專利名稱：綠膿毒素基因及其包裝與導向蛋白復合物對癌的靶向基因治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及突變改型的編碼綠膿桿菌毒素第III結(jié)構(gòu)域的重組DNA，包含所述重組DNA的表達型重組體，以及由所述的表達型重組體與一種融合蛋白的復合物制備的針對惡性腫瘤特別是細胞表面表皮生長因子(EGF)富集的惡性腫瘤的靶向基因治療藥物。所述的融合蛋白由人組蛋白H1一部分和人表皮生長因子一部分組成，其也是本發(fā)明的一個方面。
綠膿桿菌毒素(PE)是由綠膿桿菌分泌的一種毒素，具有三個結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)域Ia(AA1-252)為細胞結(jié)合結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)域II(AA253-364)為轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)域III(AA405-613)為ADP糖基化區(qū)域，結(jié)構(gòu)域II和結(jié)構(gòu)域III又合稱為PE40，而結(jié)構(gòu)域Ib(AA365-404)無明顯的生物學功能。PE是一種極毒的毒素，僅僅對小鼠一次靜脈注射0.3微克即可使之在24小時內(nèi)死亡。對于一個細胞來說，幾個分子的毒素的導入即可使這個細胞死亡。由于PE這種獨特的性能，使得其作為一種很有前途的毒素被應(yīng)用到腫瘤基因治療中去。
惡性腫瘤的傳統(tǒng)治療方法，如手術(shù)、放射治療、化學治療以及對于某些類型腫瘤的內(nèi)分泌治療，很多情況下療效不好，從而基因治療手段逐漸成為惡性腫瘤治療方法中最有前景的一種。靶向性基因治療，又稱“生物導彈”技術(shù)，正越來越引起人們的關(guān)注。第一代生物導彈的設(shè)計思路是將單克隆抗體與藥物、核素或毒素蛋白融合在一起用于臨床治療，其主要問題是靶向性差；第二代生物導彈的設(shè)計思路是將不同功能的基因區(qū)段拼接所構(gòu)建的融合蛋白作為“分子導向”型導彈。如人工構(gòu)建IL2-PE40融合蛋白用于治療某些自身免疫性疾病。其主要問題是人工構(gòu)建的融合蛋白由于其中的PE40對人體而言是異源蛋白，在人體應(yīng)用時會有較強的免疫原性，無法實際在臨床上推廣；第三代生物導彈主要設(shè)計思路是利用治療基因(或基因片段)與多聚陽離子分子形成DNA-蛋白質(zhì)復合體，利用此復合體中蛋白質(zhì)上的特異性配體作為分子識別蛋白，將整個復合體特異性導向到靶細胞實現(xiàn)其靶向性設(shè)計。
關(guān)于特異性配體的選擇，病理統(tǒng)計結(jié)果表明，在癌癥患者中有40-50％的不同種類的腫瘤，即鱗狀上皮癌的癌細胞表面表皮生長因子(EGF)受體過度表達，這一現(xiàn)象甚至成為所患癌癥危害程度的指標之一。體內(nèi)癌組織出現(xiàn)此現(xiàn)象的患者，經(jīng)傳統(tǒng)療法治療之后往往預(yù)后不良。也許正是與此有關(guān)，這一類型的癌癥成為基因治療的首選目標之一。富集于癌細胞表面的EGF受體雖然標志著更高的惡性程度，但在基因治療的研究當中，卻為癌細胞的選擇性殺傷提供了足以利用的標靶。但是使用完整EGF分子作為配體會造成刺激DNA合成與細胞增殖的分子效應(yīng)出現(xiàn)，從而促進惡性腫瘤在體內(nèi)增殖。因此改造配體也成為制備這一類型基因治療藥物的關(guān)鍵，這也是本發(fā)明中所涉及的一個方面。
另外，經(jīng)常用于結(jié)合DNA的多聚陽離子為多聚賴氨酸(polylysine)，但大部分的多聚賴氨酸都是人工合成的，在基因治療臨床應(yīng)用中成本極高(在美國，固相合成的28aa，1克約為40～50萬美元，在中國，約為150～160萬人民幣)，以致于即使臨床試驗成功，也幾乎無法在臨床推廣應(yīng)用。為了降低成本，并盡可能減少外源物質(zhì)引起免疫原性的可能，需要有更廉價易得且無免疫原性的結(jié)合DNA的多聚陽離子物質(zhì)。這一點也是本發(fā)明所考慮解決的問題之一。
因此，本發(fā)明的一個目的在于提供一種突變改型的編碼綠膿桿菌毒素第III結(jié)構(gòu)域的重組DNA及包含所述DNA的表達型重組體，該重組DNA編碼的突變綠膿桿菌毒素毒性更強。
本發(fā)明的另一個目的在于提供一種惡性腫瘤靶向基因治療藥物，其包含所述的表達型重組體與一種融合蛋白的復合物。所述的融合蛋白由人組蛋白H1一部分和人表皮生長因子一部分組成。
本發(fā)明的再一目的在于提供一種融合基因，該融合基因編碼用于生產(chǎn)本發(fā)明的靶向基因治療藥物中的融合蛋白，所述融合蛋白包括人組蛋白H1的106個氨基酸和人表皮生長因子C環(huán)的22個氨基酸，或者所述融合蛋白包括人組蛋白H1的221個氨基酸和人表皮生長因子C環(huán)的22個氨基酸。此類融合蛋白是用基因工程技術(shù)方法生產(chǎn)的，同固相合成比較，其造價約可降低2～3個數(shù)量級，以便于臨床實驗及可能的臨床應(yīng)用。
根據(jù)本發(fā)明的第一個方面，提供了突變改型的編碼綠膿桿菌毒素第III結(jié)構(gòu)域的重組DNA以及包含所述重組DNA的表達型重組體。所述的重組DNA序列如SEQ ID NO1所示，其是通過將綠膿桿菌毒素第III結(jié)構(gòu)域C端的5個氨基酸殘基REDLK的密碼子突變?yōu)镵DEL的密碼子并引入終止密碼子TAA而得到，以下稱該重組DNA為PEIIImut。PEIIImut所編碼的蛋白產(chǎn)物的氨基酸序列如SEQID NO2所示。PEIIImut可根據(jù)本領(lǐng)域公知的技術(shù)引入各種表達載體以用于構(gòu)建表達型重組體，從而表達所述的毒素蛋白。這種表達型重組體的一個例子是pcDNA(3.1)-PEIIImut，以pcDNA(3.1)-PEIIImut轉(zhuǎn)化的大腸桿菌DH5α/pcDNA(3.1)-PEIIImut于2000年7月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC NO.0478。
根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供了惡性腫瘤的靶向基因治療藥物，其包含本發(fā)明第一方面所述的包含PEIIImut的表達型重組體與一種融合蛋白的復合物。所述融合蛋白包括人組蛋白H1(第115位-第221位)的106個氨基酸和人表皮生長因子C環(huán)的最后22個氨基酸，或者所述融合蛋白包括人組蛋白H1(第1位-第221位)的221個氨基酸和人表皮生長因子(EGF)C環(huán)的最后22個氨基酸。在本發(fā)明的這種靶向基因治療藥物的應(yīng)用中，PEIIImut的表達型重組體與融合蛋白中的DNA結(jié)合組分人組蛋白H1緊密結(jié)合，融合蛋白中的定向組分人表皮生長因子C環(huán)通過與惡性腫瘤細胞表面的EGF受體結(jié)合而將復合物導入惡性腫瘤細胞，在腫瘤細胞中PEIIImut表達型重組體表達毒素蛋白，從而將腫瘤細胞殺死。
根據(jù)本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提供了一種融合基因，該融合基因編碼用于本發(fā)明的靶向基因治療藥物中的融合蛋白，所述融合蛋白從5′到3′依次包括人組蛋白H1的106個氨基酸(含45個賴氨酸和3個精氨酸，即48個帶正電氨基酸)和人表皮生長因子C環(huán)的22個氨基酸，或者所述融合蛋白從5′到3′依次包括人組蛋白H1的221個氨基酸(含65個賴氨酸和3個精氨酸，即68個帶正電氨基酸)和人表皮生長因子C環(huán)的22個氨基酸。其中包括人組蛋白H1的106個氨基酸和人表皮生長因子C環(huán)的22個氨基酸的融合蛋白命名為H1.3-EGFc，其氨基酸序列如SEQ ID NO4所示，其編碼序列如SEQ ID NO3所示。包括人組蛋白H1的221個氨基酸和人表皮生長因子C環(huán)的22個氨基酸的融合蛋白命名為H1-EGFc，其氨基酸序列如SEQ ID NO6所示，其編碼序列如SEQ ID NO5所示。用含有兩個拷貝的H1.3-EGFc編碼序列的質(zhì)粒MFLII轉(zhuǎn)化巴氏畢赤酵母KM71獲得的轉(zhuǎn)化子巴氏畢赤酵母/KM71/MFLII于2000年7月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC NO.0476。而用含有H1-EGFc編碼序列的質(zhì)粒pLY1-H1-EGFc轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α獲得的轉(zhuǎn)化子大腸桿菌DH5α/pLY1-H1-EGFc于2000年7月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC NO.0477。
具體地，由于本發(fā)明的設(shè)計是將毒素基因?qū)肽[瘤細胞中表達，因此就不需要毒素的跨膜轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域。正是基于這種原因，本發(fā)明第一方面涉及的毒素基因中僅含有綠膿桿菌毒素的具有ADP糖基化酶活性的第III結(jié)構(gòu)域的編碼序列。該編碼序列在靶細胞中表達出的蛋白可作為殺死靶細胞的毒素。另外，本發(fā)明人用白喉毒素C端的4個氨基酸殘基KDEL替換了PE毒素C端的5個氨基酸殘基REDLK，由此大大增強了毒素的殺細胞能力。另外，由于毒素蛋白是在細胞內(nèi)進行表達，這就徹底避免了毒素蛋白的免疫原性問題。即使在靶細胞崩解后，其中的毒素蛋白也許可能被機體免疫識別系統(tǒng)捕獲，從而產(chǎn)生抗體，但這些抗體既無法清除細胞內(nèi)的毒素蛋白，也不會和作為毒素蛋白表達載體的質(zhì)粒DNA發(fā)生反應(yīng)。
關(guān)于本發(fā)明的基因治療藥物中的特異性配體EGF，現(xiàn)有技術(shù)已知使用完整EGF分子作為配體勢必會造成刺激DNA合成與細胞增殖的分子效應(yīng)出現(xiàn)，從而促進惡性腫瘤在體內(nèi)增殖。而本發(fā)明中利用了表皮生長因子53個氨基酸中，最后的22個氨基酸不但不具有刺激DNA合成、細胞增殖的能力，反而具有抑制DNA合成的能力。與此同時，這22個氨基酸仍具備與EGF受體結(jié)合的能力，可以作為靶向蛋白與惡性腫瘤細胞表面富集的EGF受體結(jié)合。也即本發(fā)明的融合蛋白中使用的EGF分子片段具有安全和有效的特點。
本發(fā)明的融合蛋白中利用人體內(nèi)正常存在的組蛋白H1作為DNA的結(jié)合分子。組蛋白H1含有足夠數(shù)量的堿性氨基酸，特別是大量的賴氨酸，在一定pH條件下帶有正電荷，能通過靜電作用與帶負電荷的DNA結(jié)合。其自然形態(tài)本身就在真核生物基因組DNA的折疊、濃聚方面有重要的作用，這樣設(shè)計可以在保證DNA分子充分濃聚的基礎(chǔ)上保證了低免疫原性。
以下將參照附圖和實施例詳細描述本發(fā)明。


圖1為本發(fā)明的總體設(shè)計圖。
圖2為pcDNA(3.1)-PEIIImut的圖譜。
圖3示出含有融合基因H1-EGFc的重組質(zhì)粒PET30a-H1-EGFc的構(gòu)建過程。
圖4示出含有融合基因H1-EGFc的重組表達質(zhì)粒pLY1-H1-EGFc的構(gòu)建過程。
圖5示出含有融合基因H1.3-EGFc的重組表達質(zhì)粒MFLII的構(gòu)建過程。
圖6示出用H1-EGFc/pcDNA(3.1)-PEIIImut復合物處理JK細胞(一種不含EGF受體的白血病細胞)的實驗結(jié)果的統(tǒng)計圖，其中組1為空白對照，組2為靶向蛋白H1-EGFc處理組，組3為質(zhì)粒pcDNA(3.1)-PEIIImut處理組，組4為H1-EGFc+pcDNA(3.1)-PEIIImut(1微克)處理組，組5為H1-EGFc+pcDNA(3.1)-PEIIImut(2微克)處理組，組6為H1-EGFc+pcDNA(3.1)-PEIIImut(3微克)處理組。
圖7示出用H1-EGFc/pcDNA(3.1)-PEIIImut復合物處理BT-325細胞(一種表面富集EGF受體的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞)的實驗結(jié)果的統(tǒng)計圖，其中組別同圖6。
圖8示出用H1-EGFc/pcDNA(3.1)-PEIIImut復合物處理Hela細胞(一種表面富集EGF受體的宮頸癌細胞)的實驗結(jié)果的統(tǒng)計圖，其中組別同圖6。
圖9示出在EGF存在下用H1-EGFc/pcDNA(3.1)-PEIIImut復合物處理Hela細胞的實驗結(jié)果的統(tǒng)計圖，其中組1為空白對照，組2為H1-EGFc+pcDNA(3.1)-PEIIImut(3微克)處理組，組3為H1-EGFc+pcDNA(3.1)-PEIIImut(3微克)加EGF(3微克)處理組。
圖10示出用H1.3-EGFc/pcDNA(3.1)-PEIIImut復合物處理Hela細胞的實驗結(jié)果的統(tǒng)計圖，其中組1為空白對照，組2為質(zhì)粒pcDNA(3.1)-PEIIImut處理組，組3為靶向蛋白H1.3-EGFc處理組，組4為H1.3-EGFc+pcDNA(3.1)-PEIIImut(1微克)處理組，組5為H1.3-EGFc+pcDNA(3.1)-PEIIImut(2微克)處理組，組6為H1.3-EGFc+pcDNA(3.1)-PEIIImut(3微克)處理組。
圖11示出用H1.3-EGFc/pcDNA(3.1)-PEIIImut復合物處理JK細胞的實驗結(jié)果的統(tǒng)計圖，其中組別同
圖10。
圖12示出用H1-EGFc/pcDNA(3.1)-PEIIImut復合物處理BT-325細胞的實驗結(jié)果的統(tǒng)計圖，其中組別
圖10。
實施例1 PEIIImut的克隆及包含其的表達型重組體的構(gòu)建1、PEIIImut的擴增和克隆以含有綠膿桿菌毒素PE40的質(zhì)粒pZM3(本發(fā)明人構(gòu)建)為模板，用序列如下的引物經(jīng)PCR擴增出綠膿桿菌毒素第III結(jié)構(gòu)域的編碼序列。所用的引物序列中引入了EcoRV和EcoRI的識別序列并且引入了意在使PEIII編碼序列3′端如上所述的5個氨基酸的密碼子突變?yōu)?個氨基酸的密碼子的序列，引物序列為上游引物(33bp)5′-tcgatatcac catgctcggc gacggcggcg acg-3′EcoRV Kozak序列下游引物(40bp)5′-ggaattctta cagttcgtcc ttcggcggtt tgccgggctg-3′EcoRIPCR反應(yīng)條件為94℃變性5分鐘后開始循環(huán)94℃變性40秒，56℃退火40秒，70℃延伸40秒。經(jīng)35個循環(huán)后，70℃延伸10分鐘。以瓊脂糖凝膠電泳玻璃纖維法回收PCR產(chǎn)物中660bp的目的DNA片段。所得擴增片段經(jīng)EcoRV和EcoRI雙酶切，再以瓊脂糖凝膠電泳玻璃纖維法回收酶切產(chǎn)物中的目的DNA片段。2、表達型重組體的構(gòu)建將上述回收的目的DNA片段與同樣經(jīng)EcoRV和EcoRI處理的哺乳動物細胞表達載體pcDNA3.1(-)/Myc-HisA(本實驗室保藏)的DNA片段相連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株JM109。篩選出陽性克隆，從中制備質(zhì)粒，用EcoRV和EcoRI酶切鑒定所得質(zhì)粒。由此鑒定出約含有650bp插入片段的陽性重組質(zhì)粒，命名為pcDNA(3.1)-PEIIImut(圖譜見圖2)。經(jīng)測序顯示所得PEIIImut片段的序列與所設(shè)計的序列相吻合。PEIIImut的大小為642bp，其序列如SEQ ID NO1所示，其中黑體字示出了突變?yōu)镵DEL的氨基酸密碼子的序列。3、pcDNA(3.1)-PEIIImut對細胞的毒性試驗用Hela細胞(得自中國醫(yī)學科學院腫瘤研究所)測試pcDNA(3.1)-PEIIImut對細胞的毒性。
將在液氮中保存的Hela細胞解凍，然后將細胞轉(zhuǎn)移至內(nèi)裝5ml含10％FBS的1640細胞培養(yǎng)基(Promega公司)的培養(yǎng)瓶中。置37℃、5％CO2的恒溫細胞培養(yǎng)箱中，進行培養(yǎng)并傳代。將長勢旺盛的Hela細胞，用胰酶消化懸浮。以新鮮的細胞培養(yǎng)基(含10％FBS)稀釋至1×105細胞/ml。以0.5ml/孔接種24孔細胞培養(yǎng)皿中的15個孔，此15孔分3排，每排接種5孔。置37℃、5％CO2的恒溫細胞培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)12小時；等細胞貼壁后，用于轉(zhuǎn)染。按Promega公司的Lipofectin試劑的說明書進行操作。以空載pcDNA(3.1)作對照試驗。
具體地，將100μl的Lipofectin試劑溶于900μl的無血清的1640細胞培養(yǎng)基中；分別將15μg的pcDNA(3.1)-PEIIImut質(zhì)粒和空載pcDNA(3.1)溶于1ml的無血清的1640細胞培養(yǎng)基中。將這些溶液分別經(jīng)針頭濾器(0.22μm)過濾除菌。各取0.5ml的Lipofectin溶液，分別與兩種質(zhì)粒的溶液混勻。置室溫放置15分鐘，使Lipofectin與質(zhì)粒進行結(jié)合。將上述準備的Hela細胞3排中的2排培養(yǎng)基吸除，以無血清1640細胞培養(yǎng)基(每孔1ml)洗細胞一次。分別加入0.5ml的無血清1640細胞培養(yǎng)基，然后分別加入0.3ml的上述兩種Lipofectin與質(zhì)粒DNA結(jié)合的溶液(每種溶液加一排5孔)。然后將細胞置37℃、5％CO2下培養(yǎng)12小時。再將15孔中的培養(yǎng)基全部吸出，用Hanks液將經(jīng)轉(zhuǎn)染的細胞洗兩遍后，往每孔中加入1ml含10％FBS的1640培養(yǎng)基，置37℃、5％CO2下。48小時后，將24孔細胞培養(yǎng)皿中的15孔細胞按前述方法進行消化懸浮。充分混勻后加入1％的臺盼藍，進行細胞計數(shù)。實驗結(jié)果為，質(zhì)粒pcDNA(3.1)-PEIIImut經(jīng)Lipofectin介導轉(zhuǎn)染Hela細胞，與空載的pcDNA(3.1)經(jīng)Lipofectin介導轉(zhuǎn)染Hela細胞相比，活細胞數(shù)減少19.67％。詳見下表1。
表1.Lipofectin介導的毒素基因轉(zhuǎn)染Hela細胞的試驗結(jié)果
注pcDNA(3.1)-PEIII組與pcDNA(3.1)組之間差異極顯著實施例2 H1-EGFc融合基因的構(gòu)建1、組蛋白H1基因片段的擴增用人類胎盤DNA(本實驗室自行制備)為模板，以如下引物經(jīng)PCR擴增人組蛋白H1基因，所用引物如下上游引物5′-TACATATGTCGGAGACTGCTCCAC-3′NdeI下游引物5′-CGAATTCTTTTTCTTCGGAGCTGCCTTC-3′EcoRIPCR反應(yīng)條件為94℃變性5分鐘后開始循環(huán)94℃變性35秒，60℃退火30秒，72℃延伸60秒。經(jīng)35個循環(huán)后，72℃延伸5分鐘。以1％瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物中的目的DNA片段，得到0.7kb左右的DNA片段。2、EGFc基因片段的擴增用含EGF基因的pUC19重組質(zhì)粒(中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所黃秉仁惠贈)為模板，以如下引物經(jīng)PCR擴增人EGF C環(huán)區(qū)段的編碼序列，所用引物如下上游引物5′-GCGAATTCTAACTGTGTTGTTGGTTAC-3′EcoRI
下游引物5′-CGGATCCTCATTATTCCCACCACTT-3′BamHIPCR反應(yīng)條件為94℃變性5分鐘后開始循環(huán)94℃變性35秒，56℃退火30秒，72℃延伸60秒。經(jīng)35個循環(huán)后，72℃延伸5分鐘。以12％聚丙烯酰胺凝膠電泳回收PCR產(chǎn)物中的目的DNA片段，得到80bp左右的DNA片段。3、H1-EGFc融合基因的構(gòu)建將上述1和2步驟中回收的H1和EGFc基因片段用EcoRI酶切，在此酶切體系中加入T4DNA連接酶，連接過夜，之后用瓊脂糖凝膠電泳的玻璃纖維法回收連接產(chǎn)物中的0.7-0.9kbDNA片段。將此回收的DNA片段經(jīng)PCR擴增，擴增用引物為H1上游引物5′-TACATATGTCGGAGACTGCTCCAC-3′NdeIEGFc下游引物5′-CGGATCCTCATTATTCCCACCACTT-3′BamHIPCR反應(yīng)條件為94℃變性5分鐘后開始循環(huán)94℃變性35秒，58℃退火30秒，72℃延伸60秒。經(jīng)35個循環(huán)后，72℃延伸5分鐘。用玻璃纖維法回收此反應(yīng)體系中目的DNA片段，獲得0.7-0.8kb的DNA片段。4、融合基因的克隆和測序用Promega公司的pGEM T-vector試劑盒按廠商指導將上述步驟3中回收的0.7-0.8kb DNA片段克隆進pGEM T載體中，得到質(zhì)粒pGEM-H1-EGFc，用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌。按分子克隆實驗手冊(冷泉港實驗室出版社)的堿裂解法小量制備質(zhì)粒DNA，限制性分析證實質(zhì)粒插入物大小與融合基因相符。經(jīng)測序表明H1-EGFc融合基因的編碼序列如SEQ ID NO5所示。實施例3含有融合基因H1-EGFc的重組表達載體pLY1-H1-EGFc的構(gòu)建1、含有融合基因H1-EGFc的重組表達載體PET-30a-H1-EGFc的構(gòu)建將實施例2中步驟4得到的質(zhì)粒pGEM-H1-EGFc用NdeI和NcoI雙酶切，回收含融合基因H1-EGFc的約0.7kb-0.8kb的DNA片段。同時用NdeI和NcoI雙酶切PET30a(本實驗室保存)回收大片段。用T4 DNA連接酶將兩個回收片段連接過夜。連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，在含卡那霉素(50μg/ml)的LB瓊脂平板上篩選抗性克隆，分離抗性克隆的質(zhì)粒DNA，用NdeI和NcoI雙酶切證實重組質(zhì)粒，所得質(zhì)粒稱為PET30a-H1-EGFc。這一構(gòu)建過程見圖3所示。
2、含有融合基因H1-EGFc的重組表達載體pLY1-H1-EGFc的構(gòu)建將上述質(zhì)粒PET30a-H1-EGFc用NdeI和BamHI雙酶切，回收含融合基因H1-EGFc的約0.7kb-0.8kb的DNA片段。同時用NdeI和BamHI雙酶切pLY1(本實驗室早先構(gòu)建)回收5kb左右片段。用T4 DNA連接酶將兩個回收片段連接過夜。連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，在含氨芐青霉素(100μg/ml)的LB瓊脂平板上篩選抗性克隆，分離抗性克隆的質(zhì)粒DNA，用NdeI和BamHI雙酶切證實重組質(zhì)粒，所得質(zhì)粒稱為pLY1-H1-EGFc。這一構(gòu)建過程見圖4所示。
另外，以同樣的方式將從質(zhì)粒PET30a-H1-EGFc用NdeI和BamHI雙酶切回收的含融合基因H1-EGFc的約0.7kb-0.8kb的DNA片段克隆進PET15b(本實驗室保存)，構(gòu)建成PET15b-H1-EGFc。實施例4融合蛋白H1-EGFc的表達將實施例3獲得的質(zhì)粒pLY1-H1-EGFc轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，在含氨芐青霉素(100μg/ml)的LB瓊脂平板上篩選轉(zhuǎn)化子。將轉(zhuǎn)化子按2％的比例接種裝有700毫升補加氨芐青霉素(100μg/ml)的LB培養(yǎng)基的2000毫升培養(yǎng)瓶，32℃、250rpm培養(yǎng)3.5小時，再42℃、250rpm溫度誘導3.5小時。離心收獲菌體，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離純化融合蛋白產(chǎn)物。實施例5 H1.3-EGFc融合基因的構(gòu)建用如下引物從實施例3構(gòu)建的質(zhì)粒PET15b-H1-EGFc擴增出融合基因H1-EGFc的片段，同時引入KEX2-XhoI和NotI識別序列。所用引物為正向引物(35bp) 反向引物(26bp) PCR反應(yīng)條件為94℃變性40秒，55～60℃退火40秒，75℃延伸40秒～1分鐘。經(jīng)35個循環(huán)后，75℃延伸10分鐘。得到對應(yīng)大小(416bp)的擴增片段。經(jīng)XhoI和NotI雙酶切后與經(jīng)同樣雙酶切的pPIC9*質(zhì)粒連接，構(gòu)建了pPIC9*-target質(zhì)粒。使用BamH1及BglII雙酶切證實所得質(zhì)粒的正確。將此質(zhì)粒測序，其中所含的融合基因命名為H1.3-EGFc，其編碼序列如SEQ ID NO3所示。
上述所用的質(zhì)粒pPIC9*是考慮到在一個質(zhì)粒上實現(xiàn)多拷貝表達盒的需要，對質(zhì)粒pPIC9上原有的BamHI位點利用Klenow酶大片段進行填平操作而構(gòu)建的。而質(zhì)粒pPIC9是Invitrogen公司產(chǎn)品，其為一種E.coli-巴氏畢赤酵母穿梭質(zhì)粒，能實現(xiàn)外源基因整合于Pichia pastoris基因組并分泌表達的載體。含colE1復制子和氨芐青霉素抗性篩選標記；在巴氏畢赤酵母中可整合于巴氏畢赤酵母基因組的HIS4或AOX1位點，篩選標記為組氨酸營養(yǎng)篩選。啟動子P5’AOX1可被甲醇強烈誘導，其下游與釀酒酵母Saccharomcyces cerevisiae的α-因子分泌信號肽序列相融合，轉(zhuǎn)錄終止序列TT來自3′AOX1基因。在酵母-大腸桿菌穿梭質(zhì)粒中，從AOX基因啟動子及其下游分泌信號肽序列，編碼基因直至轉(zhuǎn)錄終止序列TT的整體合稱為一個“表達盒”。
為了使構(gòu)建的質(zhì)粒能夠在巴氏畢赤酵母中表達，選擇pPIC9*穿梭載體為工具載體。在這個表達載體中，XhoI酶切位點為外源基因多克隆位點之一，它位于α-因子信號序列切割位點(Glu-Lys-Arg*Glu)的上游11bp處。當XhoI位點被用于克隆時，重組質(zhì)粒必須恢復決定XhoI位點的6個堿基及緊隨其后的6個堿基，以保證信號序列的正確切割和目的蛋白的分泌。為此，在PCR的上游引物中加入了XhoI特異切割序列CTCGAG和編碼Lys-Arg的6個堿基，在其后緊接著H1-EGFc編碼基因序列。由于H1-EGFc的第一個氨基酸為Glu，符合α-因子信號切割序列對切割位點下游第一個氨基酸的要求，所以構(gòu)建的表達載體在實際表達時，氨基端不帶有多余氨基酸，最大程度上保持了編碼蛋白的自然序列。下游引物的設(shè)計中加入了NotI位點，這樣可以使編碼基因定向克隆入pPIC9*穿梭質(zhì)粒中。實施例6含有多拷貝融合基因H1.3-EGFc表達盒的質(zhì)粒的構(gòu)建為了實現(xiàn)一個質(zhì)粒上多表達盒重復拷貝，需要在表達盒的起始端引入BglII位點，在其末端引入BamHI位點。由于BglII和BamHI分別切割后的末端連接后不能被兩個酶中任何一個所切開，利用這一點可以實現(xiàn)多個表達盒在一個質(zhì)粒上重復拷貝。
已經(jīng)構(gòu)建的pPIC9*載體上的表達盒起始端已經(jīng)具有BglII位點，在末端引入BamHI位點的設(shè)計上，傳統(tǒng)方法是使用PCR來實現(xiàn)在PCR上游引物設(shè)計上保留BglII位點而在下游引物上設(shè)計BamHI位點。而這樣設(shè)計就不可避免的遇到長片段PCR出現(xiàn)堿基錯配的問題。為了避免這個問題，尋找與BglII和BamHI切割位點相關(guān)的酶，找到BstYI/MflI/XhoII三種同裂酶，其識別位點為RGATCY，在表達盒下游353bp處具有此三種酶酶切位點而表達盒內(nèi)部無此酶的識別位點。這三種酶可以識別BamHI及BglII識別位點以及二者酶切后再連接的融合位點?？紤]到MflI對甲基化宿主敏感，需要更換dam-宿主(如大腸桿菌JM110菌株)而XhoII價格昂貴，故選用BstYI來實現(xiàn)下游BamHI位點的引入。切割后的pPIC9*-target產(chǎn)生12個片段(2351bp，2302bp，1053bp，1029bp，768bp，456bp，188bp，114bp，86bp，17bp，12bp，11bp)，其中2302bp片段含有目的基因，為了使其與臨近的2351bp在瓊脂糖凝膠上區(qū)分開來，將酶切片段用SalI酶切，即將2351bp片段切為1391bp及960bp片段。至此取2302bp DNA片段和預(yù)先用BamHI切割的pAO815連接，得到的質(zhì)粒命名為MFLI，將MFLI質(zhì)粒用BamHI酶切，以上述目的基因片段連接，得到的質(zhì)粒命名為MFLII，MFLI和MFLII質(zhì)粒分別含有I和II拷貝表達盒。酶切鑒定證實該質(zhì)粒的正確。這一構(gòu)建過程如圖5所示。實施例7融合蛋白H1.3-EGFc在甲醇營養(yǎng)型酵母中的表達1.表達載體的線性化及酵母的轉(zhuǎn)化所用表達載體為實施例6制備的MFLII，酵母為巴氏畢赤酵母KM71。KM71(黃秉仁教授贈送)是aox1-缺陷巴氏畢赤酵母株，其AOX1基因被野生型ARG4基因插入破壞，基因型為ARG4 HIS4(缺陷型)AOX1∷ARG，所有轉(zhuǎn)化子均為Muts。
質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母細胞前需經(jīng)線性化處理。線性化表達載體進入巴氏畢赤酵母后，外源基因表達單元可以分別在基因組的his4位點或5′AOX1位點通過單交換插入酵母染色體產(chǎn)生Mut+(MethanolUtilization Plus)酵母株，也可在AOX1位點通過雙交換插入酵母染色體產(chǎn)生Muts酵母株。整合后，表達質(zhì)粒上的his4替換了酵母宿主細胞基因組上原有的缺陷型his4基因，使酵母株表型轉(zhuǎn)變?yōu)镠IS+，能在組氨酸(HIS)缺陷的MD培養(yǎng)基上生長。染色體中沒有外源基因整合的酵母細胞則不能在HIS缺陷的培養(yǎng)基中生長。因此，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物首先需涂布于MD培養(yǎng)基上，以篩選有外源基因整合的轉(zhuǎn)化子。
具體地，酵母細胞的轉(zhuǎn)化方法如下轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的準備取5～10μg大量制備并純化的質(zhì)粒DNA，用SalI或BglII進行單酶切。取少量酶切反應(yīng)產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，確證酶切完全。酚、氯仿抽提，乙醇沉淀，70％乙醇脫鹽后于超凈臺無菌條件下晾干備用。
酵母表達載體線性化常用酶BglII于AOX1位點取代(SMD1168，Muts)SalI于HIS4位點插入基因組。(SMD1168，Mut+或KM71，Muts)電轉(zhuǎn)法a.取冷凍的畢赤酵母菌種劃線于YPD板，30℃培養(yǎng)2～3天。挑取單菌落接種于5ml YPD，30℃劇烈振蕩(大于200r/min)培養(yǎng)過夜。以1/1000～1/1500轉(zhuǎn)接量接種于50ml YPD，再一次培養(yǎng)過夜，至OD600＝1.3～1.5。b.4℃1500g離心5分鐘收集細胞。用40ml冰冷的無菌去離子水洗滌沉淀。同樣條件離心5分鐘收集細胞。c.20ml冰冷的無菌去離子重復上述操作一次。d.重懸細胞于20ml冰冷的1mol/L山梨醇溶液中。離心收集細胞沉淀。e.細胞沉淀重懸于400μl冰冷的1mol/L山梨醇溶液中，放置冰上備用。f.取1.5mlEppendorf管，每管加入40μl制備好的細胞。分別加入5～10μg線性化質(zhì)粒DNA?；靹蚝筠D(zhuǎn)入冰冷的電轉(zhuǎn)杯中，冰浴5分鐘以上。g.設(shè)置電穿孔儀以產(chǎn)生7500V/cm，4-5ms的電脈沖。使用Bio-Rad產(chǎn)品時的具體設(shè)置為電壓1500V，電容25μF，電阻200Ω。電擊后立即在電轉(zhuǎn)杯中加入0.8ml冰冷的1mol/L山梨醇，混勻。h.細胞懸液涂布于MD培養(yǎng)基上，每個9cm直徑平板涂300μl，15cm平板涂600μl。30℃培養(yǎng)至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)。2.分泌表達目的蛋白的陽性轉(zhuǎn)化子的篩選挑取在MD培養(yǎng)基上生長的His+轉(zhuǎn)化子于50ml離心管中進行小量培養(yǎng)誘導，以篩選分泌表達目的蛋白的陽性酵母株。誘導3-4天后，離心收集培養(yǎng)上清行SDS-PAGE分析，觀察目的蛋白的表達情況。
挑取20個KM71/MFLII的His+轉(zhuǎn)化株進行篩選，得到三個有H1.3-EGFc分泌表達的轉(zhuǎn)化株，其培養(yǎng)上清經(jīng)SDS-PAGE分析顯示，在約17KD處有蛋白帶出現(xiàn)，比理論氨基酸序列推算分子量大，考慮有糖基化修飾所致。雜蛋白大多在43KD以上，目的蛋白附近并沒有明顯雜蛋白條帶。經(jīng)SDS-PAGE凝膠激光掃描分析，目的蛋白占培養(yǎng)基總蛋白的50％，粗略計算表達量為0.3g/L。實施例8靶向基因藥物H1-EGFc+pcDNA(3.1)-PEIIImut的制備及其對不同細胞的殺傷作用的檢測(一)蛋白H1-EGFc與質(zhì)粒pcDNA(3.1)-PEIIImut結(jié)合產(chǎn)物的制備1.質(zhì)粒pcDNA(3.1)-PEIIImut和蛋白H1EGFc電荷數(shù)及質(zhì)量比質(zhì)粒pcDNA(3.1)-PEIIImut(見實施例1)共有6142bp，其中A+T＝2854，G+C＝3288。根據(jù)美國PE公司的DNA分子量計算公式MW＝A×312+C×288+G×328+T×303-61該質(zhì)粒的分子量為3780557。其所含負電荷數(shù)為2×6142＝12284。其質(zhì)量電荷比為307.76蛋白H1-EGF c來自大腸系統(tǒng)，其分子量為25050，凈正電荷數(shù)為58，其質(zhì)量電荷比為431.89根據(jù)電荷數(shù)相等結(jié)合的原則，蛋白H1-EGFc和質(zhì)粒pcDNA(3.1)-PEIII的質(zhì)量比應(yīng)為1.4033∶1，但考慮到蛋白的純度，將此比例定為1.5∶1。2.蛋白H1-EGFc與質(zhì)粒pcDNA(3.1)-PEIII的結(jié)合將0.1克的質(zhì)粒pcDNA(3.1)-PEIII和0.15克的蛋白H1-EGFc溶于2ml 2M NaCl中，在室溫下放置1小時，讓它們結(jié)合。然后將此溶液于200ml的0.15M的NaCl中透析48小時。將此蛋白和DNA結(jié)合產(chǎn)物，用0.8％的瓊脂糖電泳進行檢測(同時用牛血清白蛋白代替融合蛋白H1-EGFc，作對照試驗)。
此蛋白和DNA結(jié)合產(chǎn)物，就是本發(fā)明所設(shè)計的、針對EGFR過度表達的腫瘤的靶向基因藥物。(二)靶向基因藥物對JK細胞的毒性作用JK細胞株(中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所保存)系懸浮培養(yǎng)的細胞，在24孔細胞培養(yǎng)皿的18個孔中，每孔加入1ml含1.5×105JK細胞的培養(yǎng)基。試驗分為6組，每組3個平行試驗。6組分別為a.空白對照組，不加任何試劑；b.質(zhì)粒pcDNA(3.1)-PEIII對照組，加入3μg質(zhì)粒pcDNA(3.1)-PEIII；c.蛋白H1-EGFc對照組，加入4.5μg蛋白H1-EGFc；d.含1μg DNA的基因藥物組，e.含2μg DNA的基因藥物組，f.含3μg DNA的基因藥物組。
在加藥48小時后，將各孔細胞分別吹散、混勻，進行計數(shù)。(三)靶向基因藥物對BT-325細胞的毒性作用BT-325細胞株(中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所保存)為貼壁培養(yǎng)的細胞。每孔接種5×104細胞，培養(yǎng)12小時開始加藥，培養(yǎng)基加至1ml。試驗也按上述同樣的6組進行，每組3個平行試驗。加藥48小時后，消化懸浮細胞進行計數(shù)。(四)靶向基因藥物對Hela細胞的毒性作用1.靶向基因藥物對正常培養(yǎng)基中的Hela細胞的毒性作用試驗按上述BT-235細胞同樣的設(shè)計和方法進行，細胞接種量為每孔5×104。2.靶向基因藥物對含過量EGF的培養(yǎng)基中Hela細胞的毒性作用細胞的準備同上，試驗分3組，每組5個平行試驗。第一組是空白對照組，不加任何試劑；第二組，每孔加入含3μg DNA的靶向基因藥物；第三組，每孔加入3μg的EGF和含3μg DNA的靶向基因藥物。實驗結(jié)果(一)目的蛋白H1-EGFc與質(zhì)粒pcDNA(3.1)-PEIIImut的結(jié)合情況蛋白H1-EGFc和DNA結(jié)合產(chǎn)物，經(jīng)0.8％的瓊脂糖電泳檢測結(jié)果如圖，其DNA遷移速度極其緩慢。而在以牛血清白蛋白替代蛋白H1-EGFc所進行的結(jié)合試驗中，DNA的遷移速度與未進行蛋白結(jié)合的相同。(二)JK細胞的計數(shù)結(jié)果與對照組相比，在細胞培養(yǎng)基中加入融合蛋白H1EGFc、質(zhì)粒pcDNA(3.1)-PEIIImut以及此融合蛋白和質(zhì)粒結(jié)合產(chǎn)物的各組，細胞數(shù)無顯著差異。此結(jié)果表明，這三種處理對JK細胞的生長，沒有明顯的影響。詳細的數(shù)據(jù)見下表2。表2 EGFR介導的質(zhì)粒pcDNA(3.1)-PEIIImut轉(zhuǎn)染JK細胞的結(jié)果
注1各組間無顯著差異。(三)BT-325細胞的計數(shù)結(jié)果與對照組相比，在細胞培養(yǎng)基中分別加入融合蛋白H1-EGFc或質(zhì)粒pcDNA(3.1)-PEIIImut組，細胞數(shù)無顯著差異。此結(jié)果表明，這兩種處理對BT-325細胞的生長沒有明顯的影響。
在細胞培養(yǎng)基中加入融合蛋白H1-EGFc和質(zhì)粒pcDNA(3.1)-PEIIImut的復合物的各組，與對照組相比細胞數(shù)有著極其顯著的差異。其中，含1μg DNA組，細胞數(shù)減少35.59％；含2μg DNA組，細胞數(shù)減少40.61％；含3μg DNA組，細胞數(shù)減少46.03％。此結(jié)果表明，融合蛋白H1-EGFc和質(zhì)粒pcDNA(3.1)-PEIIImut的復合物對BT-325細胞的生長有極其明顯地抑制作用。具體結(jié)果見下表3。表3 EGFR介導的質(zhì)粒pcDNA(3.1)-PEIIImut轉(zhuǎn)染BT-325細胞的試驗結(jié)果
(四)Hela細胞的計數(shù)結(jié)果1.正常培養(yǎng)基中的Hela細胞計數(shù)結(jié)果在細胞培養(yǎng)基中分別加入融合蛋白H1-EGFc或質(zhì)粒pcDNA(3.1)-PEIIImut組，與對照組相比細胞數(shù)無顯著差異。此結(jié)果表明，這兩種處理對Hela細胞的生長沒有明顯的影響。
在細胞培養(yǎng)基中加入融合蛋白H1-EGFc和質(zhì)粒pcDNA(3.1)-PEIIImut的復合物的各組，與對照組相比細胞數(shù)有著極其顯著的差異。其中，含1μg DNA組，細胞數(shù)減少39.59％；含2μg DNA組，細胞數(shù)減少44.15％；含3μg DNA組，細胞數(shù)減少48.12％。此結(jié)果表明，融合蛋白H1-EGFc和質(zhì)粒pcDNA(3.1)-PEIIImut的復合物對Hela細胞的生長有極其明顯地抑制作用。具體結(jié)果見下表4。表4 EGFR介導的質(zhì)粒pcDNA(3.1)-PEIIImut轉(zhuǎn)染Hela細胞的試驗結(jié)果
2.含過量EGF的培養(yǎng)基中Hela細胞的計數(shù)結(jié)果在加入3μg EGF和含3μg DNA基因藥物的培養(yǎng)基中，Hela細胞數(shù)目與對照組相比，上升10.66％。此結(jié)果表明，EGF可結(jié)合并封閉癌細胞表面的EGF受體，從而消除該基因藥物對Hela細胞生長的抑制作用。這一結(jié)果說明，在本設(shè)計方案中，PEIIImut對癌細胞的靶向殺滅作用是通過EGFc介導的。具體結(jié)果見下表5。表5 EGF競爭結(jié)合的EGFR介導的毒素基因轉(zhuǎn)染Hela細胞的試驗結(jié)果
以上所述各項細胞實驗的統(tǒng)計結(jié)果圖見圖6-圖9。實施例9靶向基因藥物H1.3-EGFc+pcDNA(3.1)-PEIIImut的制備及其對不同細胞的毒性作用的檢測(融合蛋白H1，3-EGFc來自酵母系統(tǒng))1、靶向基因藥物即轉(zhuǎn)染復合物的制備本實施例所用融合蛋白H1.3-EGFc(見實施例7)既作為靶向蛋白，又作為DNA結(jié)合蛋白；所用質(zhì)粒DNA為實施例1的毒素基因表達載體pcDNA(3.1)-PEIIImut。由于H1.3上富含帶正電的賴氨酸，將與帶負電性的DNA分子結(jié)合，從而使整個復合物分子整體電性趨近于中性，在瓊脂糖電泳上表現(xiàn)出電泳遷移率滯后的現(xiàn)象。有文獻表明，當此復合物達到完全滯留時，即在電場作用下一直滯留在上樣孔中時，二者達到最佳結(jié)合。預(yù)先將靶向蛋白溶液在4℃放置過夜以充分復性，然后將DNA與靶向蛋白溶液按照不同比例混合，在20℃反應(yīng)30分鐘使二者結(jié)合，在0.8％瓊脂糖凝膠上觀察電泳遷移率的變化。根據(jù)結(jié)果，初步確定DNA/蛋白質(zhì)量比例為1/1.2。
取適量的蛋白質(zhì)溶于DMEM培養(yǎng)基中，于4℃放置過夜復性后，以0.22μm濾膜過濾。然后將質(zhì)粒DNA(pcDNA(3.1)-PEIIImut)的DMEM溶液以0.22μm濾膜過濾，并將兩者混合。室溫放置30分鐘后用于轉(zhuǎn)染，取出部分混合液在0.8％瓊脂糖凝膠上觀察電泳遷移率的變化。轉(zhuǎn)染前在混合物中加入1％的胎牛血清2、毒素基因的轉(zhuǎn)染和表達本試驗采用3個劑量組。分別用1μg、2μg和3μg的質(zhì)粒與相應(yīng)量的蛋白質(zhì)，并加適量DMEM將每孔培養(yǎng)液補至2ml，于24孔細胞培養(yǎng)板中分別轉(zhuǎn)染1.5×105的Hela細胞、BT-325細胞和JK細胞。另外，以3.6μg蛋白(相當于3μg DNA對應(yīng)蛋白)以及3μg質(zhì)粒DNA作為空白對照，分別轉(zhuǎn)染上述三種細胞，同時還有一組正常細胞不經(jīng)任何轉(zhuǎn)染處理，以用作正常生長對照。
轉(zhuǎn)染48小時后，于顯微鏡下觀察細胞生長情況，H1.3-EGFc/DNA復合物轉(zhuǎn)染組的細胞生長狀況明顯劣于其它各組細胞，細胞數(shù)相對較少，出現(xiàn)許多死亡細胞。同時用血球計數(shù)器觀察計數(shù)各孔的存活細胞數(shù)。所得各孔存活細胞數(shù)進行方差分析和T檢驗(T-test)分析，結(jié)果顯示(表6)，空白對照組、正常生長對照組及單獨融合蛋白、單獨質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染組各樣品轉(zhuǎn)染小組的存活細胞數(shù)沒有顯著性差異(p＞0.05)，說明H1.3-EGFc融合蛋白以及質(zhì)粒DNA單獨使用對JK細胞以及Hela、BT-325細胞的生長無影響。H1.3-EGFc/質(zhì)粒DNA復合物轉(zhuǎn)染的JK細胞存活數(shù)與對照無顯著差異(p＞0.05)，說明這些物質(zhì)對于JK細胞的生長無顯著影響。H1.3-EGFc/質(zhì)粒DNA復合物的1-3μg DNA劑量轉(zhuǎn)染組的存活細胞相對于空白對照有明顯的減少(p＜0.05或＜0.01)。但1-3μg劑量組之間細胞存活數(shù)在BT-325細胞之間無顯著差異，而在Hela細胞之間有波動。
以正常生長組的存活細胞數(shù)作對照，計算出各轉(zhuǎn)染復合物對Hela細胞以及BT-325細胞的殺傷率。所得數(shù)據(jù)顯示，1-3μg DNA劑量的H1.3-EGFc/pcDNA(3.1)-PEIIImut對Hela細胞的殺傷率約為40.6％-53％，對BT-325細胞的殺傷率約為62％。細胞實驗結(jié)果統(tǒng)計圖見
圖10-
圖12。
表6H1.3-EGFc/pcDNA(3.1)-PEIIImut復合物細胞實驗結(jié)果 轉(zhuǎn)染劑量I1μg DNA及相應(yīng)蛋白；II2μgDNA及相應(yīng)蛋白；III3μg DNA及相應(yīng)蛋白。統(tǒng)計檢驗JK細胞各組之間無顯著差異；BT-325細胞3μg DNA組與對照之間有極顯著差異，其余劑量組和對照之間有顯著差異；Hela細胞各劑量和對照之間有顯著差異。
序列表SEQ ID NO1(PEIIImut核苷酸序列)ATGCTCGGCGACGGCGGCGACGTCAGCTTCAGCACCCGCGGCACGCAGAACTGGACGGTGGAGCGGCTGCTCCAGGCGCACCGCCAACTGGAGGAGCGCGGCTATGTGTTCGTCGGCTACCACGGCACCTTCCTCGAAGCGGCGCAAAGCATCGTCTTCGGCGGGGTGCGCGCGCGCAACCAGGACCTCGACGCGATCTGGCGCGGTTTCTATATCGCCGGCGATCCGGCGCTGGCCTACGGCTACGCCCAGGACCAGGAACCCGACGCACGCGGCCGGATCCGCAACGGTGCCCTGCTGCGGGTCTATGTGCCGCGCTCGAGCCTGCCGGGCTTCTACCGCACCAGCCTGACCCTGGCCGCGCCGGAGGCGGCGGGCGAGGTCGAACGGCTGATCGGCCATCCGCTGCCGCTGCGCCTGGACGCCATCACCGGCCCCGAGGAGGAAGGCGGGCGCCTGGAGACCATTCTCGGCTGGCCGCTGGCCGAGCGCACCGTGGTGATTCCCTCGGCGATCCCCACCGACCCGCGCAACGTCGGCGGCGACCTCGACCCGTCCAGCATCCCCGACAAGGAACAGGCGATCAGCGCCCTGCCGGACTACGCCAGCCAGCCCGGCAAACCGCCGAAGGACGAACTGTAASEQ ID NO2(PEIIImut編碼的氨基酸序列)MLGDGGDVSFSTRGTQNWTVERLLQAHRQLEERGYVFVGYHGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAIWRGFYIAGDPALAYGYAQDQEPDARGRIRNGALLRVYVPRSSLPGFYRTSLTLAAPEAAGEVERLIGHPLPLRLDAITGPEEEGGRLETILGWPLAERTVVIPSAIPTDPRNVGGDLDPSSIPDKEQAISALPDYASQPGDPPKDELSEQ ID NO3(H1.3-EGFc編碼序列)GAAGGCAAACCCAAGGCCAAAAAGGCTGGCGCAGCCAAGCCTAGGAAGCCTGCTGGGGCAGCCAAGAAGCCCAAGAAGGTGGCTGGCGCCGCTACCCCCAAGAAAAGCATCAAAAAGACTCCTAAGAAGGTAAAGAAGCCAGCAACCGCTGCTGGGACCAAGAAAGTGGCCAAGAGTGCGAAAAAGGTGAAAACACCTCAGCCAAAAAAAGCTGCCAAGAGTCCAGCTAAGGCCAAAGCCCCTAAGCCCAAGGCGGCCAAGCCTAAGTCGGGGAAGCCGAAGGTTACAAAGGCAAAGAAGGCAGCTCCGAAGAAAAAGAATTCTAACTGTGTTGTTGGTTACATCGGTGAAAGATGTCAATACAGAGACTTGAAGTGGTGGGAATAATGASEQ ID NO4(H1.3-EGFc氨基酸序列)EGKPKAKKAGAAKPRKPAGAAKKPKKVAGAATPKKSIKKTPKKVKKPATAAGTKKVAKSAKKVKTPQPKKAAKSPAKAKAPKPKAAKPKSGKPKVTKAKKAAPKKKNSNCVVGYIGERCQYRDLKWWESEQ ID NO5(H1-EGFc編碼序列)ATGTCGGAGACTGCTCCACTTGCTCCTACCATTCCTGCACCCGCAGAAAAAACACCTGTGAAGAAAAAGGCGAAGAAGGCAGGCGCAACTGCTGGGAAACGCAAAGCTTCCGGACCCCCAGTATCTGAGCTTATCACCAAGGCAGTGGCAGCTTCTAAGGAGCGCAGCGGCGTTTCTCTGGCCGCGCTTAAGAAAGCGCTTGCGGCTGCTGGCTACGATGTAGAAAAAAACAACAGCCGTATCAAGCTTGGCCTCAAGAGCTTGGTGAGCAAAGGTACTCTGGTGCAGACCAAAGGTACCGGTGCTTCTGGCTCCTTCAAACTCAACAAGAAAGCGGCTTCCGGGGAAGGCAAACCCAAGGCCAAAAAGGCTGGCGCAGCCAAGCCTAGGAAGCCTGCTGGGGCAGCCAAGAAGCCCAAGAAGGTGGCTGGCGCCGCTACCCCGAAGAAAAGCATCAAAAAGACTCCTAAGAAGGTAAAGAAGCCAGCAACCGCTGCTGGGACCAAGAAAGTGGCCAAGAGTGCGAAAAAGGTGAAAACACCTCAGCCAAAAAAAGCTGCCAAGAGTCCAGCTAAGGCCAAAGCCCCTAAGCCCAAGGCGGCCAAGCCTAAGTCGGGGAAGCCGAAGGTTACAAAGGCAAAGAAGGCAGCTCCGAAGAAAAAGAATTCTAACTGTGTTGTTGGTTACATCGGTGAAAGATGTCAATACAGAGACTTGAAGTGGGAATAATGASEQ ID NO6(H1-EGFc氨基酸序列)MSETAPLAPTIPAPAEKTPVKKKAKKAGATAGKRKASGPPVSELITKAVAASKERSGVSLAALKKALAAAGYDVEKNNSRIKLGLKSLVSKGTLVQTKGTGASGSFKLNKKAASGEGKPKAKKAGAAKPRKPAGAAKKPKKVAGAATPKKSIKKTPKKVKKPATAAGTKKVAKSAKKVKTPQPKKAAKSPAKAKAPKPKAAKPKSGKPKVTKAKKAAPKKKNSNCVVGYIGERCQYRDLKWWE
權(quán)利要求
1.編碼經(jīng)突變改型的綠膿桿菌毒素第III結(jié)構(gòu)域的重組DNAPEIIImut，其具有如下核苷酸序列ATGCTCGGCGACGGCGGCGACGTCAGCTTCAGCACCCGCGGCACGCAGAACTGGACGGTGGAGCGGCTGCTCCAGGCGCACCGCCAACTGGAGGAGCGCGGCTATGTGTTCGTCGGCTACCACGGCACCTTCCTCGAAGCGGCGCAAAGCATCGTCTTCGGCGGGGTGCGCGCGCGCAACCAGGACCTCGACGCGATCTGGCGCGGTTTCTATATCGCCGGCGATCCGGCGCTGGCCTACGGCTACGCCCAGGACCAGGAACCCGACGCACGCGGCCGGATCCGCAACGGTGCCCTGCTGCGGGTCTATGTGCCGCGCTCGAGCCTGCCGGGCTTCTACCGCACCAGCCTGACCCTGGCCGCGCCGGAGGCGGCGGGCGAGGTCGAACGGCTGATCGGCCATCCGCTGCCGCTGCGCCTGGACGCCATCACCGGCCCCGAGGAGGAAGGCGGGCGCCTGGAGACCATTCTCGGCTGGCCGCTGGCCGAGCGCACCGTGGTGATTCCCTCGGCGATCCCCACCGACCCGCGCAACGTCGGCGGCGACCTCGACCCGTCCAGCATCCCCGACAAGGAACAGGCGATCAGCGCCCTGCCGGACTACGCCAGCCAGCCCGGCAAACCGCCGAAGGACGAACTGTAA
2.由權(quán)利要求1的重組DNA PEIIImut編碼的蛋白質(zhì)，具有如下氨基酸序列MLGDGGDVSFSTRGTQNWTVERLLQAHRQLEERGYVFVGYHGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAIWRGFYIAGDPALAYGYAQDQEPDARGRIRNGALLRVYVPRSSLPGFYRTSLTLAAPEAAGEVERLIGHPLPLRLDAITGPEEEGGRLETILGWPLAERTVVIPSAIPTDPRNVGGDLDPSSIPDKEQAISALPDYASQPGDPPKDEL
3.含有權(quán)利要求1的重組DNA PEIIImut的真核表達型重組體。
4.權(quán)利要求3的真核表達型重組體，其為質(zhì)粒pcDNA(3.1)-PEIIImut，所述質(zhì)粒以包含于大腸桿菌中的形式保藏在中國微生物保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.0478。
5.一種融合基因，從5’到3’依次包括編碼人類組蛋白H1第115位-第221位的106個氨基酸的核苷酸序列和編碼人類表皮生長因子C環(huán)的最后22個氨基酸的核苷酸序列，其具有如下核苷酸序列GAAGGCAAACCCAAGGCCAAAAAGGCTGGCGCAGCCAAGCCTAGGAAGCCTGCTGGGGCAGCCAAGAAGCCCAAGAAGGTGGCTGGCGCCGCTACCCCCAAGAAAAGCATCAAAAAGACTCCTAAGAAGGTAAAGAAGCCAGCAACCGCTGCTGGGACCAAGAAAGTGGCCAAGAGTGCGAAAAAGGTGAAAACACCTCAGCCAAAAAAAGCTGCCAAGAGTCCAGCTAAGGCCAAAGCCCCTAAGCCCAAGGCGGCCAAGCCTAAGTCGGGGAAGCCGAAGGTTACAAAGGCAAAGAAGGCAGCTCCGAAGAAAAAGAATTCTAACTGTGTTGTTGGTTACATCGGTGAAAGATGTCAATACAGAGACTTGAAGTGGTGGGAATAATGA
6.含有權(quán)利要求5的融合基因的表達型重組體，其為MFLII，圖譜見圖5。
7.用權(quán)利要求6的表達型重組體轉(zhuǎn)化的畢赤酵母細胞，其為巴氏畢赤酵母/KM71/MFLII，該細胞保藏在中國微生物保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.0476。
8.由權(quán)利要求7的畢赤酵母細胞表達的融合蛋白，其具有如下氨基酸序列EGKPKAKKAGAAKPRKPAGAAKKPKKVAGAATPKKSIKKTPKKVKKPATAAGTKKVAKSAKKVKTPQPKKAAKSPAKAKAPKPKAAKPKSGKPKVTKAKKAAPKKKNSNCVVGYIGERCQYRDLKWWE
9.一種融合基因，從5’到3’依次包括編碼人類組蛋白H1第1位-第221位的221個氨基酸的核苷酸序列和編碼人類表皮生長因子C環(huán)的最后22個氨基酸的核苷酸序列，其具有如下核苷酸序列ATGTCGGAGACTGCTCCACTTGCTCCTACCATTCCTGCACCCGCAGAAAAAACACCTGTGAAGAAAAAGGCGAAGAAGGCAGGCGCAACTGCTGGGAAACGCAAAGCTTCCGGACCCCCAGTATCTGAGCTTATCACCAAGGCAGTGGCAGCTTCTAAGGAGCGCAGCGGCGTTTCTCTGGCCGCGCTTAAGAAAGCGCTTGCGGCTGCTGGCTACGATGTAGAAAAAAACAACAGCCGTATCAAGCTTGGCCTCAAGAGCTTGGTGAGCAAAGGTACTCTGGTGCAGACCAAAGGTACCGGTGCTTCTGGCTCCTTCAAACTCAACAAGAAAGCGGCTTCCGGGGAAGGCAAACCCAAGGCCAAAAAGGCTGGCGCAGCCAAGCCTAGGAAGCCTGCTGGGGCAGCCAAGAAGCCCAAGAAGGTGGCTGGCGCCGCTACCCCGAAGAAAAGCATCAAAAAGACTCCTAAGAAGGTAAAGAAGCCAGCAACCGCTGCTGGGACCAAGAAAGTGGCCAAGAGTGCGAAAAAGGTGAAAACACCTCAGCCAAAAAAAGCTGCCAAGAGTCCAGCTAAGGCCAAAGCCCCTAAGCCCAAGGCGGCCAAGCCTAAGTCGGGGAAGCCGAAGGTTACAAAGGCAAAGAAGGCAGCTCCGAAGAAAAAGAATTCTAACTGTGTTGTTGGTTACATCGGTGAAAGATGTCAATACAGAGACTTGAAGTGGGAATAATGA
10.含有權(quán)利要求9的融合基因的表達型重組體，其為pLYI-H1-EGFc，其以包含于大腸桿菌中的形式保藏在中國微生物保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.0477。
11.用權(quán)利要求10的表達型重組體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細胞。
12.由權(quán)利要求11的大腸桿菌細胞表達的融合蛋白，其具有如下氨基酸序列MSETAPLAPTIPAPAEKTPVKKKAKKAGATAGKRKASGPPVSELITKAVAASKERSGVSLAALKKALAAAGYDVEKNNSRIKLGLKSLVSKGTLVQTKGTGASGSFKLNKKAASGEGKPKAKKAGAAKPRKPAGAAKKPKKVAGAATPKKSIKKTPKKVKKPATAAGTKKVAKSAKKVKTPQPKKAAKSPAKAKAPKPKAAKPKSGKPKVTKAKKAAPKKKNSNCVVGYIGERCQYRDLKWWE
13.一種用于細胞表面EGF受體富集的惡性腫瘤的靶向基因治療的藥物，其包括權(quán)利要求3或4的真核表達型重組體與 8的融合蛋白的復合物。
14.一種用于細胞表面EGF受體富集的惡性腫瘤的靶向基因治療的藥物，其包括權(quán)利要求3或4的重組表達型重組體與 12的融合蛋白的復合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及突變改型的編碼綠膿桿菌毒素第III結(jié)構(gòu)域的重組DNA,包含所述重組DNA的表達型重組體,以及由所述的表達型重組體與一種融合蛋白的復合物制備的針對惡性腫瘤特別是細胞表面表皮生長因子富集的惡性腫瘤的靶向基因治療藥物。所述的融合蛋白由人組蛋白H1一部分和人表皮生長因子一部分組成,其也是本發(fā)明的一個方面。
文檔編號C12N15/62GK1361285SQ0013711
公開日2002年7月31日 申請日期2000年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月28日
發(fā)明者盧圣棟, 郭蕾, 李勇, 方華圣, 陳偉京, 王俊, 洪梅, 路金芝, 張樹政 申請人:中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所