專利名稱：生物傳感器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可對試樣中的基質(zhì)進行迅速而高精度的定量的生物傳感器。
已開發(fā)的蔗糖、葡萄糖等糖類的定量分析法有使用施光度計法、比色法、還原滴定法和各種色譜法的方法等。但這些方法均由于對糖類的特異性不怎么高而精度低。在這些方法中，施光度計法雖然操作簡便，但受操作時的溫度的影響大。因此，施光度計法不適合作為一般家庭中使用的糖類定量方法。
近年來，已開發(fā)出各種類型的利用酶的特異性催化作用的生物傳感器。
下面，作為對試樣中的基質(zhì)進行定量的方法的一個例子，說明葡萄糖的定量方法。通常知道的電化學葡萄糖定量法有使用葡萄糖氧化酶(EC1.1.3.4，以下簡稱為GOD)和氧電極或過氧化氫電極的方法(例如，鈴木周一編《生物傳感器》講談社出版)。
GOD以氧為電子傳遞體，選擇性地將作為基質(zhì)的β-D-葡萄糖氧化成D-葡糖酸-δ-內(nèi)酯。在氧的存在下通過GOD進行氧化反應(yīng)的過程中，氧被還原成過氧化氫。利用氧電極，可測定氧的減少量，或者利用過氧化氫電極能夠測定過氧化氫的增加量。由于氧的減少量及過氧化氫的增加量與試樣中的葡萄糖含量呈正比， 因此，根據(jù)氧的減少量或過氧化氫的增加量能夠?qū)ζ咸烟沁M行定量。
在上述方法中，利用酶反應(yīng)的特異性，可高精度地測定試樣中的葡萄糖。但從反應(yīng)過程也可推測，其欠缺點是測定結(jié)果受試樣中所含氧濃度的影響大，如果試樣中不含氧，則不能測定。
由此，人們開發(fā)出了不是以氧為電子傳遞體、而是以鐵氰化鉀、二茂鐵衍生物、苯醌衍生物等有機化合物和金屬配合物為電子傳遞體的新型葡萄糖傳感器。該類型的傳感器使通過酶反應(yīng)而產(chǎn)生的電子傳遞體的還原體在作用電極上氧化，通過氧化電流量求得試樣中所含葡萄糖的濃度。此時，在反電極上，電子傳遞體的氧化體被還原，發(fā)生電子傳遞體的還原體的生成反應(yīng)。用上述有機化合物和金屬配合物代替氧作為電子傳遞體，可使已知量的GOD和它們的電子傳遞體在穩(wěn)定的狀態(tài)下正確地負載在電極上，形成試劑層，從而能不受試樣中的氧濃度的影響、高精度地進行葡萄糖定量。此時，由于可使含有酶和電子傳遞體的試劑層在接近干燥的狀態(tài)下與電極系形成一體，因此，以該技術(shù)為基礎(chǔ)的一次性葡萄糖傳感器近年來正倍受矚目。其代表性例子有日本特許第2517153號公報中記載的生物傳感器。這種一次性葡萄糖傳感器，只要在與測定器連接、但可離合的傳感器中導入試樣，就能夠容易地用測定器測定葡萄糖的濃度。該方法不僅可進行葡萄糖定量，還可對試樣中的其他基質(zhì)進行定量。
近年來，人們期望有一種電流響應(yīng)度更高的生物傳感器和基準濃度為零時的響應(yīng)(以下簡稱空白響應(yīng))低且保存穩(wěn)定性優(yōu)異的生物傳感器。
本發(fā)明提供一種具有包含與被供給的試液接觸、構(gòu)成電化學測定系的作用電極和反電極的電極系、支承上述電極系的絕緣性支承體、形成于上述作用電極上的第1試劑層、和形成于上述反電極上的第2試劑層的生物傳感器，其中，上述第1試劑層不含酶，至少含有電子傳遞體，且上述第2試劑層不含電子傳遞體，至少含有酶。
在一個較佳實施方式中，上述支承體由一個電絕緣性基板組成，該基板上形成有上述作用電極和反電極。
在另一個較佳實施方式中，上述支承體由電絕緣性基板及在與該基板之間形成試液供給通路的電絕緣性蓋件構(gòu)成，上述作用電極形成于上述基板上，上述反電極與上述作用電極對置，形成于上述蓋件的內(nèi)表面上。
較好的是，上述蓋件由在與上述基板之間形成試液供給通路或試液收容部的具有向外膨出的曲面部分的片材構(gòu)成。
更好的是，蓋件由具有形成上述試液供給通路的隙縫的隔板和覆蓋上述隔板的蓋板構(gòu)成。
第1試劑層最好含有親水性高分子。


圖1是本發(fā)明一實施例中的葡萄糖傳感器的垂直剖面圖。
圖2是除去了試劑層和表面活性劑層的同一葡萄糖傳感器的分解立體圖。
圖3是本發(fā)明另一實施例中的葡萄糖傳感器的垂直剖面圖。
圖4是除去了試劑層和表面活性劑層的同一生物傳感器的分解立體圖。
圖5是本發(fā)明又一實施例中的葡萄糖傳感器的垂直剖面圖。
圖6是除去了試劑層和表面活性劑層的同一葡萄糖傳感器的分解立體圖。
圖7是比較例中的葡萄糖傳感器的垂直剖面圖。
在本發(fā)明的一較佳實施方式中，生物傳感器具有電絕緣性基板、形成于上述基板上的作用電極和反電極、形成于上述作用電極上的第1試劑層、和形成于上述反電極上的第2試劑層，第1試劑層不含酶，至少含有電子傳遞體，且上述第2試劑層不含電子傳遞體，至少含有酶。
該生物傳感器由于作用電極上沒有酶，因此，不會出現(xiàn)酶吸附在作用電極上而影響作用電極上的電極反應(yīng)的情況，從而可使作用電極上的電子傳遞體的還原體的氧化反應(yīng)順利進行，提高電流響應(yīng)度。此外，由于酶與電子傳遞體相互分離，因此，可防止酶與電子傳遞體接觸而產(chǎn)生相互作用，抑制空白響應(yīng)的增加，并可抑制長期保存過程中的酶活性的變動。
在本發(fā)明的另一較佳實施方式中，生物傳感器具有電絕緣性基板、在與上述基板之間形成試液供給通路的電絕緣性蓋件、形成于上述基板上的作用電極、與上述作用電極對置、形成于上述蓋件內(nèi)表面上的反電極、形成于上述作用電極上的第1試劑層、和形成于上述反電極上的第2試劑層，第1試劑層不含酶，至少含有電子傳遞體，且上述第2試劑層不含電子傳遞體，至少含有酶。
上述蓋件由用于在與上述基板之間形成試液供給通路或試液收容部的、具有向外膨出的曲面部分的片材構(gòu)成。
更好的是，蓋件由具有形成上述試液供給通路的隙縫的隔板和覆蓋上述隔板的蓋板構(gòu)成。
在此生物傳感器中，由于第1試劑層和第2試劑層分別形成于不同的部件上，因此，可容易地形成互相分離的、組成互不相同的第1試劑層和第2試劑層。此外，由于作用電極和反電極形成于對向的位置上，因此，電極間的離子移動變得通順，可進一步增加電流響應(yīng)。
在蓋件由隔板和蓋板構(gòu)成的生物傳感器中，由于蓋板的物理強度增加，因此，由外部的物理壓力而引起的第1試劑層與第2試劑層的接觸不會出現(xiàn)，從而可防止由酶與電子傳遞體的接觸而導致的酶活性變動。
在上述任一實施方式的生物傳感器中，較好的是，至少第1試劑層含有親水性高分子。該親水性高分子可抑制蛋白質(zhì)等吸附在作用電極上，從而進一步提高電流響應(yīng)感度。此外，測定時，溶解在試液中的親水性高分子使試液的粘度增加，降低了對電流響應(yīng)的物理沖擊等，從而提高了電流響應(yīng)的穩(wěn)定性。
在本發(fā)明中，基板、隔板和蓋板的材料只要具有電絕緣性、在保存和測定時具有充分的剛性即可。例如，可以是聚乙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚酰胺、飽和聚酯等熱塑性樹脂，脲樹脂、三聚氰胺樹脂、酚醛樹脂、環(huán)氧樹脂、不飽和聚酯樹脂等熱固性樹脂。其中，從與電極的密合性的角度考慮，優(yōu)選聚對苯二甲酸乙二醇酯。
作用電極的材料只要是將電子傳遞體氧化時其自身不被氧化的導電性材料即可。反電極的材料可以是鈀、銀、鉑、碳等通常使用的導電性材料。
所用的酶是與作為試樣中所含測定對象的基質(zhì)的對應(yīng)物。其例子有果糖脫氫酶、葡萄糖氧化酶、醇氧化酶、乳酸氧化酶、膽固醇氧化酶、黃嘌呤氧化酶、氨基酸氧化酶等。
電子傳遞體的例子有鐵氰化鉀、對苯醌、N-甲基吩嗪鎓硫酸單甲酯鹽、亞甲藍、二茂鐵衍生物等。此外，以氧為電子傳遞體時，也可得到電流響應(yīng)。上述電子傳遞體可單獨使用，也可二種以上合用。
親水性高分子可以是各種物質(zhì)。例如可以是羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、甲基纖維素、乙基纖維素、乙基羥乙基纖維素、羧甲基纖維素、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚賴氨酸等聚氨基酸、聚苯乙烯磺酸、明膠及其衍生物、聚丙烯酸及其鹽、聚甲基丙烯酸及其鹽、淀粉及其衍生物、馬來酸酐或其鹽的聚合物。其中，優(yōu)選羧甲基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素。
下面通過實施例對本發(fā)明作更詳細的說明。
圖1是本實施例的葡萄糖傳感器的垂直剖面圖，圖2是除去了試劑層和表面活性劑層的同一葡萄糖傳感器的分解立體圖。
首先，用絲網(wǎng)印刷法將銀膏印刷在電絕緣性的聚對苯二甲酸乙二醇酯基板1上，形成導線2、3和后述的電極的基底。然后，將含有樹脂粘合劑的導電性碳糊印刷在基板1上，形成作用電極4。該作用電極4與導線2接觸。再在基板1上印刷絕緣性膏，形成絕緣層6。絕緣層6覆蓋作用電極4的外周部分，由此使作用電極4的露出部分的面積保持不變。接著，印刷含有樹脂粘合劑的導電性碳糊，使其與導線3接觸，形成反電極5。
將含有電子傳遞體鐵氰化鉀、不含酶的第1水溶液滴在基板1的作用電極4上后干燥，形成第1試劑層7。將含有酶GOD、不含電子傳遞體的第2水溶液滴在基板1的反電極5上后干燥，形成第2試劑層8。為了能順利地供給試樣，形成含有表面活性劑卵磷脂的層9，使其覆蓋第1試劑層7和第2試劑層8。
最后，按圖2中點劃線所示位置關(guān)系，將基板1、蓋板12和間隔件10連接，制作葡萄糖傳感器。
夾在基板1和蓋板12之間的間隔件10具有隙縫11，該隙縫11在基板1與蓋板12之間形成試液供給通路。
蓋板12的空氣孔14與該試液供給通路連通，因此，若使試樣與形成于隙縫11的開放端的試樣供給口13接觸，則由于毛細管現(xiàn)象，試樣可容易地到達在試液供給通路內(nèi)的第1試劑層7和第2試劑層8。
作為比較例，除了形成試劑層的步驟不同之外，按與本實施例相同的方法制作葡萄糖傳感器。圖7是比較例的葡萄糖傳感器的垂直剖面圖。試劑層31通過將含有GOD和鐵氰化鉀的水溶液滴在作用電極4和反電極5上后干燥而形成。再在試劑層31上形成含有表面活性劑卵磷脂的層9。
下面，以含有一定量葡萄糖的溶液為試樣，用實施例1和比較例的葡萄糖傳感器測定葡萄糖濃度。將試樣從試樣供給口13供給至試樣供給通路，經(jīng)過一定時間后，以反電極5為基準，在作用電極4上施加500mV電壓。在蓋板12與基板1之間插入間隔件10，增加傳感器抵抗物理壓力的強度。這樣，可容易地使試液供給通路的容積保持不變，減少物理壓力等對電流響應(yīng)的影響。
通過上述施加電壓，測定在作用電極4與反電極5之間流過的電流值，結(jié)果，在實施例1和比較例中，均觀察到與試樣中的葡萄糖濃度成比例的電流響應(yīng)。當試樣與第1試劑層7接觸時，氧化型的電子傳遞體鐵氰化鉀離解成鐵氰化物離子和鉀離子。試樣中的葡萄糖與從第1試劑層7溶解至試樣中的鐵氰化物離子和從第2試劑層8溶解至試樣中的GOD反應(yīng)。結(jié)果，葡萄糖被氧化成萄糖酸內(nèi)酯，氧化型的鐵氰化物離子被還原成還原型的亞鐵氰化物離子。在作用電極4上發(fā)生亞鐵氰化物離子被氧化成鐵氰化物離子的反應(yīng)，在反電極5上發(fā)生鐵氰化物離子被還原成亞鐵氰化物離子的反應(yīng)。由于亞鐵氰化物離子的濃度與葡萄糖濃度成一定比例，因此，根據(jù)亞鐵氰化物離子的氧化電流，可測定葡萄糖濃度。
與作用電極4上的試劑層31中含有酶GOD的比較例的葡萄糖傳感器相比，實施例1的葡萄糖傳感器的電流響應(yīng)增加。這是因為第1試劑層7中不含GOD，從而可防止GOD吸附在作用電極4上而導致電流向應(yīng)下降。
此外，與比較例相比，空白響應(yīng)下降，長期保存之前和之后的電流響應(yīng)的變動被抑制。這是因為GOD與鐵氰化鉀互相分離，從而可防止兩者接觸而互相作用，抑制空白響應(yīng)的增加和長期保存過程中的酶活性的變動。
將鈀濺鍍在電絕緣性基板21上，形成作用電極4和導線2。然后，將絕緣片23貼附在基板21上，將作用電極4和插入于測定器中的端子部固定。
另一方面，在具有向外膨出的曲面部分24的電絕緣性蓋件22的曲面部分24的內(nèi)壁面上濺鍍鈀，形成反電極5。曲面部分24的端部有空氣孔14。
第1試劑層7通過將含有電子傳遞體鐵氰化鉀、不含酶的第1水溶液滴在基板21的作用電極4上后干燥而形成。第2試劑層8通過將含有酶GOD、不含電子傳遞體的第2水溶液滴在蓋件22的反電極5上后干燥而形成。再在第1試劑層7上形成含有表面活性劑卵磷脂的層9。
最后，將基板21與蓋件22貼合，制作葡萄糖傳感器。這樣，作用電極4與反電極5以形成于基板21與蓋件的曲面部分24之間的空間部分為中介，配置在對向的位置上。該空間部分成為試樣的收容部分，若使試樣與空間部分的開放端側(cè)接觸，則由于毛細管現(xiàn)象，試樣容易地向空氣孔14側(cè)移動，與第1試劑層7和第2試劑層8接觸。
接著，按與實施例1相同的步驟測定葡萄糖濃度。其結(jié)果，觀察到與試樣中的葡萄糖濃度成比例的電流響應(yīng)。但對于反電極5，用夾鉗將曲面部分24的端部夾住等而實現(xiàn)電導通。
與實施例1相比，觀察到實施例2的葡萄糖傳感器的響應(yīng)值進一步增加。這是因為與實施例1同樣，第1試劑層7不含GOD，并將作用電極4和反電極5配置在對向的位置上，使得電極間的離子移動變得通順。
此外，由于GOD和鐵氰化鉀互相分離，因此，與實施例1同樣，與比較例相比，空白響應(yīng)下降，長期保存之前和之后的電流響應(yīng)的變動被抑制。
首先，用絲網(wǎng)印刷法將銀膏印刷在電絕緣性的聚對苯二甲酸乙二醇酯基板31上，形成導線2。然后，將含有樹脂粘合劑的導電性碳糊印刷在基板31上，形成作用電極4。該作用電極4與導線2接觸。再在基板31上印刷絕緣性膏，形成絕緣層6。絕緣層6覆蓋作用電極4的外周部分，由此使作用電極4的露出部分的面積保持不變。
接著，在電絕緣性蓋板32的背面印刷銀膏，形成導線3，然后，印刷導電性碳糊，形成反電極5，再印刷絕緣性膏，形成絕緣層6。在蓋板32上形成有空氣孔14。
將含有電子傳遞體鐵氰化鉀、不含酶的第1水溶液滴在基板31的作用電極4上后干燥，形成第1試劑層7。將含有酶GOD、不含電子傳遞體的第2水溶液滴在蓋板32的反電極5上后干燥，形成第2試劑層8。再在第1試劑層7上形成含有表面活性劑卵磷脂的層9。
最后，按圖6中點劃線所示位置關(guān)系，將基板31、蓋板32和間隔件10連接，制作葡萄糖傳感器。
夾在基板31和蓋板32之間的間隔件10具有隙縫11，該隙縫11在基板31與蓋板32之間形成試液供給通路。作用電極4和反電極5被對置在形成于間隔件10的隙縫11部分的試液供給通路內(nèi)。
蓋板32的空氣孔14與該試液供給通路連通，因此，若使試樣與形成于隙縫11的開放端的試樣供給口13接觸，則由于毛細管現(xiàn)象，試樣可容易地到達在試液供給通路內(nèi)的第1試劑層7和第2試劑層8。
接著，按與實施例1相同的步驟測定葡萄糖。其結(jié)果，觀察到與試樣中的葡萄糖濃度成比例的電流響應(yīng)。
由于實施例3的葡萄糖傳感器的第1試劑層7不含GOD且作用電極4和反電極5被配置在對向的位置上，因此，與實施例2同樣，與實施例1相比，電流響應(yīng)增加。
此外，由于GOD和鐵氰化鉀互相分離，因此，與實施例1同樣，與比較例相比，空白響應(yīng)下降，長期保存之前和之后的電流響應(yīng)的變動被抑制。
另外，由于在基板31與蓋板32之間夾入了間隔件10，增加了蓋板32抵抗物理壓力的強度，不會出現(xiàn)第1試劑層7與第2試劑層8由于物理壓力而接觸的情況，從而可避免GOD與鐵氰化鉀接觸而引起酶活性變動并導致電流響應(yīng)變動。此外，由于可容易地使試液供給通路的容積保持不變，因此，與實施例2相比，電流響應(yīng)的穩(wěn)定性提高。
第1試劑層7通過將含有電子傳遞體鐵氰化鉀和親水性高分子羧甲基纖維素、不含酶的第1水溶液滴在基板31的作用電極4上后干燥而形成。第2試劑層8通過將含有酶GOD和羧甲基纖維素、不含電子傳遞體的第2水溶液滴在蓋板32的反電極5上后干燥而形成。再在第1試劑層7上形成含有表面活性劑卵磷脂的層9。
接著，按與實施例1相同的步驟測定葡萄糖。其結(jié)果，觀察到與試樣中的葡萄糖濃度成比例的電流響應(yīng)。
由于本實施例的葡萄糖傳感器的第1試劑層7不含GOD且作用電極4和反電極5被配置在對向的位置上，因此，與實施例2同樣，與實施例1相比，電流響應(yīng)增加。
此外，由于GOD和鐵氰化鉀互相分離，因此，與實施例1同樣，與比較例相比，空白響應(yīng)下降，長期保存之前和之后的電流響應(yīng)的變動被抑制。
另外，由于在基板31與蓋板32之間夾入了間隔件10，因此，與實施例3同樣，不會出現(xiàn)GOD與鐵氰化鉀接觸、使得酶活性變動而導致電流響應(yīng)變動的情況。此外，由于可容易地使試液供給通路的容積保持不變，因此，與實施例3同樣，與實施例2相比，電流響應(yīng)的穩(wěn)定性提高。
此外，與實施例2和3相比，還出現(xiàn)電流響應(yīng)增加。這是因為羧甲基纖維素在第1試劑層7中的存在，使得蛋白質(zhì)等不會吸附在作用電極4的表面，作用電極4上的電極反應(yīng)得以順利進行。另外，由于測定時試樣粘性增加，降低了物理沖擊等對傳感器的影響，使傳感器響應(yīng)的變動減小。
在以上實施例中，以反電極5為基準，施加在作用電極4上的電壓為500mV，但本發(fā)明不限于此數(shù)值，只要是該電壓能使伴隨酶反應(yīng)而被還原的電子傳遞體氧化即可。
在上述實施例中，第1試劑層7含有一種電子傳遞體，但也可含有二種以上的電子傳遞體。
通過將第1試劑層7和第2試劑層8固定在作用電極4或反電極5上，可使酶或電子傳遞體不會被溶化。固定時，最好使用交聯(lián)固定法或吸附法。此外，也可將酶或電子傳遞體混合在電極材料中。
表面活性劑可以是卵磷脂以外的物質(zhì)。此外，在上述實施例中，僅在第1試劑層7上，或者在第1試劑層7和第2試劑層8上形成表面活性劑層9，但本發(fā)明不限于這些情形，也可在在間隔件10的隙縫11的側(cè)面等面對試樣供給通路的位置形成表面活性劑層9。
在上述實施例中，就僅作用電極和反電極的二電極系進行了描述，若改成添加了參比電極的三電極系，則可更正確地進行測定。
第1試劑層7和第2試劑層8最好互相不接觸、用空間部分將兩者隔開。這樣，可抑制空白響應(yīng)的增加并可更大幅度地提高保存穩(wěn)定性。
如上所述，根據(jù)本發(fā)明，可得到電流響應(yīng)感度高且空白響應(yīng)低、保存穩(wěn)定性好的生物傳感器。
權(quán)利要求
1．生物傳感器，具有包含與被供給的試液接觸、構(gòu)成電化學測定系的作用電極和反電極的電極系、支承上述電極系的絕緣性支承體、形成于上述作用電極上的第1試劑層、和形成于上述反電極上的第2試劑層，所述第1試劑層不含酶，至少含有電子傳遞體，且所述第2試劑層不含電子傳遞體，至少含有酶。
2．如權(quán)利要求1所述的生物傳感器，其中，所述支承體由一個電絕緣性基板構(gòu)成，在該基板上形成有所述作用電極和反電極。
3．如權(quán)利要求1所述的生物傳感器，其中，所述支承體由電絕緣性基板及在與該基板之間形成試液供給通路的電絕緣性蓋件構(gòu)成，所述作用電極形成于所述基板上，所述反電極與所述作用電極對向地形成于所述蓋件內(nèi)表面上。
4．如權(quán)利要求3所述的生物傳感器，其中，所述蓋件由用于在所述基板之間形成試液供給通路或試液收容部的、具有向外膨出的曲面部分的片材構(gòu)成。
5．如權(quán)利要求3所述的生物傳感器，其中，所述蓋件由具有形成所述試液供給通路的隔板和覆蓋所述隔板的蓋板構(gòu)成。
6．如權(quán)利要求1所述的生物傳感器，其中，第1試劑層含有親水性高分子。
全文摘要
本發(fā)明提供一種電流響應(yīng)特性保持至高濃度區(qū)域且空白響應(yīng)低、保存穩(wěn)定性好的生物傳感器。該生物傳感器具有包含與被供給的試液接觸、構(gòu)成電化學測定系的作用電極和反電極的電極系、支承上述電極系的絕緣性支承體、形成于上述作用電極上的第1試劑層、和形成于上述反電極上的第2試劑層,其中,所述第1試劑層的主要成分是酶,第2試劑層的主要成分是電子傳遞體。
文檔編號C12Q1/26GK1301963SQ00137769
公開日2001年7月4日 申請日期2000年12月27日 優(yōu)先權(quán)日1999年12月27日
發(fā)明者谷池優(yōu)子, 池田信, 南海史朗 申請人:松下電器產(chǎn)業(yè)株式會社