減毒鼠傷寒沙門氏菌及其基因工程菌在制備治療前列腺癌的藥物上的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了減毒鼠傷寒沙門氏菌及其基因工程菌在制備治療前列腺癌的藥物上的應(yīng)用，減毒鼠傷寒沙門氏菌對前列腺癌細(xì)胞具有腫瘤靶向性及顯著的抑制效應(yīng)，并且由其與質(zhì)粒所構(gòu)建的基因工程菌同樣具有腫瘤靶向性，且?guī)в锌寺∮蠰-methioninase基因的質(zhì)粒的減毒鼠傷寒沙門氏菌可以在腫瘤組織持續(xù)表達(dá)L-methioninase，大量消耗甲硫氨酸及其它營養(yǎng)物質(zhì)，使得腫瘤細(xì)胞缺乏營養(yǎng)，生長緩慢，因此均可以用于制備治療前列腺癌的藥物。
【專利說明】減毒鼠傷寒沙門氏菌及其基因工程菌在制備治療前列腺癌的藥物上的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及減毒鼠傷寒沙門氏菌及其基因工程菌在制備治療前列腺癌的藥物上的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]前列腺癌是歐美國家男性最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率在美國位于男性惡性腫瘤第一位，其死亡率僅次于肺癌居第二位。近年來，在我國其發(fā)病率也呈現(xiàn)逐年上升的趨勢，且前列腺癌的組織學(xué)惡性程度高于美國患者。據(jù)國內(nèi)上海市區(qū)對泌尿系惡性腫瘤患者的相對生存率調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在中國80.0 %~90.0 %的患者在就診時已經(jīng)是晚期前列腺癌，5年生存率不到30%。由于我國人口基數(shù)大，前列腺癌患病人數(shù)激增，必須重視前列腺癌的預(yù)防和治療。前列腺癌的傳統(tǒng)治療方法包括手術(shù)、內(nèi)分泌治療和放化療，治療效果并不十分理想。手術(shù)治療后復(fù)發(fā)率比較高。對于復(fù)發(fā)的前列腺癌，往往需要采取雄激素剝奪的內(nèi)分泌治療。前列腺癌的內(nèi)分泌治療可分為3類，即去勢治療、抗雄激素治療以及兩者的聯(lián)合應(yīng)用，即全雄阻斷去勢治療。內(nèi)分泌治療持續(xù)治療2~5年后，前列腺癌一般會發(fā)展為雄激素非依賴性。對于雄激素非依賴性前列腺癌患者，目前的治療方法包括化療、放療、核素內(nèi)照射以及雙磷酸鹽治療等，療效均不滿意，前列腺癌的治療陷入窘境，對于前列腺癌的治療，迫切需要新的更有效的治療方案。因此科學(xué)家和臨床專家們一直在積極探索更為安全有效的治療方案。隨著細(xì)菌以及病毒的靶向性和基因工程技術(shù)的發(fā)展，20世紀(jì)90年代中期以來，細(xì)菌治療腫瘤的研究急速增多。研究人員發(fā)現(xiàn)鼠傷寒沙門氏菌在小鼠體內(nèi)能夠定向并有效地殺死腫瘤細(xì)胞。
[0003]沙門菌屬是一群在人和動物腸道內(nèi)寄生的革蘭氏陰性、侵襲性細(xì)胞內(nèi)兼性厭氧菌。VNP20009為msbB、pur I基因缺失的減毒鼠傷寒沙門菌株，遺傳穩(wěn)定，對抗生素敏感。msbB基因?yàn)橹|(zhì)?；癁閮?nèi)毒素所必需，其缺失使類脂質(zhì)A末端不能?；?，降低了毒性；purI基因參與嘌呤代謝，其缺失使細(xì)菌的繁殖需要外源性腺嘌呤。VNP20009還降低了自身誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF),從而降低炎性反應(yīng)。因此，它的低致病性提高了用于臨床治療的安全性。VNP20009已被廣泛用于癌癥研究，它可作用于多種小鼠實(shí)體瘤模型，包括黑色素瘤、肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、腎癌。VNP20009作為腫瘤基因治療載體的一個主要優(yōu)點(diǎn)是它能夠高度靶向聚集于腫瘤部位。研究人員在多種實(shí)體腫瘤的小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，VNP20009在腫瘤內(nèi)的數(shù)量較肝臟等主要器官內(nèi)高200~1000倍。VNP20009能在腫瘤組織缺氧壞死區(qū)優(yōu)先聚集并繁殖，相同時間內(nèi)腫瘤組織內(nèi)細(xì)菌的擴(kuò)增代次顯著高于正常組織，使得減毒沙門菌成為新型抗瘤制劑和腫瘤靶向治療的載體成為可能。沙門菌導(dǎo)致腫瘤生長減慢可能機(jī)制包括:腫瘤生長所需要的營養(yǎng)物質(zhì)為細(xì)菌所消耗，細(xì)菌所產(chǎn)生的酶，如天冬酰胺酶，可耗竭腫瘤生長必需氨基酸；細(xì)菌向胞外微環(huán)境分泌的局部毒素或者產(chǎn)生的腫瘤壞死因子α，都可影響腫瘤血管形成；此外，在細(xì)菌生長部位的非特異性炎癥反應(yīng)可潛在激活抗腫瘤T細(xì)胞。但尚未發(fā)現(xiàn)VNP20009對前列腺癌細(xì)胞的抗腫瘤活性。
[0004]腫瘤細(xì)胞為了維持其高增殖率，需要足夠的營養(yǎng)。除糖之外，對甲硫氨酸(Methionine, Met)、谷胺酰氨、精氨酸等需要量尤其大。研究證實(shí)Met依賴性是絕大多數(shù)腫瘤細(xì)胞的共同特征，如乳腺癌、前列腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、腎癌、膀胱癌、黑色素瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等，而正常細(xì)胞不存在Met依賴性。一些體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)相繼證實(shí)，直接食用甲硫氨酸缺乏的膳食可以延緩腫瘤細(xì)胞的增殖。但是若膳食中Met長期缺乏或不足，將會引起機(jī)體營養(yǎng)不良、代謝障礙，還可因DNA長期處于低甲基化狀態(tài)加劇癌變。那么，通過甲硫氨酸酶(L-methioninase)特異性地將Met分解,從而降低體內(nèi)甲硫氨酸水平，則能更加有效地抑制腫瘤細(xì)胞生長或使之消退。動物實(shí)驗(yàn)已證明經(jīng)腹膜內(nèi)注射甲硫氨酸酶可以抑制裸鼠的吉田肉瘤和肺腫瘤的增長。臨床試驗(yàn)選四個分別患有乳腺癌、肺癌、腎癌和淋巴瘤的患者每24h靜脈注射一次甲硫氨酸酶，發(fā)現(xiàn)甲硫氨酸酶可以明顯減少血漿中甲硫氨酸含量。但是，由于哺乳動物本身不表達(dá)甲硫氨酸酶，所以外源性給與的方式有一定的副作用，往往引起機(jī)體的免疫反應(yīng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的一個技術(shù)問題在于提供減毒鼠傷寒沙門氏菌及其基因工程菌在制備治療前列腺癌的生物藥物上的應(yīng)用。
[0006]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
[0007]本發(fā)明提出了減毒鼠傷寒沙門氏菌在制備治療前列腺癌的藥物上的應(yīng)用，所述減毒鼠傷寒沙門氏菌為減 毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009。
[0008]本發(fā)明同時提出一種基因工程菌在制備治療前列腺癌的藥物上的應(yīng)用，所述基因工程菌為攜帶質(zhì)粒的減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009。
[0009]其中，所述質(zhì)粒為pSVSPORT質(zhì)粒、pTrc99A質(zhì)粒、pcDNA3.1質(zhì)粒、pBR322質(zhì)粒或pET23a質(zhì)粒。所述質(zhì)粒通過電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)移至減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009中。所述的電轉(zhuǎn)化條件為電壓2400V，電阻400 Ω，電容25 μ F，放電時間4ms。
[0010]本發(fā)明還提出一種基因工程菌在制備治療前列腺癌的藥物上的應(yīng)用，所述基因工程菌為攜帶質(zhì)粒的減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009，且其中所述質(zhì)粒上克隆有L-methioninase 基因。
[0011]其中，所述的質(zhì)粒為pSVSPORT質(zhì)粒、pTrc99A質(zhì)粒、pcDNA3.1質(zhì)粒、pBR322質(zhì)?；騪ET23a質(zhì)粒。所述基因工程菌的構(gòu)建方法為:將L-methioninase基因亞克隆至質(zhì)粒中，得到L-methioninase表達(dá)質(zhì)粒,將Lnethioninase表達(dá)質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009,即得。所述的電轉(zhuǎn)化條件為電壓2400V，電阻400 Ω，電容25 μ F，放電時間4ms。
[0012]最為優(yōu)選，在構(gòu)建基因工程菌的過程中，當(dāng)選用pSVSPORT質(zhì)粒時，將L-methioninase基因通過Kpn I和Hind III酶切位點(diǎn)亞克隆至質(zhì)粒中，得到L-methioninase表達(dá)質(zhì)粒,然后將Lnethioninase表達(dá)質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009中得到基因工程菌。
[0013]上述減毒鼠傷寒沙門氏菌及其基因工程菌的給藥方式為瘤內(nèi)注射。
[0014]有益效果:減毒鼠傷寒沙門氏菌對前列腺癌細(xì)胞具有腫瘤靶向性及顯著的抑制效應(yīng)，同時，其與質(zhì)粒構(gòu)建的基因工程菌同樣具有腫瘤祀向性，且?guī)в锌寺∮蠰-methioninase基因的質(zhì)粒的減毒鼠傷寒沙門氏菌可以在腫瘤組織持續(xù)表達(dá)L-methioninase，大量消耗甲硫氨酸及其它營養(yǎng)物質(zhì)，使得腫瘤細(xì)胞缺乏營養(yǎng)，生長緩慢，因此可以用于制備治療前列腺癌的藥物。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1是質(zhì)粒pSVSPORT-L-methioninase酶切鑒定1%瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0016]圖2 是 Western blot 鑒定 methioninase 表達(dá)結(jié)果圖。
[0017]圖3是檢測沙門氏菌中methioninase活性結(jié)果圖。
[0018]圖4是注射沙門菌對裸鼠體重的影響結(jié)果圖。
[0019]圖5是瘤內(nèi)注射沙門菌在裸鼠體內(nèi)的分布結(jié)果圖；
[0020]圖6是給與數(shù)量為2 X IO4CFU沙門菌后腫瘤體積變化曲線圖。
[0021]圖7是給予數(shù)量為2X IO4CFU沙門菌3周后腫瘤的重量結(jié)果圖。
[0022]圖8是給予數(shù)量為2X IO4CFU沙門菌3周后腫瘤的大小結(jié)果圖。
[0023]圖9是給與數(shù)量為2 X IO6CFU沙門菌后腫瘤體積變化曲線圖。
[0024]圖10是給予數(shù)量為2X IO6CFU沙門菌3周后腫瘤的重量結(jié)果圖。
[0025]圖11是給予數(shù)量為2X IO6CFU沙門菌3周后腫瘤的大小結(jié)果圖。
[0026]圖12是分別給予2X 104CFU、2X IO6CFU沙門菌后的腫瘤體積占PBS組相對百分比結(jié)果圖。
[0027]圖13是給予2X IO6CFU沙門菌4周后腫瘤組織腫瘤增殖抗原ki67染色結(jié)果圖。【具體實(shí)施方式】
[0028]根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。
[0029]實(shí)施例1:基因工程菌的構(gòu)建。
[0030](I)構(gòu)建表達(dá)Lnethioninase基因的質(zhì)粒。
[0031]先合成L-methioninase (GenBank:L43133.1)基因亞克隆至 pUC57 質(zhì)粒(金斯瑞公司)，接著通過Kpn I和Hind III酶切位點(diǎn)亞克隆至pSVSPORT質(zhì)粒(invitrogen),得到pSVSPORT-L-methioninase表達(dá)質(zhì)粒。具體構(gòu)建過程如下:
[0032]將pSVSPORT質(zhì)粒用Kpn I和Hind III雙酶切，酶切體系為:2 μ g質(zhì)粒DNA，3 μ LlOXbuffer, 1.5μ L Kpn I 酶，1.5yL Hind III 酶，加入 ddH20 補(bǔ)足體積至 30 μ L，37°C溫浴3h。然后將酶切體系在I %的瓊脂糖凝膠中通過電泳分離，切出4.1kb大小的DNA條帶，用膠回收純化試劑盒純化DNA。
[0033]通過全基因合成得到L-methioninase編碼區(qū)域DNA片段亞克隆至pUC57質(zhì)粒(金斯瑞公司)，用Kpn I和Hind III雙酶切，酶切體系為:3 μ g質(zhì)粒DNA，3 μ LlOXbuffer，
1.5μ L Kpn I酶，L5yL Hind III酶，加入ddH20補(bǔ)足體積至30 μ L，37°C溫浴3h。然后將酶切體系在I %的瓊脂糖凝膠中通過電泳分離，切出1.2kb大小的DNA條帶，用膠回收純化試劑盒純化DNA。
[0034]將pSVSPORT(KpnI/Hind III)和L-methioninase編碼區(qū)域DNA片段(Kpn I/HindIII)連接，連接反應(yīng)中加入2 μ L載體、6 μ L插入片段、I μ L T4DNA連接酶，16°C溫浴16h。
[0035]將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coli DH5a (Takara)的感受態(tài)細(xì)胞中。取一管50yL的DH5 α感受態(tài)細(xì)胞置于冰上，待其融化后，向其中加入5μ L上述連接產(chǎn)物，輕彈混勻，后于冰上孵育30min ;42°C熱擊60s，后冰上靜置2min ;加入500 μ L無抗性的LB液體培養(yǎng)基，37°C震蕩培養(yǎng)Ih ;4000rpm離心5min，吸走，保留100 μ L左右的培養(yǎng)基，用移液器將細(xì)菌沉淀吹打均勻后涂布在含氨芐青霉素抗性的LB培養(yǎng)基平板上。然后將平板置于37°C溫箱培養(yǎng) 16h。
[0036]克隆生長出來后，挑單克隆菌落至3mL含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37°C震蕩培養(yǎng)16h，提取質(zhì)粒DNA，用Kpn I和Hind III酶切鑒定，陽性克隆中可得到4.lkb、1.2kb的兩條DNA條帶，如圖1所示。再通過測序進(jìn)一步確定陽性克隆的序列完全正確。
[0037](2)構(gòu)建攜帶質(zhì)粒的VNP20009菌和攜帶克隆有Lnethioninase的基因的質(zhì)粒的VNP20009 菌。
[0038]將pSVSPORT 和 pSVSPORT-Liethioninase 表達(dá)質(zhì)粒分別電轉(zhuǎn)化至 VNP20009 菌株(YS1646, ATCC號202165)，分別命名為VNP20009-V和VNP20009-M。具體構(gòu)建過程如下:
[0039]將感受態(tài)細(xì)菌VNP20009置于冰上，待其融化后移入預(yù)冷電轉(zhuǎn)杯，向其中加入2 μ L質(zhì)粒，輕彈混勻，于冰上孵育lmin。將電轉(zhuǎn)杯放入電轉(zhuǎn)儀，條件設(shè)置為電壓2400V，電阻400 Ω，電容25 μ F，放電時間4ms。電擊完立刻加入ImL SOC培養(yǎng)基，輕輕混勻。37°C震蕩培養(yǎng)Ih ；4000rpm離心5min，吸走，保留100 μ L左右的培養(yǎng)基，用移液器將細(xì)菌沉淀吹打均勻后涂布在含氨芐青霉素抗性的LB-O培養(yǎng)基平板上。然后將平板置于37°C溫箱培養(yǎng)16h。VNP20009-V和VNP20009-M用LB-O培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒，酶切鑒定正確。
[0040]取I X IO8沙門菌用蛋白裂解液提取蛋白，進(jìn)行10 % SDS-PAGE電泳，再穩(wěn)壓冰浴電轉(zhuǎn)至PVDF膜，BSA室溫封閉Ih后，TBST漂洗3X 5min，加入兔抗Liethioninase抗體(I:1000)，4°C孵育過夜。TBST漂洗3次，每次5min再加HRP標(biāo)記的抗兔二抗(1:10000)，室溫孵育lh，TBST漂洗3次，每次5min，ECL化學(xué)發(fā)光法顯影。結(jié)果如圖2所示，在分子量約43kD 處有特異性條帶，說明 VNP20009-M 與 VNP20009、VNP20009_V 相比，Liethioninase 表達(dá)量顯著提高。
[0041]將L-甲硫氨酸和吡哆醛分別與VNP20009、VNP20009-V和VNP20009-M菌體混合，37°C孵育IOmin后用50%三氯乙酸終止，離心取上清，與3-甲基_2_苯并噻唑啉酮腙鹽酸鹽水合物(MBTH)充分混勻，50°C孵育30min后，測定320nm處的吸光值，以每分鐘催化轉(zhuǎn)化I μ mol α -酮丁酸的酶量定義為I個酶活性單位。結(jié)果顯示(圖3)，沙門菌VNP20009-M的甲硫氨酸酶活性比VNP20009和VNP20009-V高10倍。
[0042]實(shí)施例2:VNP20009及其基因工程菌的抗腫瘤效果。
[0043]1、用含有10%胎牛血清的F-12K培養(yǎng)基培養(yǎng)雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞PC_3，以細(xì)胞數(shù)2 X IO6個皮下接種于裸鼠右側(cè)腋下。每隔2~3天，觀察小鼠狀態(tài)，用游標(biāo)卡尺測量腫瘤大小(體積=0.52X長X寬2)。待腫瘤體積達(dá)到0.1~0.2cm3時，將荷瘤裸鼠隨機(jī)分組:PBS 對照組、VNP20009、VNP20009-V 組和 VNP20009-M 組。 [0044]2、用 LB-O 培養(yǎng) VNP20009、VNP20009-V 和 VNP20009-M，當(dāng) OD ~0.6 時，收集菌體，然后用PBS重懸，以2X IO6CFU/只的劑量，采用瘤內(nèi)注射方式給藥，對照組注射同等體積PBS0給藥后，觀察裸鼠的活動、進(jìn)食、體重。結(jié)果如圖4所示，注射細(xì)菌后，小鼠體重未受影響。而且裸鼠的進(jìn)食、糞便也無異常，說明VNP20009、VNP20009-V和VNP20009-M對裸鼠無
明顯毒性。
[0045]3、給藥后分別在第ld、6d、12d和20d，取裸鼠不同組織，加PBS研磨勻漿，梯度稀釋后用LB平板培養(yǎng)過夜。結(jié)果如圖5所示，組織勻漿菌落計(jì)數(shù)定量結(jié)果，瘤內(nèi)注射細(xì)菌Id后，腫瘤組織中菌量為3.5X107CFU/g，而肝、腎等組織未檢出細(xì)菌；12d后，腫瘤組織中菌量為7.5X107CFU/g,而肝組織為I X 105CFU/g,比例約為750:1 ;20d后，腫瘤與其它組織菌量的比例約為6900:1~61000:1，說明VNP20009對于該種前列癌腫瘤有著較好的靶向性。
[0046]4、操作方法同1、2，沙門菌用量為2X104CFU/只，即低劑量組。給藥后每隔2_3d，測量腫瘤的長和寬，計(jì)算腫瘤體積，繪制裸鼠腫瘤體積變化曲線(圖6)。給藥后3周，對照組和實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)取3只，剝離裸鼠腫瘤，稱重，拍照(圖7、8)。結(jié)果如圖6所示，給予數(shù)量為2 X IO4CFU的沙門菌VNP20009-M后，腫瘤體積和重量約為PBS組的1/2。而給予等量的VNP20009、VNP20009-V沒有明顯的抑制腫瘤的效果。結(jié)果說明沙門菌VNP20009-M對于該前列腺癌腫瘤具有顯著的抑制效應(yīng)。
[0047]5、操作方法同上述1、2、4，將沙門菌用量增加到2X IO6CFU/只，即高劑量組。結(jié)果如圖9所示，給 予沙門菌VNP20009、VNP20009-V后，腫瘤生長緩慢，體積和重量約為PBS對照組的1/3。給予沙門菌VNP20009-M，大部分小鼠的腫瘤生長停滯，腫瘤體積和重量(圖10，11)約為VNP20009、VNP20009-V組的1/2，PBS對照組的1/4。在給藥后第4周取腫瘤組織用4%福爾馬林固定過夜，經(jīng)石蠟包埋切片，進(jìn)行腫瘤增殖抗原ki67染色。免疫組化結(jié)果(圖13)顯示，VNP20009-M組的腫瘤組織，ki67染色陽性率比PBS對照組、VNP20009-V組降低，說明細(xì)胞的增殖減少。綜合對比給予不同劑量VNP20009、VNP20009-V和VNP200009-M的抗腫瘤效應(yīng)(圖12)，結(jié)果顯示隨著使用劑量的增加，各組的抑瘤效果都明顯增強(qiáng)。在相同劑量下，VNP20009和VNP20009-V抑瘤效果相似，兩組之間沒有顯著區(qū)別。低劑量的VNP20009和VNP200009-V沒有表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤效應(yīng)，而低劑量VNP20009-M已經(jīng)明顯抑制了腫瘤增長。但是提高沙門菌的注射劑量后，各組都表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤效果，尤其是VNP200009-M,使用3周后抑瘤率接近90%。這些結(jié)果說明，沙門菌VNP20009、VNP20009-V和VNP20009-M均能抑制該前列腺癌細(xì)胞的增殖，從而抑制了腫瘤的發(fā)展。
[0048]上述結(jié)果表明，本發(fā)明所采用的減毒鼠傷寒沙門氏菌不僅有良好的抗腫瘤效果，并且能靶向腫瘤部位,在腫瘤中富集。
[0049]本發(fā)明表明減毒鼠傷寒沙門氏菌對前列腺癌細(xì)胞具有腫瘤靶向性及顯著的抑制效應(yīng)。同時，其與質(zhì)粒構(gòu)建的基因工程菌同樣具有腫瘤靶向性，且?guī)в锌寺∮蠰-methioninase基因的質(zhì)粒的減毒鼠傷寒沙門氏菌可以在腫瘤組織持續(xù)表達(dá)L-methioninase,大量消耗甲硫氨酸及其它營養(yǎng)物質(zhì),使得腫瘤細(xì)胞缺乏營養(yǎng),生長緩慢，因此可以用于制備治療前列腺癌的藥物。上述質(zhì)粒并不局限于pSVSPORT質(zhì)粒，pTrc99A質(zhì)粒、pcDNA3.1質(zhì)粒、pBR322質(zhì)粒或pET23a質(zhì)粒以及克隆有L-methioninase基因的上述質(zhì)粒同樣具有類似效果。
【權(quán)利要求】
1.一種減毒鼠傷寒沙門氏菌在制備治療前列腺癌的藥物上的應(yīng)用，所述減毒鼠傷寒沙門氏菌為減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009。
2.—種基因工程菌在制備治療前列腺癌的藥物上的應(yīng)用，所述基因工程菌為攜帶質(zhì)粒的減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的質(zhì)粒為pSVSPORT質(zhì)粒、pTrc99A質(zhì)粒、pcDNA3.1質(zhì)粒、pBR322質(zhì)?；騪ET23a質(zhì)粒。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述質(zhì)粒通過電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)移至減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009中。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的電轉(zhuǎn)化條件為電壓2400V，電阻400 Ω，電容25 μ F，放電時間4msο
6.一種基因工程菌在制備治療前列腺癌的藥物上的應(yīng)用，所述基因工程菌為攜帶質(zhì)粒的減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009，且其中所述質(zhì)粒上克隆有L-methioninase基因。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的質(zhì)粒為pSVSPORT質(zhì)粒、pTrc99A質(zhì)粒、pcDNA3.1質(zhì)粒、pBR322質(zhì)?；騪ET23a質(zhì)粒。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述基因工程菌的構(gòu)建方法為:將L-methioninase基因 亞克隆至質(zhì)粒中，得到L-methioninase表達(dá)質(zhì)粒，將L-methioninase表達(dá)質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009，即得。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的電轉(zhuǎn)化條件為電壓2400V，電阻400 Ω，電容25 μ F，放電時間4msο
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，在構(gòu)建基因工程菌的過程中，當(dāng)選用pSVSPORT質(zhì)粒時，將L-methioninase基因通過Kpn I和Hind III酶切位點(diǎn)亞克隆至質(zhì)粒中，得到L-methioninase表達(dá)質(zhì)粒,然后將Lnethioninase表達(dá)質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009中得到基因工程菌。
11.根據(jù)權(quán)利要求1或2或6所述的應(yīng)用，其特征在于，給藥方式為瘤內(nèi)注射。
【文檔編號】C12N15/74GK103961721SQ201410183149
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年4月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月30日
【發(fā)明者】趙子建, 周素瑾, 林艷, 趙正剛, 李芳紅 申請人:南京華貞生物醫(yī)藥科技有限公司