQ ID NO:4所示部分氨基酸序列的重組多肽，和那些具有與上述氨基酸序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列且能夠?yàn)閺?fù)合體提供細(xì)胞色素C氧化酶活性的多肽。COⅢ可以選自含有如SEQ IDNO:6和8所示的部分氨基酸序列，和那些具有與各氨基酸序列有85％或者更高相同性的部分氨基酸序列的多肽，只要這些重組多肽能夠?yàn)閺?fù)合體提供細(xì)胞色素C氧化酶活性。
術(shù)語“相同性”優(yōu)選地是指出現(xiàn)在各自位置的氨基酸不僅在其特性上相似，而且事實(shí)上也是相同的。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中氨基酸序列的比較是以最佳模式進(jìn)行的。
本發(fā)明也涉及包含在所述細(xì)胞色素C氧化酶復(fù)合體的多肽。包含在所述細(xì)胞色素C氧化酶復(fù)合體的多肽和描述于SEQ ID NOs:2,4,6及8的氨基酸序列最多與包含在其他細(xì)胞色素氧化酶的多肽及相應(yīng)的部分氨基酸序列顯示出50-82％的同源性。例如，本發(fā)明的COⅠ多肽(SEQ ID NO:2)與來自于脫氮副球菌的COⅠα(登記號(hào)No.P08305)和COⅠβ(登記號(hào)No.P98002)，及與來自于類球紅細(xì)菌的COⅠ(登記號(hào)No.P33517)分別顯示出77％，81％及79％的同源性。本發(fā)明的部分的COⅡ多肽(SEQ ID NO:4)與分別來自于脫氮副球菌及類球紅細(xì)菌的COⅡ多肽顯示出73％及68％的同源性。本發(fā)明的部分COⅢ多肽(SEQ ID NO:6)與來自于脫氮副球菌的COⅢ多肽顯示出54％的同源性。另一種多肽(SEQ ID NO:8)與分別來自于脫氮副球菌及類球紅細(xì)菌的COⅢ多肽顯示出71％及63％的同源性。這些同源性檢索可以通過計(jì)算機(jī)程序來進(jìn)行，例如通過這樣的程序"SearchHomology",Genetyx-SVIRC版本3.2.0(Genetyx軟件發(fā)展公司，東京，日本)。
這樣，各個(gè)核心亞基即COⅠ,COⅡ及COⅢ可以以重組多肽提供，這些多肽可用作本發(fā)明的新的細(xì)胞色素C氧化酶復(fù)合體的組份。
復(fù)合體中的亞基COⅠ可以是包含在本發(fā)明的細(xì)胞色素C氧化酶復(fù)合體中的重組多肽，該多肽包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或者該多肽包含與所述氨基酸序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列且能夠?yàn)閺?fù)合體提供如上所述的細(xì)胞色素C氧化酶活性。重組的COⅠ也可以是能夠?yàn)楸景l(fā)明的復(fù)合體提供細(xì)胞色素C氧化酶活性的多肽，其可以由含有選自下述DNA序列的重組DNA片段編碼(a)如SEQ ID NO:1所示的DNA序列，及(b)編碼具有如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列或者具有與所述氨基酸序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列的多肽的DNA序列。
同樣，亞基COⅡ可以是包含在本發(fā)明的細(xì)胞色素C氧化酶復(fù)合體中的重組多肽，該多肽包含如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，或者該多肽包含與所述氨基酸序列有85％或者更高的相同性的氨基酸序列且能夠?yàn)樗鰪?fù)合體提供如上所述的細(xì)胞色素C氧化酶活性。重組的COⅡ也可以是能夠?yàn)楸景l(fā)明的復(fù)合體提供細(xì)胞色素C氧化酶活性的多肽。其可以由含有選自下述DNA序列的重組DNA片段編碼(a)如SEQ ID NO:3所示的DNA序列，及(b)編碼具有如SEQ ID NO:4所示氨基酸序列或者具有與所述氨基酸序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列的多肽的DNA序列。
更進(jìn)一步說，亞基COⅢ可以為包含在本發(fā)明的細(xì)胞色素C氧化酶復(fù)合體中的重組多肽，其中多肽分別包含有如SEQ ID NO:6及8任一或兩者所示的氨基酸序列，或者具有與SEQ ID NO:6和8各個(gè)氨基酸序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列，只要所述重組多肽能夠?yàn)樗鰪?fù)合體提供細(xì)胞色素C氧化酶活性。重組的COⅢ可以為能夠向本發(fā)明所述的復(fù)合體提供細(xì)胞色素C氧化酶活性的重組多肽，其被包含一種或多種選自如下的DNA序列的重組DNA片段編碼(a)如SEQ ID NO:5所示的DNA序列，(b)如SEQ ID NO:7所示的DNA序列，(c)編碼具有如SEQ ID NO:6所示氨基酸序列，或者具有與所述氨基酸序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列的多肽的DNA序列，及(d)編碼具有如SEQ ID NO:8所示氨基酸序列，或者具有與所述氨基酸序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列的多肽的DNA序列。
更進(jìn)一步講，本發(fā)明還包括上述重組多肽的功能性衍生物。這些功能性衍生物是基于本發(fā)明的氨基酸序列確定的，其可以通過增加，插入，刪除，和/或置換該序列的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基來進(jìn)行，其中包含有這種衍生物的細(xì)胞色素C氧化酶復(fù)合體仍然具有可以通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員周知的檢定方法或者此處描述的具體技術(shù)所測(cè)量的細(xì)胞色素C氧化酶活性。這些功能性衍生物可通過化學(xué)肽合成或者基于本領(lǐng)域業(yè)已周知和公開的手段如Sambrook等的方法(出處同上)(“分子克隆”二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版1989，紐約)制備。一般來說不改變?cè)摲肿踊钚缘牡鞍踪|(zhì)及肽中的氨基酸交換是本技術(shù)領(lǐng)域的公知常識(shí)，例如H.Neurath及R.L.Hill在“蛋白質(zhì)”(學(xué)院出版社，紐約，1979，特別參見圖6,14頁)中所述。最常發(fā)生的交換為Ala/Ser,Val/Ile,Asp/Glu,Thr/Ser,Ala/Gly,Ala/Thr,Ser/Asn,Ala/Val,Ser/Gly,Tyr/Phe,Ala/Pro,Lys/Arg,Asp/Asn,Leu/Ile,Leu/Val,Ala/Glu,Asp/Gly，反過來也成立。
本發(fā)明涉及重組DNA片段，其編碼包含在所述細(xì)胞色素C氧化酶復(fù)合體的重組多肽，該復(fù)合體是呼吸鏈中介導(dǎo)電子傳遞的必須組分之一。
提供了可用于通過遺傳工程手段制備各個(gè)核心亞基即COⅠ,COⅡ及COⅢ的重組DNA片段。這類重組多肽可用于包含在本發(fā)明所述的新的細(xì)胞色素C氧化酶復(fù)合體的組份。
COⅠ的重組DNA片段可以是編碼包含在細(xì)胞色素C氧化酶復(fù)合體的多肽且含有選自有下列組份的DNA序列的DNA片段(a)如SEQ ID NO:1所示的DNA序列，及(b)編碼具有如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列，或者具有與所述氨基酸序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列的多肽的DNA序列。
COⅡ的重組DNA片段可以是編碼包含在細(xì)胞色素C氧化酶復(fù)合體的多肽且含有選自有下列組份的DNA序列的DNA片段(a)如SEQ ID NO:3所示的DNA序列，及(b)編碼具有如SEQ ID NO:4所示氨基酸序列，或者具有與所述氨基酸序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列的多肽的DNA序列。
更進(jìn)一步說，COⅢ的重組DNA片段可以是編碼包含在細(xì)胞色素C氧化酶復(fù)合體的多肽且含有一種或多種選自有下列組份的DNA序列的DNA片段(a)如SEQ ID NO:5所示的DNA序列，(b)如SEQ ID NO:7所示的DNA序列，(c)編碼具有如SEQ ID NO:6所示氨基酸序列，或者具有與所述氨基酸序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列的多肽的DNA序列，及(d)編碼具有如SEQ ID NO:8所示氨基酸序列，或者具有與所述氨基酸序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列的多肽的DNA序列。
本發(fā)明的重組DNA片段也可以包括一種DNA序列，其在下文將給出更詳盡論述的標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格條件下能夠與SEQ ID NO:1,3,5或7所示序列進(jìn)行雜交。
“標(biāo)準(zhǔn)條件”對(duì)于雜交來說意味著本領(lǐng)域普通技術(shù)人員用于檢測(cè)特定雜交信息及如Sambrook等(出處同上)所描述的條件，或最好稱為嚴(yán)格雜交及非嚴(yán)格清洗條件，或更優(yōu)選稱為中度嚴(yán)格條件，甚至更優(yōu)選嚴(yán)格雜交條件及嚴(yán)格清洗條件，這些對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員都是熟知的，也是為如Sambrook等(出處同上)所描述過的。
本發(fā)明同時(shí)也提供了一種表達(dá)載體，其含有一種或多種上述重組DNA片段，其中載體對(duì)于在生物體如原核或真核宿主細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)是適宜的。這樣的表達(dá)載體可以通過將一種或多種上述重組DNA片段插入到可能攜帶有本領(lǐng)域所熟知的表達(dá)調(diào)控元件的合適的載體中進(jìn)行構(gòu)建。
此外，本發(fā)明的重組生物體可以通過將上述表達(dá)載體引入一個(gè)合適的宿主細(xì)胞進(jìn)行制備。本發(fā)明的該重組生物體對(duì)于遺傳制備本發(fā)明的重組細(xì)胞色素C氧化酶復(fù)合體是非常有用的，其同樣適用于在合適的培養(yǎng)基中從L-山梨糖或D-山梨糖醇制備2KGA的工藝。本發(fā)明的重組生物體的宿主細(xì)胞可以是真核來源的，最好是哺乳動(dòng)物或植物細(xì)胞，但也可以是原核來源的。這些宿主細(xì)胞尤其可以從細(xì)菌中獲得，最好是氧化葡糖桿菌DSM4025或者具有氧化葡糖桿菌DSM4025鑒別特征的微生物的生物學(xué)上和/或分類學(xué)上同源的培養(yǎng)物。此外，宿主細(xì)胞也可以選自下述細(xì)菌，如大腸桿菌(Escherichia coli)，惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)，木醋桿菌(Acetobacter xylinum)，巴氏醋桿菌(Acetobacter pasteurianus)，醋化醋桿菌，漢氏醋桿菌(Acetobacterhansenii)，及氧化葡糖桿菌。
此外，本發(fā)明的另一目的是提供一種生產(chǎn)細(xì)胞色素C氧化酶的工藝，其包括在合適的培養(yǎng)基中培育上述定義的重組宿主細(xì)胞，且從該培養(yǎng)基中回收細(xì)胞色素C氧化酶。
本發(fā)明的細(xì)胞色素C氧化酶復(fù)合體同樣適用于改進(jìn)從L-山梨糖或D-山梨糖醇制備2KGA，此外，也適用于(不管是體內(nèi)還是體外)在有醇及醛脫氫酶存在下從相應(yīng)底物中生產(chǎn)醛類、碳酸類及酮類。
化合物2KGA是生產(chǎn)L-抗壞血酸的重要的中間物質(zhì)，其可按照著名的Reichstein方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。通過發(fā)酵從L-山梨糖或D-山梨糖醇中制備2KGA的工藝已經(jīng)已知[T.Hoshino等，EP 88116156 A]。已知葡糖桿菌屬菌株可以經(jīng)過山梨糖及山梨酮脫氫酶催化的反應(yīng)來生產(chǎn)2KGA，正如農(nóng)業(yè)生物化學(xué)，54(5),1211-1218,1990[T.Hoshino等]及在EP606621 A[T.Hoshino等]中揭示的那樣。負(fù)責(zé)從L-山梨糖或D-山梨糖醇制備2KGA的原初脫氫酶基因已經(jīng)獲得[T.Hoshino等，EP 832974 A]。此外，作為來自原初脫氫酶的電子受體的細(xì)胞色素C其基因同樣也已經(jīng)被分離[T.Hoshino等，EP 869175 A]。這些脫氫酶及細(xì)胞色素C已經(jīng)被用于體外生產(chǎn)2KGA。其基因已被用于構(gòu)造從L-山梨糖和D-山梨糖醇中制備2KGA的重組生物體，例如，攜帶有醇/醛脫氫酶(AADH)基因的惡臭假單胞菌與細(xì)胞色素C一起可從L-山梨糖制備2KGA。
因此，本發(fā)明的細(xì)胞色素C氧化酶用于生產(chǎn)2KGA的用途也是本發(fā)明的一個(gè)目的。
本發(fā)明的細(xì)胞色素C氧化酶復(fù)合體的末端氧化酶活性可以通過使用TMPD(N,N,N′,N′-四甲基-對(duì)-苯二胺二鹽酸鹽)進(jìn)行分光光度法測(cè)量。TMPD作為人工底物(電子供體)。反應(yīng)混合物例如，含有2.5mM TMPD,0.05％Tween-20及0.1M 3(N-嗎啉)丙磺酸鈉(Na-MOPS)(pH6.5)。TMPD氧化酶活性可以通過增加520nm的吸光值進(jìn)行測(cè)量，TMPD的摩爾系數(shù)認(rèn)為是6.1/mM/cm。一單位酶活性被定義為在室溫下每分鐘氧化1微摩爾的TMPD。
使用還原型減去氧化型的差別光譜通過檢測(cè)在605nm峰周圍的特征性陽性峰進(jìn)行a-型血紅素的分光光度鑒定和定量。每一樣品的還原可以通過添加微量連二亞硫酸鈉，氧化可以加入過硫酸銨。a-型血紅素的摩爾系數(shù)峰(605nm-630nm)認(rèn)為在11.7/mM/cm。
在以更詳盡的方式描述本發(fā)明之前，先來描述一下由獲自氧化葡糖桿菌DSM4025的亞基COⅠ及COⅡ組成的純化的細(xì)胞色素C氧化酶的物理化學(xué)特性。
(1)吸收光譜細(xì)胞色素C氧化酶復(fù)合體在還原型減去氧化型差別光譜的吸收?qǐng)D譜顯示于
圖1。
(2)分子量SDS-PAGE分析顯示，細(xì)胞色素C氧化酶的亞基COⅠ及COⅡ的表觀分子量分別為大約43+/-10及36+/-10Kda，顯示于圖2。
(3)COⅠ及COⅡ的氨基酸序列使用制備型圓盤SDS-PAGE(NA-1800,Nippon Eido Co,.)將純化的細(xì)胞色素C氧化酶復(fù)合體分解為COⅠ及Ⅱ兩個(gè)亞基。經(jīng)過未鑒定的修飾封閉兩個(gè)N-末端α-氨基酸殘基。然后部分消化的肽片段(15-45KDa MW.)經(jīng)過賴氨酰內(nèi)肽酶處理獲得，用從15％SDS-PAGE板上提取的條帶進(jìn)行分離，然后在Centricon-10(Amicon)中用15％甲醇及0.1％SDS洗，加入測(cè)序儀。分別從COⅠ及COⅡ獲得“KDIGLLYLVAAGVVGF”(SEQ ID NO:11)及“KASQFTHNTPLEIVWTIVPV”(SEQ ID NO:14)序列。
用于分離本發(fā)明的細(xì)胞色素C氧化酶的多肽及基因的優(yōu)選菌種為氧化葡糖桿菌菌株，其已按布達(dá)佩斯條約于1987年3月17日被保藏于德意志微生物保藏中心，Gottingen(德國(guó))，保藏號(hào)為DSM4025。而且，該菌株的傳代培養(yǎng)物也按布達(dá)佩斯條約被保藏于工業(yè)科技代理處，發(fā)酵研究所，日本，保藏號(hào)為氧化葡糖桿菌(Gluconobacter oxydans)FERM BP-3812(保藏日期1992年3月30日)。此外，EP278447也揭示了該菌株的特征。功能等同物，傳代培養(yǎng)物，及所述微生物的變種及突變體也可用于本發(fā)明。具有菌株DSM4025鑒別特征的微生物的生物學(xué)或分類學(xué)上同源的培養(yǎng)物也可被用作本發(fā)明所述細(xì)胞色素C氧化酶的多肽及基因的來源。
本發(fā)明所提供的細(xì)胞色素C氧化酶可以如此制備，方法是通過培養(yǎng)一合適的生物體，破壞細(xì)胞，將其從破壞的細(xì)胞的無細(xì)胞提取物中分離，純化，最好從生物體的可溶級(jí)分中分離并純化。
生物體可在有氧條件下培養(yǎng)在補(bǔ)充合適的營(yíng)養(yǎng)成分的含水的培養(yǎng)基中，在pH4～9之間進(jìn)行培養(yǎng)，優(yōu)選在含水的培養(yǎng)基中6～8之間進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)期的變化依賴于pH，溫度及所使用的培養(yǎng)基，通常2～6天就會(huì)出現(xiàn)有利的結(jié)果。實(shí)施該培養(yǎng)的優(yōu)選溫度范圍為約13℃到36℃，最好為約18℃到33℃。
一般情況下要求培養(yǎng)基含有下述營(yíng)養(yǎng)組份可同化的碳源，可消化的氮源，及無機(jī)物質(zhì)，維生素，微量元素及其它生長(zhǎng)促進(jìn)因子。作為可同化的碳源，甘油，D-葡萄糖，D-甘露醇，D-果糖，D-阿拉伯醇，L-山梨糖，D-山梨醇及其類似物可使用。
不同的有機(jī)或無機(jī)物也可用作氮源，可使用例如酵母提取液，肉膏提取物，蛋白胨，酪蛋白，玉米浸出液，尿素，氨基酸，硝酸鹽，銨鹽及其類似物。作為無機(jī)物，硫酸鎂，磷酸鉀，氯化鐵和氯化亞鐵，碳酸鈣及其類似物。
下面將要詳細(xì)描述經(jīng)過培養(yǎng)從生物體中分離及純化細(xì)胞色素C氧化酶及克隆基因/DNA序列的實(shí)施例。
(1)經(jīng)過離心或過濾從發(fā)酵肉湯中收獲細(xì)胞。
(2)細(xì)胞懸于緩沖液中，且用勻漿器、超聲波儀處理或者用溶菌酶及其類似物處理得到細(xì)胞的裂解液。
(3)使用常用的蛋白質(zhì)純化法例如硫酸銨沉淀法，透析法，離子交換色譜法，凝膠過濾色譜法及親和色譜法從生物體的破裂細(xì)胞的無細(xì)胞提取液中，優(yōu)選地可溶性級(jí)分中分離和純化細(xì)胞色素C氧化酶。
本發(fā)明所提供的細(xì)胞色素C氧化酶用作末端氧化酶氧化細(xì)胞色素C，來自屬于脫氫酶的酶之電子受體，用于從醇類及醛類生產(chǎn)醛類，羧酸類及酮類，尤其是從L-山梨糖或D-山梨糖醇經(jīng)過L-山梨酮(L-sorbosone)來生產(chǎn)2KGA。
簡(jiǎn)單來講，本發(fā)明所用的細(xì)胞色素C氧化酶基因、DNA序列、重組表達(dá)載體及重組生物體(也可稱為轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞)均可以通過下述步驟獲得(1)從發(fā)明所述的能夠提供細(xì)胞色素C氧化酶的重組生物體中分離染色體DNA，然后在大腸桿菌中構(gòu)建染色體DNA基因文庫。
(2)通過集落、噬菌斑、或Southern雜交法，PCR克隆法(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))或Western-blot分析法或類似方法；(3)由常用方法確定如上述所得細(xì)胞色素C氧化酶基因的核苷酸序列，以挑選含有所述細(xì)胞色素C氧化酶基因的重組DNA片段；且構(gòu)建其中細(xì)胞色素C氧化酶基因可充分表達(dá)的表達(dá)載體。
(4)通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)接合及電穿孔技術(shù)構(gòu)建攜帶有細(xì)胞色素C氧化酶基因的重組生物體。
用于本發(fā)明上述方面的材料和技術(shù)下面將詳細(xì)例證說明總?cè)旧wDNA可以被本領(lǐng)域貫知技術(shù)純化。通過下述方法，從總?cè)旧wDNA將編碼細(xì)胞色素C氧化酶的基因克隆于質(zhì)?；蚴删w載體中(ⅰ)經(jīng)過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳從凝膠中分離整個(gè)蛋白質(zhì)或肽酶處理的多肽片段，并且將其應(yīng)用于蛋白質(zhì)測(cè)序儀，例如應(yīng)用生物系統(tǒng)自動(dòng)氣相測(cè)序儀470A(Perkin Elmer Corp.,Norwalk,Conn.,美國(guó))確定來自于純化的細(xì)胞色素C氧化酶亞基的部分氨基酸序列，使用DNA合成儀例如應(yīng)用生物系統(tǒng)自動(dòng)DNA測(cè)序儀381A(Perkin Elmer)按照上述獲得的氨基酸序列來合成寡核苷酸探針，從帶有目的基因的該菌株基因文庫中分離攜帶有目的基因的克隆，方法是使用寡聚核苷酸探針通過集落、噬菌斑、或Southern雜交法；(ⅱ)使用免疫學(xué)方法用針對(duì)細(xì)胞色素C氧化酶亞基的抗體，從基因文庫中挑選表達(dá)細(xì)胞色素C氧化酶亞基的克??；或者(ⅲ)使用兩個(gè)寡聚核苷酸(按照上述確定的氨基酸序列合成)，使用PCR方法從總?cè)旧wDNA中擴(kuò)增DNA，然后通過集落、噬菌斑、或Southern雜交法用由此獲得的PCR產(chǎn)物作為探針，從構(gòu)建于大腸桿菌的基因文庫中分離攜帶有細(xì)胞色素C氧化酶亞基的完整基因的克隆。上述作用于細(xì)胞色素C氧化酶亞基的抗體可以通過使用純化的細(xì)胞色素C氧化酶亞基的蛋白質(zhì)或者其片段使用如酶學(xué)方法，73卷，46頁，1981所述方法獲得。
細(xì)胞色素C氧化酶基因的核苷酸序列可以通過大家熟知的雙脫氧鏈終止法使用M13噬菌體確定(Sanger F.等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，74:5463-5467,1977)。
為了表達(dá)細(xì)胞色素C氧化酶復(fù)合體亞基的基因，可以使用多種啟動(dòng)子；例如最初的位于所述細(xì)胞色素C氧化酶亞基的基因上游的啟動(dòng)子，抗生素抗性基因的啟動(dòng)子，例如Tn5卡那霉素抗性基因(Berg,D.E.,和C.M.Berg.1983。生物/技術(shù)1:417-435)，pBR322氨芐青霉素抗性基因，及大腸桿菌的β-半乳糖苷酶基因(lac),trp-、tac-、trc-啟動(dòng)子，λ-噬菌體啟動(dòng)子，及其它在宿主中(包括這樣的生物體，如細(xì)菌，諸如大腸桿菌，惡臭假單胞菌，木醋桿菌，巴氏醋桿菌，醋化醋桿菌，漢氏醋桿菌，及氧化葡糖桿菌，特別是氧化葡糖桿菌DSM4025，和哺乳動(dòng)物細(xì)胞及植物細(xì)胞)有功能的啟動(dòng)子。
為了上述目的，在編碼序列導(dǎo)入的宿主細(xì)胞中為可操縱的其他一些調(diào)控元件如Shine-Dalgarno(SD)序列(例如，AGGAGG等，包括在宿主細(xì)胞中可操作的天然或合成序列)及轉(zhuǎn)錄終止子(反向重復(fù)結(jié)構(gòu)，包括在宿主細(xì)胞中可操作的天然或合成序列)將被導(dǎo)入且與上述啟動(dòng)子一起使用。
宿主/克隆載體組合的廣泛多樣性可被應(yīng)用于克隆雙鏈DNA。克隆載體一般地說是質(zhì)?；蚴删w，其含有復(fù)制起點(diǎn)，調(diào)控元件，包含有多重克隆位點(diǎn)及選擇標(biāo)志如抗生素抗性基因(如氨芐青霉素，四環(huán)素，卡那霉素，鏈霉素，慶大霉素，壯觀霉素等抗性基因)的克隆位點(diǎn)。
在大腸桿菌中表達(dá)目的基因的優(yōu)選載體可從例如pBR322或其衍生物包括pUC18及pBluescriptⅡ,pACYC177,pACYC184[細(xì)菌學(xué)雜志，134:1141-1156,1978]或其衍生物等一般用于大腸桿菌的載體中的任一個(gè)選擇，也可從寬宿主范圍質(zhì)粒如RK2及RSF1010中選擇。在包括氧化葡糖桿菌DSM4025的葡糖桿菌屬及惡臭假單胞菌中表達(dá)目的基因的優(yōu)選載體可從在葡糖桿菌屬和/或惡臭假單胞菌中，以及在優(yōu)選的克隆生物(如大腸桿菌)中可復(fù)制的任何載體中選擇。優(yōu)選載體是寬宿主范圍載體，如粘粒載體(如pVK102)及其衍生物，和RSF1010及其衍生物，以及這樣的載體，其含有在葡糖桿菌屬中有功能的復(fù)制起點(diǎn)及另一個(gè)在大腸桿菌中有功能的復(fù)制起點(diǎn)。為了穩(wěn)定和有效表達(dá)克隆基因及有效培養(yǎng)攜帶有該克隆基因的宿主細(xì)胞，應(yīng)仔細(xì)考慮該載體的拷貝數(shù)量及其穩(wěn)定程度。含有轉(zhuǎn)座因子如Tn5的DNA序列也可被用作載體，以將目的基因引入適宜的宿主細(xì)胞中去尤其是其染色體中去。含有從優(yōu)選宿主細(xì)胞中分離出來的任一DNA的DNA序列與目的基因一起對(duì)于在優(yōu)選宿主尤其是染色體上引入目的DNA序列是非常有用的。該DNA序列可以通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)接合或者電穿孔技術(shù)轉(zhuǎn)移進(jìn)入優(yōu)選宿主。
可以作為宿主的有原核或真核起源的，且可包括生物體，哺乳動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞等。作為優(yōu)選的生物體，這兒可能提到的細(xì)菌如大腸桿菌，惡臭假單胞菌，木醋桿菌，巴氏醋桿菌，醋化醋桿菌，漢氏醋桿菌，氧化葡糖桿菌，及其他任何可以生產(chǎn)重組細(xì)胞色素C氧化酶的革蘭氏陰性菌。功能等同物，傳代培養(yǎng)物，突變體，及所述生物體的變異體也可被用于本發(fā)明。優(yōu)選的菌株為大腸桿菌K12及其衍生物，惡臭假單胞菌或者氧化葡糖桿菌DSM4025及具有菌株DSM4025鑒定特征的微生物的生物學(xué)或分類學(xué)上的同源培養(yǎng)物。
由本技術(shù)領(lǐng)域所熟知的方法，將編碼本發(fā)明細(xì)胞色素C氧化酶的DNA序列連接到含有控制區(qū)域如啟動(dòng)子和核糖體接合位點(diǎn)及轉(zhuǎn)錄終止子的適宜載體中，所述控制區(qū)域在上述宿主細(xì)胞中可操作以產(chǎn)生表達(dá)載體。
為了構(gòu)建攜帶有表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，可使用多種DNA轉(zhuǎn)移方法，包括轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)導(dǎo)，接合交配(14及15章，普通及分子細(xì)菌學(xué)方法，Philipp Gerhardt等編，美國(guó)微生物學(xué)會(huì)，1994)，及電穿孔技術(shù)。構(gòu)建轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的方法可以從分子細(xì)菌學(xué)領(lǐng)域熟知的方法中進(jìn)行選擇。一般的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)可用于大腸桿菌，假單胞菌屬及醋桿菌屬，轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)可同樣用于大腸桿菌接合轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，接合交配系統(tǒng)被廣泛用于革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌，包括大腸桿菌，惡臭假單胞菌及氧化葡糖桿菌。在WO89106688已描述了優(yōu)選的接合交配方法。接合可發(fā)生在液體介質(zhì)或固體表面，生產(chǎn)細(xì)胞色素C氧化酶的優(yōu)選受體選自大腸桿菌，惡臭假單胞菌及氧化葡糖桿菌。生產(chǎn)2KGA的優(yōu)選受體選自大腸桿菌，惡臭假單胞菌及氧化葡糖桿菌，其可以用適宜重組表達(dá)載體產(chǎn)生活性的AADH及細(xì)胞色素C。生產(chǎn)2KGA的優(yōu)選受體是氧化葡糖桿菌DSM4025。對(duì)于接合交配受體，經(jīng)常增加一個(gè)選擇性標(biāo)記，例如，萘啶酮酸或利福平抗性被經(jīng)常用到。
下述實(shí)施例進(jìn)一步證明了本發(fā)明，但并不作為對(duì)本發(fā)明的任何限制。
氧化葡糖桿菌DSM4025 30℃下有氧培養(yǎng)在5升FYC培養(yǎng)基中27小時(shí)，培養(yǎng)基組成為10％L-山梨糖(分別消毒)，0.05％甘油，1.6％尿素(分別消毒)，0.25％MgSO4×7H2O,6.25％面包酵母細(xì)胞，1.5％CaCO3(生產(chǎn)級(jí)，nacalai tesque,Kyoto，日本)及3.0％玉米漿，pH7.5(滅菌前)經(jīng)過培養(yǎng)，固體物質(zhì)如CaCO3及酵母細(xì)胞用低速離心進(jìn)行沉淀并棄去(1,000rpm,5分鐘)。存留在培養(yǎng)液上清液中的氧化葡糖桿菌DSM4025細(xì)胞在8,000rpm下離心20分鐘收集，并用含有0.25M NaCl及2mM MgCl2的25mM N-[2-羥乙基]哌嗪-N′-[4-丁磺酸]鈉(Na-HEPES)(pH7.5)進(jìn)行一次清洗。
最終的細(xì)胞(大約35g濕重)懸于大約200ml的含有0.5mM乙二氨四乙酸(EDTA)，0.5mM乙二醇-雙-β-氨基乙醚(EGTA)，0.5mM苯甲基磺酰氟(PMSF),1微克/毫升抑肽素A，1微克/毫升亮肽素，10微克/毫升DNaseI及10微克/毫升RNaseA的25mM Na-HEPES(pH7.5)中。懸浮細(xì)胞用French細(xì)胞壓碎勻漿器在1500kg/cm2下處理兩次。所得懸浮液在10,000rpm下離心10分鐘以去除細(xì)胞碎片，收集上清液作為無細(xì)胞抽提液(424.0mg蛋白)。無細(xì)胞抽提液在55000rpm下進(jìn)行超速離心1小時(shí)，以回收粗膜級(jí)分沉淀。粗膜級(jí)分在含有1.2％Tween20,0.25M NaCl,2mM MgCl2,0.5mM PMSF,1微克/毫升抑肽素A,1微克/毫升亮肽素的50ml之25mM Na-HEPES(pH7.5)中重懸浮，孵育1小時(shí)后洗去細(xì)胞膜。級(jí)分再一次在55000rpm下進(jìn)行超速離心1小時(shí)以回收洗過的膜級(jí)分沉淀物質(zhì)。洗過的膜級(jí)分在含有1.5％單月桂酸蔗糖(DOJIN Laboratories,Kumamoto，日本)，2mM EDTA及5％甘油的50ml之25mM Na-HEPES(pH7.5)中孵育1小時(shí)，以溶解膜結(jié)合蛋白，所得的懸浮液在55000rpm下進(jìn)行超速離心1小時(shí)，以獲得溶解的膜級(jí)分之上清液(50ml)。溶解膜級(jí)分的還原型減去氧化型差別光譜在605nm附近處顯示出特征性正峰；該峰對(duì)應(yīng)于每毫克粗蛋白內(nèi)容物0.41nmole的a-型血紅素。然后，溶解的膜級(jí)分中的膜結(jié)合蛋白被上樣到DEAE-Toyopearl 650M(TOSOH,Tokyo，日本)柱(ID2.2×5cm)中，其已經(jīng)用含有0.5％單月桂酸蔗糖及5％甘油的25mM Na-HEPES進(jìn)行平衡。用相同的緩沖液條件中線性梯度為0-0.35M的NaCl進(jìn)行分級(jí)分離。顯示a-型血紅素光譜的級(jí)分(在還原型減去氧化型差別光譜上的605nm周圍的正峰)及TMPD氧化酶活性在大約0.28M濃度的NaCl處洗脫。然后收集這些級(jí)分(64ml)，用含有45mM NaCl,5％甘油及0.5％單月桂酸蔗糖的45mM磷酸鉀緩沖液[KPB](pH7.6)進(jìn)行透析，酶溶液上樣到羥基磷灰石(TONEN Co.,Tokyo，日本)柱(ID1.5×6cm)，其已用相同的緩沖液進(jìn)行平衡。柱子用相同的緩沖液洗滌，然后用含有500mMNaCl,5％甘油及0.5％單月桂酸蔗糖的500mM KPB(pH7.6)洗滌，活性級(jí)分用含有900mM NaCl,5％甘油及0.5％單月桂酸蔗糖的900mM KPB(pH7.6)進(jìn)行洗脫且收集。來自羥基磷灰石柱的該級(jí)分(8.6mg蛋白)用含有0.5％單月桂酸蔗糖和5％甘油的25mM Na-HEPES(pH7.5)進(jìn)行透析，使用YM-30膜(Amicon Inc.,MA，美國(guó))經(jīng)超濾濃縮，且以純化蛋白儲(chǔ)于-30℃。
在0.5％單月桂酸蔗糖存在下，該純化蛋白用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(Native-PAGE)進(jìn)行分析，該蛋白顯示出一條呈綠色的可見條帶(不經(jīng)過蛋白染色)，其相應(yīng)于單一的蛋白帶(經(jīng)過蛋白染色)。純化蛋白具有2.6單位/毫克的TMPD氧化酶活性，且顯示出aa3型細(xì)胞色素C氧化酶的典型的吸收光譜譜型(圖.1)。a-型血紅素的量估計(jì)為19.2nmole/mg純化蛋白。就來自于洗滌膜的a-型血紅素含量而言純化倍數(shù)大約為100倍，回收率90％。這些結(jié)果表明純化蛋白是在氧化葡糖桿菌DSM4025中具有TMPD-氧化酶活性的主要成分(其可作為呼吸系統(tǒng)中的末端氧化酶)。在SDS-PAGE分析中，純化蛋白被分解為兩個(gè)蛋白組份一條顯示出一個(gè)寬帶，其表觀分子量大約為43,000(命名為COⅠ)，另一條顯示出一條窄帶，其表觀分子量大約為36,000(命名為COⅡ)(圖.2)。
根據(jù)脫氮副球菌，類球紅細(xì)菌及牛線粒體的總氨基酸序列對(duì)比以及純化的COⅠ及COⅡ多肽的氨基酸序列(SEQ ID NOs:11和14)，選擇下述氨基酸序列用于PCR引物以擴(kuò)增COⅠ及COⅡ基因的部分DNA序列SEQ IDNO:9及SEQ ID NO:10用于COⅠ基因；SEQ ID NO:15及SEQ IDNO:16用于COⅡ基因。已被報(bào)道包括在細(xì)胞色素C氧化酶復(fù)合體中的第三種組份(COⅢ)并不存在于從氧化葡糖桿菌DSM4025中純化的制品中；不存在的原因似乎是因?yàn)樵诩兓^程中已解離。為了證實(shí)且擴(kuò)增編碼推定的氧化葡糖桿菌DSM4025的COⅢ基因的部分DNA序列(如果存在的話)，選擇在脫氮副球菌、類球紅細(xì)菌及牛線粒體的三個(gè)COⅢ基因編碼的多肽中保守的兩個(gè)氨基酸序列(圖5.)SEQ ID NO:17及SEQ ID NO:18用于COⅢ基因。設(shè)計(jì)COⅠ,COⅡ或COⅢ各自的引物對(duì)(圖6)。使用GeneAmpTMDNA擴(kuò)增試劑盒(Takara Shuzo,Kyoto，日本)且按照供應(yīng)商的建議使用Parkin-Elmer Cetus Instruments熱循環(huán)儀進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)包括30個(gè)這樣的循環(huán)1)在94攝氏度下熱變性一分鐘；2)在42或者50攝氏度下退火兩分鐘；及3)在72攝氏度下合成3分鐘。反應(yīng)混合物(100微升)包含有200微摩爾的dNTP,2.9微摩爾(用于32簡(jiǎn)并性)或5.8微摩爾的(用于64簡(jiǎn)并性)的各引物，2.2ng氧化葡糖桿菌DSM4025的染色體DNA及25單位在提供的緩沖液中的Taq聚合酶。用瓊脂糖凝膠電泳(AGE)通過使用溴化乙錠染色來檢測(cè)PCR產(chǎn)物。結(jié)果，擴(kuò)增了具有期望長(zhǎng)度的DNA片段(COⅠ為大約180bp,COⅡ?yàn)榇蠹s180bp,COⅢ為大約300bp)。(2)PCR擴(kuò)增DNA片段的克隆和核苷酸測(cè)序從瓊脂糖凝膠中純化PCR擴(kuò)增的DNA片段，且被直接克隆進(jìn)入pCRTMⅡ載體中(Invitrogen公司，美國(guó))，DNA序列按照供應(yīng)商的提示測(cè)定。由PCR產(chǎn)物的核苷酸序列推導(dǎo)出來的氨基酸序列與序列對(duì)比中目標(biāo)位置的序列顯示出很大的同源性(圖3至圖5)。編碼COⅠ,COⅡ及COⅢ的部分氨基酸序列的PCR產(chǎn)物用32P進(jìn)行標(biāo)記，以分別獲得探針Pco1,Pco2，及Pco3。這些探針被用于Southern-或者集落雜交以檢測(cè)完整的COⅠ,COⅡ，及COⅢ基因。(3)使用PCR產(chǎn)物作為探針進(jìn)行氧化葡糖桿菌DSM4025染色體DNA的Southern-印跡分析用多種限制性內(nèi)切核酸酶消化的氧化葡糖桿菌DSM4025染色體DNA通過使用探針進(jìn)行Southern雜交。探針Pcol雜交于PstⅠ片段(8.0kb)，探針Pco2及Pco3雜交于EcoRⅠ片段上(9.3kb)。(4)在8.0kb PstⅠ片段(COⅠ)及9.3kb EcoRⅠ片段(COⅡ及COⅢ)中克隆完整的細(xì)胞色素C氧化酶基因氧化葡糖桿菌DSM4025的染色體DNA用PstⅠ或者ECoRⅠ完全消化，對(duì)所得的片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。切出大約9.3kb(7-12kb)的EcoRⅠ消化產(chǎn)物和大約8kb(6-10kb)的PstⅠ-消化產(chǎn)物，從凝膠中洗脫出來。回收的DNA片段與用PstⅠ或者EcoRⅠ消化的pUC19載體進(jìn)行連接以轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。大約獲得了1,000個(gè)轉(zhuǎn)化子作為PstⅠ-或EcoRⅠ-文庫。用探針Pco1對(duì)PstⅠ文庫進(jìn)行集落雜交，且對(duì)EcoRⅠ文庫用探針Pco2及Pco3雜交。從每一文庫中，獲得幾個(gè)陽性克隆。從克隆中抽提質(zhì)粒DNA，且用PstⅠ或者EcoRⅠ進(jìn)行消化；8.0kb PstⅠ片段與探針Pco1顯示出強(qiáng)的信號(hào)，9.3kb EcoRⅠ片段與探針Pco2及Pco3均顯示出強(qiáng)的信號(hào)。含有8.0kb PstⅠ片段的質(zhì)粒命名為pUCO01，含有9.3kb的EcoRⅠ片段的質(zhì)粒命名為pUCO23。(5)8.0kb PstⅠ和9.3kb EcoRⅠ片段的物理圖譜8.0kb PstⅠ及9.3kb EcoRⅠ片段的物理圖譜可以通過使用探針Pco1,Pco2及Pco3對(duì)多種限制性內(nèi)切核酸酶消化的片段進(jìn)行Southern雜交分析來構(gòu)建。編碼9.3kb EcoRⅠ片段的COⅡ及COⅢ基因的方向與距離可以用來自于部分核苷酸序列的引物(圖7)通過PCR方法來確定。(6)完整的COⅠ基因的核苷酸測(cè)序pUCO01上的COⅠ基因的核苷酸序列可以通過雙脫氧鏈終止法進(jìn)行測(cè)定。如圖7所示，一個(gè)來自于HindⅢ位點(diǎn)的上游的2.9kb的片段被測(cè)序，并在該片段上發(fā)現(xiàn)了一個(gè)開放閱讀框(1,674bp的CDS，存在于如SEQ ID NO:1所示的序列中)。該ORF編碼558個(gè)氨基酸序列的蛋白(序列表SEQ ID NO:2)，其包含一個(gè)與來自于純化的COⅠ的多肽片段的氨基酸序列(SEQ ID NO:11)，及從COⅠ的大約180bp的PCR產(chǎn)物[參見3-(1)]之DNA序列推斷的氨基酸序列(SEQ ID NO:13)相一致的區(qū)段。氧化葡糖桿菌DSM4025的COⅠ氨基酸序列與類球紅細(xì)菌，脫氮副球菌及牛線粒體相比較，分別顯示出78.7％,76.0％及53.3％的同源性(圖8)(7)編碼全部COⅠ,COⅡ，及COⅢ基因的表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建經(jīng)過完全的HindⅢ及部分的EcoRⅠ消化以一個(gè)3.5kb的片段從在pUCO0l的8.0kb PstⅠ片段中分離COⅠ基因(圖7)。按照pUCO23上的9.3kbECORⅠ片段的物理圖譜，COⅡ及COⅢ基因經(jīng)過完全的KpnⅠ消化及部分Psd消化以產(chǎn)生一個(gè)串聯(lián)形式的6.0kb的片段(圖7)。每一片段亞克隆進(jìn)pBluescriptⅡ SK+載體以獲得含有COⅠ基因的3.5kb片段的質(zhì)粒pBCO01及含有COⅡ和COⅢ基因的6.0kb片段的質(zhì)粒pBCO23。
正如圖9所示，含有COI基因的3.5kb片段及含有COⅡ及COⅢ基因的6.0kb片段被共同整合入一個(gè)表達(dá)載體中去，用于功能性表達(dá)細(xì)胞色素C氧化酶復(fù)合體(COⅠ,COⅡ，及COⅢ)的基因。首先，通過平端連接，將含有來自于pBCO23的COⅡ及COⅢ基因的6.0kb XbaⅠ-KpnⅠ片段插入質(zhì)粒載體pVK101的EcORⅠ位點(diǎn)。然后，將含有來自于pBCO01的COⅠ基因的3.5kbXbaⅠ-HindⅢ片段插入具有6.0kb的XbaⅠ-KpnⅠ片段的pVK1O1的BglⅡ位點(diǎn)。所得質(zhì)粒載體被命名為pVKcoxes。
培養(yǎng)所得的轉(zhuǎn)接合子GOS2RPM(pVKcoxes)及GOS2R(pVK1O2)，兩種轉(zhuǎn)接合子細(xì)胞按照實(shí)施例1的方法制備。通過下列實(shí)驗(yàn)測(cè)定，GOS2RPM(pVKcoxes)中的細(xì)胞色素C氧化酶水平類似于GOS2RPM(pVK1O2)。從這兩個(gè)菌株中，溶解的細(xì)胞膜級(jí)分按照實(shí)施例1的方法制備。首先，通過還原型減去氧化型差別光譜法(實(shí)施例1)，對(duì)應(yīng)于GOS2RPM(pVKcoxes)及GOS2R(pVK1O2)a-型血紅素含量分別為0.031及0.022nmole/毫克細(xì)胞蛋白。其次，測(cè)量細(xì)胞色素C(購買于Sigma，馬心臟Ⅵ型)比氧化速率。還原型的細(xì)胞色素C以連二亞硫酸鈉作為還原劑制備，過量的還原劑由PD-10柱(Pharmacia)處理兩次去除。反應(yīng)混合物由33mM還原型細(xì)胞色素C,25mM Na-HEPES(pH7.2),2％蔗糖單月桂酸及0.5mM EDTA組成。還原型細(xì)胞色素C的氧化速率由在550nm處吸收峰的減少來進(jìn)行測(cè)量，摩爾系數(shù)認(rèn)為是21.1/mM/cm。分別對(duì)應(yīng)于GOS2RPM(pVK102)及GOS2R(pVKcoxes)的還原型細(xì)胞色素C的比氧化速率分別為1.58及2.00nmole/毫克細(xì)胞蛋白每分鐘。第三，COⅠ及COⅡ組份的含量通過針對(duì)組份COⅠ或COⅡ的抗體之Western-blot分析比較獲得。在GOS2RPM(pVKcoxes)上可以觀察到更強(qiáng)的條帶強(qiáng)度(使用CCD照相機(jī)，對(duì)于COⅠ增加60％，對(duì)于COⅡ增加41％)。這些結(jié)果提示，引入pVKcoxes導(dǎo)致在產(chǎn)生2KGA的氧化葡糖桿菌DSM4025衍生物中細(xì)胞色素C氧化酶復(fù)合體水平的功能性擴(kuò)增。
序列表<110>F.HOFFMANN-LA ROCHE AG<120>細(xì)胞色素C氧化酶及其基因<130>細(xì)胞色素C氧化酶及其基因<140><141><160>18<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>1674<212>DNA<213>氧化葡糖桿菌<220><221>CDS<222>(1)..(1674)<400>1atg gca gac gcc gcc att cac ggc cat gac cac cat gag aag caa ggc 48Met Ala Asp Ala Ala Ile His Gly His Asp His His Glu Lys Gln Gly15 10 15ttc ttc acg cgc tgg ttc atg tcg acc aac cac aaa gac atc ggt ctg 96Phe Phe Thr Arg Trp Phe Met Ser Thr Asn His Lys Asp Ile Gly Leu20 25 30cta tac ctt gta gcg gct ggt gtt gtt ggt ttc att tcc gtc ctg ttc 144Leu Tyr Leu Val Ala Ala Gly Val Val Gly Phe Ile Ser Val Leu Phe35 40 45acc gtc tac atg cgc ctt gag ctg atg gat ccg ggt gtt cag tac atg 192Thr Val Tyr Met Arg Leu Glu Leu Met Asp Pro Gly Val Gln Tyr Met50 55 60tgc ctt gaa ggc gca cgt ctg atc gcg gat gcc tcg cag aca tgt acg 240Cys Leu Glu Gly Ala Arg Leu Ile Ala Asp Ala Ser Gln Thr Cys Thr65 70 75 80gcg aac gga cac ctg tgg aac gtc atg gtt acc tac cat ggt att ctg 288Ala Asn Gly His Leu Trp Asn Val Met Val Thr Tyr His Gly Ile 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1．具有細(xì)胞色素C氧化酶活性的細(xì)胞色素C氧化酶復(fù)合體，它可獲自來源于鑒定為氧化葡糖桿菌DSM4025的微生物或具有氧化葡糖桿菌DSM4025鑒定特征的微生物的生物學(xué)和/或分類學(xué)上同源的培養(yǎng)物的生物學(xué)或遺傳材料。
2．如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞色素C氧化酶復(fù)合體，其顯示如下的物理化學(xué)特性(ⅰ)顯示出存在至少兩種核心亞基Ⅰ(COⅠ)及Ⅱ(COⅡ)，其中使用SDS-PAGE分析手段所獲得的COⅠ的表觀分子量大約是43+/-10kDa；以SDS-PAGE分析手段所獲得的COⅡ的表觀分子量大約是36+/-10kDa，且(ⅱ)吸收光譜顯示出aa3-型細(xì)胞色素C氧化酶；其在還原型減去氧化型的差別光譜上表現(xiàn)為605+/-1nm峰。
3．如權(quán)利要求1或2所述的細(xì)胞色素C氧化酶復(fù)合體，它是從鑒定為氧化葡糖桿菌DSM4025的微生物的培養(yǎng)物或具有氧化葡糖桿菌DSM4025鑒定特征的微生物的生物學(xué)和/或分類學(xué)上同源的培養(yǎng)物衍生的基本上同源的分離物。
4．如權(quán)利要求1-3之一所述的細(xì)胞色素C氧化酶復(fù)合體，它是重組酶。
5．如權(quán)利要求4所述的細(xì)胞色素C氧化酶復(fù)合體，它包含的重組多肽選自具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的多肽，及那些與所述序列具有85％或者更高相同性的氨基酸序列并能夠?yàn)閺?fù)合體提供細(xì)胞色素C氧化酶活性的多肽。
6．如權(quán)利要求4或5所述的細(xì)胞色素C氧化酶復(fù)合體，它含有至少一種重組多肽，該多肽選自含有由SEQ ID NO:4、6和/或8所示的氨基酸序列的多肽，及那些含有與所述氨基酸序列中的任意一個(gè)有85％或者更高相同性的氨基酸序列并能夠?yàn)閺?fù)合體提供細(xì)胞色素C氧化酶活性的多肽。
7．包含在如權(quán)利要求1-6之一所述的細(xì)胞色素C氧化酶復(fù)合體中的重組多肽，該多肽包含由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或該多肽包含與所述的氨基酸序列具有85％或者更高相同性的氨基酸序列并能夠?yàn)閺?fù)合體提供細(xì)胞色素C氧化酶活性。
8．能夠?yàn)槿鐧?quán)利要求1-6之一所述的復(fù)合體提供細(xì)胞色素C氧化酶活性的權(quán)利要求7所述的重組多肽，它由含有選自如下DNA序列的重組DNA片段編碼(a)由SEQ ID NO:1所示的DNA序列，及(b)編碼具有由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或者與所述氨基酸序列具有85％或者更高相同性的氨基酸序列的多肽的DNA序列。
9．包含在權(quán)利要求1-6之一所述的細(xì)胞色素C氧化酶復(fù)合體中的重組多肽，該多肽含有由SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，或者該多肽含有與所述氨基酸序列具有85％或者更高相同性的氨基酸序列且能夠?yàn)閺?fù)合體提供細(xì)胞色素C氧化酶活性。
10．能夠?yàn)闄?quán)利要求1-6之一所述的復(fù)合體提供細(xì)胞色素C氧化酶活性的如權(quán)利要求9所列舉的重組多肽，該多肽由含有選自如下DNA序列的重組DNA片段編碼(a)由SEQ ID NO:3所示的DNA序列，及(b)編碼具有由SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列或者與所述氨基酸序列具有85％或者更高相同性的氨基酸序列的多肽的DNA序列。
11．包含在權(quán)利要求1-6之一所述的細(xì)胞色素C氧化酶復(fù)合體中的重組多肽，該多肽含有由SEQ ID NO:6或8所示的氨基酸序列，或者該多肽具有與SEQ ID NO:6和8的任一個(gè)所述氨基酸序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列且能夠?yàn)樗龅膹?fù)合體提供細(xì)胞色素C氧化酶活性。
12．能夠?yàn)槿鐧?quán)利要求1-6之一所述的復(fù)合體提供細(xì)胞色素C氧化酶活性的如權(quán)利要求11所示的重組多肽，該多肽由含有選自下述DNA序列的重組DNA片段所編碼(a)如SEQ ID NO:5所示的DNA序列，(b)如SEQ ID NO:7所示的DNA序列，(c)編碼具有如SEQ ID NO:6所示氨基酸序列或者與所述氨基酸序列具有85％或者更高相同性的氨基酸序列的多肽的DNA序列，以及(d)編碼具有如SEQ ID NO:8所示氨基酸序列或者與所述氨基酸序列具有85％或者更高相同性的氨基酸序列的多肽的DNA序列。
13．一種重組DNA片段，其含有一種如權(quán)利要求8所述的DNA序列且它編碼一種能夠?yàn)槿鐧?quán)利要求1-6之一所述的復(fù)合體提供細(xì)胞色素C氧化酶活性的多肽的氨基酸序列，其中所述DNA序列選自(a)如SEQ ID NO:1所示的DNA序列，及(b)編碼具有如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列或者與所述氨基酸序列具有85％或者更高相同性的氨基酸序列的多肽的DNA序列。
14．一種重組DNA片段，其含有一種如權(quán)利要求10所述的DNA序列且其編碼一種包含于能夠?yàn)槿鐧?quán)利要求1-6之一所述的復(fù)合體提供細(xì)胞色素C氧化酶活性的多肽的氨基酸序列，其中，所述DNA序列選自(a)如SEQ ID NO:3所示的DNA序列，及(b)編碼具有如SEQ ID NO:4所示氨基酸序列或者具有與所述氨基酸序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列的多肽的DNA序列。
15．一種重組DNA片段，其含有一種如權(quán)利要求12所述的DNA序列且其編碼一種包含于能夠?yàn)槿鐧?quán)利要求1～6之一所述的復(fù)合體提供細(xì)胞色素C氧化酶活性的多肽的氨基酸序列，其中，所述DNA序列選自(a)如SEQ ID NO:5所示的DNA序列，(b)如SEQ ID NO:7所示的DNA序列，(c)編碼具有如SEQ ID NO:6所示氨基酸序列或者具有與所述氨基酸序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列的多肽的DNA序列，及(d)編碼具有如SEQ ID NO:8所示氨基酸序列或者具有與所述氨基酸序列有85％或者更高相同性的氨基酸序列的多肽的DNA序列。
16．一種含有選自如權(quán)利要求13,14及15所述片段的一種或多種重組DNA片段的表達(dá)載體，其中該表達(dá)載體適宜于在生物體中進(jìn)行表達(dá)。
17．如權(quán)利要求16所述的表達(dá)載體，其中，該生物體是一種微生物，其選自下述細(xì)菌如大腸桿菌，惡臭假單胞菌，木醋桿菌，巴氏醋桿菌，醋化醋桿菌，漢氏醋桿菌，及氧化葡糖桿菌。
18．如權(quán)利要求16所述的表達(dá)載體，其中該生物體是一種鑒定為氧化葡糖桿菌DSM4025的微生物或者具有氧化葡糖桿菌DSM4025鑒定特征的微生物的生物學(xué)和/或分類學(xué)上同源的培養(yǎng)物。
19．一種導(dǎo)入了由權(quán)利要求16-18中任一項(xiàng)所述的表達(dá)載體的重組生物體。
20．如權(quán)利要求18所述的重組生物體，其中，該重組生物體攜帶有一種或多種選自權(quán)利要求13,14及15所述的已整合進(jìn)其基因組中的DNA片段。
21．如權(quán)利要求19或20所述的重組生物體，其中宿主生物體是一種微生物，其選自下列細(xì)菌如大腸桿菌，惡臭假單胞菌，木醋桿菌，巴氏醋桿菌，醋化醋桿菌，漢氏醋桿菌，及氧化葡糖桿菌。
22．如權(quán)利要求19或20所述的重組生物體，其中該宿主生物體是一種鑒定為氧化葡糖桿菌DSM4025的微生物或者具有氧化葡糖桿菌DSM4025鑒定特征的微生物的生物學(xué)和/或分類學(xué)上同源的培養(yǎng)物。
23．一種生產(chǎn)細(xì)胞色素C氧化酶復(fù)合體的方法，其包括在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)如權(quán)利要求19-22之一所限定的重組生物體，且從培養(yǎng)物中回收細(xì)胞色素C氧化酶。
24．如權(quán)利要求23所述的生產(chǎn)方法，其中宿主生物體是微生物，其選自下列細(xì)菌如大腸桿菌，惡臭假單胞菌，木醋桿菌，巴氏醋桿菌，醋化醋桿菌，漢氏醋桿菌，及氧化葡糖桿菌。
25．如權(quán)利要求23所述的生產(chǎn)方法，其中該宿主生物體是一種鑒定為氧化葡糖桿菌DSM4025的微生物或者具有氧化葡糖桿菌DSM4025鑒定特征的微生物的生物學(xué)和/或分類學(xué)上同源的培養(yǎng)物。
26．一種從L-山梨糖或D-山梨糖醇中制備2-酮基-L-古洛糖酸的方法，其包括在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)如權(quán)利要求19-22中所述的重組生物體，及從培養(yǎng)物中回收2-酮基-L-古洛糖酸。
27．如權(quán)利要求26所述的方法，其中宿主生物體是一種微生物，其選自下列細(xì)菌如大腸桿菌，惡臭假單胞菌，木醋桿菌，巴氏醋桿菌，醋化醋桿菌，漢氏醋桿菌，及氧化葡糖桿菌。
28．如權(quán)利要求26所述的方法，其中該宿主生物體是鑒定為氧化葡糖桿菌DSM4025的微生物或者具有氧化葡糖桿菌DSM4025鑒別特征的微生物的生物學(xué)和/或分類學(xué)上同源的培養(yǎng)物。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的細(xì)胞色素C氧化酶復(fù)合體,用于制備所述復(fù)合體的遺傳材料,例如包含在細(xì)胞色素C氧化酶復(fù)合體的重組多肽,重組DNA片段,表達(dá)載體,重組生物體及其類似物。這種新的細(xì)胞色素C氧化酶復(fù)合體及遺傳材料可起源于具有氧化葡糖桿菌DSM 4025鑒定特征的微生物。本發(fā)明同樣也提供了一種制備所述新的重組細(xì)胞色素C氧化酶復(fù)合體的方法及一種生產(chǎn)2－酮基－L－古洛糖酸(2KGA)的方法。
文檔編號(hào)C12P7/60GK1303928SQ0013804
公開日2001年7月18日 申請(qǐng)日期2000年11月17日 優(yōu)先權(quán)日1999年11月17日
發(fā)明者淺倉昭, 星野長(zhǎng)尾, 真城正子 申請(qǐng)人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司