專利名稱：鏈霉素抗生素分子印跡生物傳感器的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于化學(xué)分析領(lǐng)域，涉及生物傳感器，尤其是一種鏈霉素抗生素分子印跡生物傳感器的制備方法。
背景技術(shù)：
鏈霉素(Streptomycin, STR)是一種氨基糖苷類抗生素,對(duì)于革蘭氏陰性菌和部分革蘭氏陽(yáng)性菌，尤其是結(jié)核桿菌，具有顯著的抗菌活性，在畜牧業(yè)和水產(chǎn)業(yè)中作為飼料添加劑和治療動(dòng)物疾病廣泛應(yīng)用。但是，鏈霉素對(duì)聽神經(jīng)有明顯的毒性作用，能造成耳聾，對(duì)過敏胎兒更為嚴(yán)重，具有腎毒性，濫用、不遵守休藥期、超量用藥等造成的鏈霉素殘留，會(huì)直接威脅人、畜的健康。STR殘留物可存在于肉類、肝、腎、牛奶以及蜂蜜中。各國(guó)對(duì)STR殘留限量都做出了明確規(guī)定，我國(guó)農(nóng)業(yè)部2002年發(fā)布的第235號(hào)文件《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》規(guī)定鏈霉素在牛奶中殘留限量為200μ g/L，在肌肉、脂肪、肝中為600μ g/kg，在腎中為 1000 μ g/kg O目前，國(guó)內(nèi)外測(cè)定鏈霉素的主要方法有分光光度法、微生物法、免疫學(xué)檢測(cè)法、液相色-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)和熒光衍生測(cè)定法等。雖然，一些理化檢測(cè)方法比較靈敏、精確，但由于鏈霉素缺少較強(qiáng)的紫外吸收生色基團(tuán)，檢測(cè)前往往需要通過一系列的衍生方法進(jìn)行處理，操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)；高效液相色譜儀、質(zhì)譜儀等大型設(shè)備的使用，對(duì)發(fā)明人員要求較高，檢測(cè)成本高。因此，建立一種快速、簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法對(duì)于鏈霉素殘留檢測(cè)是非常重要的。分子印跡技術(shù)(molecularimprintingtechnique,MIT)亦稱分子模板技術(shù),是指以某一特定的目標(biāo)分子為模板，制備對(duì)該分子具有特異選擇性聚合物的過程。分子印跡技術(shù)自上世紀(jì)90代有了迅猛發(fā)展 ，分子印跡聚合物(MIPs)常作為傳感器的識(shí)別元件或改性材料應(yīng)用環(huán)境檢測(cè)、抗生素檢測(cè)等領(lǐng)域。電化學(xué)聚合電活性功能單體制備的分子印跡聚合物，既具有類似金屬的特性，也保留了有機(jī)聚合物的性能，且與滴涂和旋涂等化學(xué)方法在導(dǎo)電基質(zhì)表面聚合的MIP薄膜相比具有其優(yōu)越性，如制備簡(jiǎn)單、膜厚可控、高重現(xiàn)性，以及在水溶液中聚合和操作的可行性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)靈敏度高、重現(xiàn)性好、選擇性高的鏈霉素抗生素分子印跡生物傳感器的制備方法。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:—種鏈霉素抗生素分子印跡生物傳感器的制備方法，制備傳感器的步驟如下:⑴玻碳電極預(yù)處理:將玻碳電極拋光、清洗，然后將電極置于0.5mol/LH2S04溶液中，在一 1.0 + 0.8 V電位區(qū)間內(nèi)，以0.1V/S的掃速進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，直至得到穩(wěn)定的循環(huán)伏安響應(yīng)，得到具有活性的電極；⑵分子自組裝膜修飾電極
將上述處理好的電極浸入聚合底液，通純N2IOmin后，在O 0.8V的電位區(qū)間內(nèi)循環(huán)伏安掃描20圈，掃描速度為0.05V/s ；所述聚合物底液為含有功能單體鄰苯二胺、模板分子硫酸鏈霉素的PBS溶液，pH=5.0 ；所述聚合底液中功能單體:模板分子的摩爾濃度比為4:1;⑶洗脫模板分子采用上述步驟⑵修飾電極，再經(jīng)70被％乙醇溶液洗脫后，得到鏈霉素抗生素分子印跡生物傳感器。而且，所述玻碳電極拋光、清洗的方法為:將玻碳電極在涂有0.05 μ HiAl2O3漿液的麂皮上“8”字型拋光至鏡面，水沖洗后，依次用1:1HNO3、無水乙醇和蒸餾水中超聲清洗3min,以洗去電極表面殘存的化學(xué)物質(zhì)以及惰化層。而且，所述步驟⑶洗脫15分鐘。而且，所述步驟⑵聚合底液中含有0.2mol/L的磷酸鹽緩沖液。而且，所述步驟⑵聚合物底液采用0.lmol/L的KCl溶液作為支持電解質(zhì)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果為:1、本發(fā)明基于分子印跡技術(shù)，通過電化學(xué)聚合方法，利用循環(huán)伏安法以硫酸鏈霉素為模板分子、鄰苯二胺為功能單體制備出分子印跡電極，建立了快速、靈敏的鏈霉素檢測(cè)方法，為小型化和自動(dòng)化、低檢測(cè)限的電化學(xué)傳感器的發(fā)明提供依據(jù)。2、本發(fā) 明使用的鄰苯二胺能形成致密的剛性絕緣聚合膜，非常適合用于分子印跡，能提供親水性、疏水性及其他的識(shí)別位點(diǎn)，但緩沖液中聚鄰苯二胺膜對(duì)帶正電荷的物質(zhì)具有選擇透過性，采用正電荷探針如[Ru (NH3)6]3+會(huì)干擾發(fā)明，故本發(fā)明中選取[Fe(CN)6]'鐵氰化鉀具有良好的電化學(xué)穩(wěn)定性，可保證分析結(jié)果的可靠性。由圖2可知，K3[Fe (CN)6]在洗脫處理后的非印跡膜表面幾乎無響應(yīng)(曲線d)，而洗脫處理后的印跡膜峰電流(曲線b)較大，但與裸電極表面峰電流(曲線a)相比較小。3、本發(fā)明制備的傳感器經(jīng)二次洗脫20min，重現(xiàn)的響應(yīng)值可與原響應(yīng)值基本一致，以此傳感器對(duì)1.0 μ mol/L硫酸鏈霉素溶液平行測(cè)試4次，響應(yīng)值的RSD為1.33%，顯示了良好的重現(xiàn)性。此傳感器在連續(xù)使用7次，最終響應(yīng)值降到初始值的79.2%。


圖1-1和圖1-2為本發(fā)明循環(huán)伏安電聚合曲線:其中，圖1-1為鄰苯二胺單體聚合；圖1-2為鄰苯二胺和鏈霉素聚合；圖2為本發(fā)明不同電極在K3[Fe (CN)6]溶液中的方波伏安圖:(a)裸玻碳電極；(b)MIP/GCE ; (c) MIP 重鍵合 STR 后的電極；(d) NIP/GCE ；圖3為本發(fā)明不同配比模板-單體配比對(duì)印跡膜性能的影響；圖4為本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施例方式下面通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳述，以下實(shí)施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
實(shí)施例1一種鏈霉素抗生素分子印跡生物傳感器的制備方法，步驟如下:⑴玻碳電極預(yù)處理 將玻碳電極在涂有0.05 μ HiAl2O3漿液的麂皮上“ 8 ”字型拋光至鏡面，水沖洗后，依次用1:1HNO3、無水乙醇和蒸餾水中超聲清洗3min，以洗去電極表面殘存的化學(xué)物質(zhì)以及惰化層。最后將電極置于0.5mol/L H2SO4溶液中，在一1.0 +0.8 V電位區(qū)間內(nèi)，以0.1V/s的掃速進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，直至得到穩(wěn)定的循環(huán)伏安響應(yīng)，得到具有活性的電極；⑵分子自組裝膜修飾 電極將上述處理好的電極浸入含有20mmol/L鄰苯二胺(功能單體)、5mmol/L硫酸鏈霉素(模板分子)和0.2mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS，pH=5.0)的聚合底液(其中0.lmol/L的KCl溶液作為支持電解質(zhì))，通純N2IOmin后，在O 0.8V的電位區(qū)間內(nèi)循環(huán)伏安掃描20圈，掃描速度為0.05V/s ；⑶洗脫模板分子采用上述步驟⑵修飾的電極，再經(jīng)70wt%乙醇溶液洗脫后，洗脫15分鐘，得到鏈霉素抗生素分子印跡生物傳感器；取出后再用雙蒸水淋洗5min，以洗脫出模板分子，并在含有4mmol/L K3 [Fe (CN)6]的PBS緩沖液中經(jīng)循環(huán)伏安曲線比較洗脫效果。實(shí)施例2非印跡聚合膜(NIP)的制備，以實(shí)施例1同樣的方法進(jìn)行，但步驟⑵中不加入模板分子。實(shí)施例3與實(shí)施例1的區(qū)別在于:步驟⑶印跡膜的洗脫采用lmol/L NaOH溶液洗脫15分鐘，在含有4mmol/L K3 [Fe (CN)6]的PBS緩沖液中經(jīng)循環(huán)伏安曲線比較洗脫效果。實(shí)施例4與實(shí)施例1的區(qū)別在于:步驟⑶印跡膜的洗脫采用lmol/L H2SO4溶液洗脫15分鐘，在含有4mmol/L K3 [Fe (CN)6]的PBS緩沖液中經(jīng)循環(huán)伏安曲線比較洗脫效果。以下內(nèi)容對(duì)上述實(shí)施例制備的鏈霉素抗生素分子印跡生物傳感器的制備方法的性能檢測(cè)及比較。1、電化學(xué)檢測(cè)及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制本發(fā)明中均以K3 [Fe (CN)6]為探針，利用方波伏安法間接表征GC裸電極、MIP電極、MIP重鍵合后的電極和NIP電極的電流。通過測(cè)定吸附前后鐵氰化鉀方波峰的變化(Λ I)，計(jì)算出K3[Fe(CN)6]相對(duì)峰電流與硫酸鏈霉素溶液濃度之間的關(guān)系，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)而可間接測(cè)得硫酸鏈霉素的含量。2、印跡膜的選擇性將制得的印跡電極分別置于相同濃度的以慶大霉素和紅霉素為干擾物的緩沖液中吸附后，方波伏安法檢測(cè)。3、印跡膜的重現(xiàn)性使用同一支電極平行測(cè)定同一濃度硫酸鏈霉素溶液。印跡電極每次使用完后浸入
0.1moI/LPBS緩沖液中室溫下保存。檢測(cè)結(jié)果如下:
1、分子印跡的電聚合圖l-2(b)為鏈霉素在與鄰苯二胺經(jīng)電化學(xué)作用在玻碳電極表面沉積的電化學(xué)行為。隨著掃描的進(jìn)行，峰電流發(fā)生正移并且電流值迅速衰減，但是當(dāng)掃描20圈，法拉第電流基本穩(wěn)定，說明電極表面形成了低導(dǎo)電性致密的印跡聚合膜。對(duì)比圖1-1 (a)與圖l-2(b)，MIP膜與NIP膜的CV曲線峰形、峰位置及變化的趨勢(shì)相似，沒有額外的峰出現(xiàn)，說明鏈霉素在O 0.8V的電位區(qū)間內(nèi)沒有參與電化學(xué)氧化反應(yīng)，保證其在聚合膜中保持正確的三維結(jié)構(gòu)、形成特異性識(shí)別位點(diǎn)。2、印跡膜性能的分析鄰苯二胺能形成致密的剛性絕緣聚合膜，非常適合用于分子印跡，能提供親水性、疏水性及其他的識(shí)別位點(diǎn)，但緩沖液中聚鄰苯二胺膜對(duì)帶正電荷的物質(zhì)具有選擇透過性，采用正電荷探針如[Ru(NH3)6]3+會(huì)干擾發(fā)明，故本發(fā)明中選取[Fe(CN)6]'鐵氰化鉀具有良好的電化學(xué)穩(wěn)定性，可保證分析結(jié)果的可靠性。由圖2可知，K3[Fe (CN)6]在洗脫處理后的非印跡膜表面幾乎無響應(yīng)(曲線d)，而洗脫處理后的印跡膜峰電流(曲線b)較大，但與裸電極表面峰電流(曲線a)相比較小。結(jié)果說明，脫除模板分子STR后的印跡膜表面留有的空穴為K3[Fe(CN)6]擴(kuò)散 提供通道，當(dāng)MIP電極重新浸入含有硫酸鏈霉素溶液中吸附一段時(shí)間后，硫酸鏈霉素在氫鍵、靜電作用等作用下重新占據(jù)印跡空腔，導(dǎo)致方波峰電流值降低(曲線C)。本發(fā)明中，嘗試了不同的模板分子和功能單體的配比下電聚合制備印跡膜，并利用Spartan’ 08 (vl.2.0)模擬模板-單體的預(yù)聚合,考察結(jié)合能(Δ Ef)的值,得到n (STR):n(OPD)=1:4的條件下獲得的印跡膜具有最負(fù)的能量值，可形成相對(duì)穩(wěn)定的聚合物。這也在發(fā)明中得到證實(shí)，由圖3可知，此條件下的制備的印跡膜相同條件洗脫前后可獲得最大的峰電流變化值(Ai)，增大了電流可變化限度，提高了發(fā)明的精確度。其他條件下可能出現(xiàn)功能單體量過少，難以將模板分子束縛印跡膜中，導(dǎo)致留有的空腔不足；功能單體量過大，洗脫時(shí)鏈霉素從交聯(lián)結(jié)構(gòu)中脫除受阻，印跡位點(diǎn)重鍵合時(shí)不易接近。3、洗脫劑和洗脫時(shí)間的影響從高交聯(lián)度的聚合膜中去除模板分子的步驟對(duì)印跡位點(diǎn)的形成是非常重要的。鏈霉素易溶于水，不溶于大多數(shù)有機(jī)溶劑，分子結(jié)構(gòu)中含有多羥基，通過氫鍵與鄰苯二胺相互作用形成分子印跡聚合物，通過溫和的溶劑即可去除模板分子。發(fā)明中選取了 Imol/LNaOH溶液、ImoVLH2SO4溶液和75%的乙醇溶液作為洗脫劑，探討不同洗脫方法對(duì)MIP膜制備的影響，選擇出高效、快捷的洗脫方法。發(fā)明表明，洗脫時(shí)間相同，采用75%乙醇溶液進(jìn)行一次洗脫，方波峰電流較大，對(duì)NIP膜的影響較小，洗脫15min后峰電流趨于穩(wěn)定。4、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制脫去模板分子的印跡電極放入含有一定濃度的硫酸鏈霉素溶液中吸附25min，取出后用雙蒸水淋洗干凈，置于K3 [Fe (CN)6]溶液中檢測(cè)電流。(圖4)。5、印跡膜的選擇性慶大霉素和硫酸鏈霉素同為氨基糖苷類抗生素，結(jié)構(gòu)類似，而紅霉素雖為大環(huán)內(nèi)酯類，但其結(jié)構(gòu)中多羥基，可與鄰苯二胺單體形成氫鍵，故選取二者做干擾發(fā)明。5倍濃度的慶大霉素濃度和17倍濃度的紅霉素濃度基本無影響。可見，硫酸鏈霉素傳感器的選擇性較好。
6、印跡膜的重現(xiàn)性使用過的傳感器經(jīng)二次洗脫20min，重現(xiàn)的響應(yīng)值可與原響應(yīng)值基本一致，以此傳感器對(duì)1.0 μ mol/L硫酸鏈霉素溶液平行測(cè)試4次，響應(yīng)值的RSD為1.33%，顯示了良好的重現(xiàn)性。此傳感器在連續(xù)使用7次，最`終響應(yīng)值降到初始值的79.2%。
權(quán)利要求
1.一種鏈霉素抗生素分子印跡生物傳感器的制備方法，其特征在于:制備傳感器的步驟如下: ⑴玻碳電極預(yù)處理:將玻碳電極拋光、清洗，然后將電極置于0.511101/1^2504溶液中，在一 1.0 + 0.8 V電位區(qū)間內(nèi)，以0.lV/s的掃速進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，直至得到穩(wěn)定的循環(huán)伏安響應(yīng)，得到具有活性的電極； ⑵分子自組裝膜修飾電極 將上述處理好的電極浸入聚合底液，通純N2IOmin后,在O 0.8V的電位區(qū)間內(nèi)循環(huán)伏安掃描20圈，掃描速度為0.05V/s ； 所述聚合物底液為含有功能單體鄰苯二胺、模板分子硫酸鏈霉素的PBS溶液，pH=5.0 ； 所述聚合底液中功能單體:模板分子的摩爾濃度比為4:1 ； ⑶洗脫模板分子 采用上述步驟⑵修飾電極，再經(jīng)70wt%乙醇溶液洗脫后，得到鏈霉素抗生素分子印跡生物傳感器。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鏈霉素抗生素分子印跡生物傳感器的制備方法，其特征在于:所述玻碳電極拋光、清洗的方法為:將玻碳電極在涂有0.05 μ HiAl2O3漿液的麂皮上“8”字型拋光至鏡面，水沖洗后，依次用1:1HNO3、無水乙醇和蒸餾水中超聲清洗3-10min。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鏈霉素抗生素分子印跡生物傳感器的制備方法，其特征在于:所述步驟⑶洗脫15分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鏈霉素抗生素分子印跡生物傳感器的制備方法，其特征在于:所述步驟⑵聚合底液中含有0`.2mol/L的磷酸鹽緩沖液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鏈霉素抗生素分子印跡生物傳感器的制備方法，其特征在于:所述步驟⑵聚合物底液采用0.lmol/L的KCl溶液作為支持電解質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種鏈霉素抗生素分子印跡生物傳感器的制備方法，制備傳感器的步驟如下⑴玻碳電極預(yù)處理；⑵分子自組裝膜修飾電極將處理好的電極浸入聚合底液，通純N210min后，在0～0.8V的電位區(qū)間內(nèi)循環(huán)伏安掃描20圈，掃描速度為0.05V/s；⑶洗脫模板分子采用上述步驟⑵修飾電極，再經(jīng)70wt%乙醇溶液洗脫后，得到鏈霉素抗生素分子印跡生物傳感器。本發(fā)明基于分子印跡技術(shù)，通過電化學(xué)聚合方法，利用循環(huán)伏安法以硫酸鏈霉素為模板分子、鄰苯二胺為功能單體制備出分子印跡電極，建立了快速、靈敏的鏈霉素檢測(cè)方法，為小型化和自動(dòng)化、低檢測(cè)限的電化學(xué)傳感器的發(fā)明提供依據(jù)。
文檔編號(hào)G01N27/327GK103243367SQ201310184510
公開日2013年8月14日 申請(qǐng)日期2013年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月17日
發(fā)明者張娟琨, 陳怡 , 劉利娟 申請(qǐng)人:天津前方科技有限公司