一種來源于海洋放線菌的熱穩(wěn)定脂肪酶及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種來源于海洋放線菌的熱穩(wěn)定脂肪酶及其應用，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO:2所示；該熱穩(wěn)定脂肪酶基因序列如SEQ?ID?NO:1所示。本發(fā)明獲得中性脂肪酶，在pH7.0具有最適酶活性，其對橄欖油的水解反應中，最適溫度為70℃；對大豆卵磷脂為底物的水解反應中，最適反應溫度為40℃。同時該脂肪酶還具有極好的熱穩(wěn)定性，60℃處理半小時仍然具有95％的酶活性剩余。對有機溶劑有較強的耐受性。本發(fā)明的脂肪酶可適用于高溫下催化植物油進行甘油酯的水解和生成甘油二酯。采用所述方法得到的重組脂肪酶，具有較高的催化活性和熱穩(wěn)定性。
【專利說明】一種來源于海洋放線菌的熱穩(wěn)定脂肪酶及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程和酶工程領域，具體的說，涉及一種優(yōu)化的海洋微生物來源的熱穩(wěn)定脂肪酶，其編碼基因，及含有該編碼基因的重組質粒和用于表達目標脂肪酶蛋白的重組菌株；本發(fā)明還涉及所表達的熱穩(wěn)定脂肪酶的應用。
【背景技術】
[0002]脂肪酶(lipase，EC3.1.1.3，甘油酯水解酶)是催化甘油酯酯鍵水解成更少酯鍵的甘油酯或者甘油及脂肪酸的一類酶。脂肪酶反應條件溫和，具有優(yōu)良的立體選擇性。另外，脂肪酶以其來源廣泛、催化功能多樣和催化底物類型廣泛(酯、酸、醇、酸酐、酰胺等都可以成為它的底物)等優(yōu)點，以及對環(huán)境不會造成污染等特點，使它在食品、制革、水產、生物化工、造紙、油脂化工、醫(yī)藥、飼料和洗滌劑等許多工業(yè)領域中均有廣泛的應用。目前脂肪酶已經成為重要的工業(yè)用酶之一，它們在工業(yè)研究中的發(fā)展相當迅速。[0003]脂肪酶應用研究日益增加，目前在脂肪酶的應用中，主要的障礙包括如下幾點:一是成本高，這一點已由固定化技術得到大大改進；二是穩(wěn)定性與活性，這正是當今生化研究集中解決的問題。酶分子的穩(wěn)定性作為一項重要性質，對酶催化功能的發(fā)揮有著重要的影響?？墒?，由于酶的穩(wěn)定性往往受到諸多因素的共同影響而決定，因此對于穩(wěn)定性酶的篩選一直是生物學和化學領域的難點。三是野生型產脂肪酶的微生物菌株代謝產物復雜，繁瑣的提取純化步驟提高了生產成本，降低了經濟效益。因此如何尋找性能更加穩(wěn)定的新型脂肪酶及構建高產酶水平的基因工程菌株是目前酶制劑行業(yè)關注的焦點。
[0004]微生物所產的脂肪酶種類最多，由于具有比動植物脂肪酶更廣范圍的反應溫度、反應pH值、以及對底物的選擇專一性，使其便于進行工業(yè)化生產和獲得高純度酶制劑，這些因素促進了微生物脂肪酶的研究，也極大地帶動脂肪酶在各領域中的基礎和實際應用等方面的研究。因此，從豐富的海洋微生物資源中開發(fā)新型脂肪酶，篩選具有應用前景的脂肪酶具有重要的現實意義。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種新型的海洋微生物來源的熱穩(wěn)定脂肪酶，以使其滿足工業(yè)上的需要。
[0006]本發(fā)明的第一個方面公開了一種新型來自放線菌(Streptomyces sp.strainW007)的熱穩(wěn)定脂肪酶，其含有如SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列。
[0007]本發(fā)明的另一個方面，提供了一種編碼上述脂肪酶的優(yōu)化的核酸分子，獲得在畢赤酵母聞表達的熱穩(wěn)定脂肪酶。具有如SEQ ID NO:1所不的核酸序列。
[0008]本發(fā)明的第三個方面，提供了一種載體，其包含上述多核苷酸。
[0009]本發(fā)明的第四個方面，提供了一種細胞，其包含上述載體，或其基因組中整合有上述多核苷酸。
[0010]本發(fā)明的第五個方面，提供了上述脂肪酶的用途，可用于油脂加工。[0011]本發(fā)明的第六個方面，提供了一種生產上述脂肪酶的方法，包括:培養(yǎng)上述宿主細胞，從培養(yǎng)物中分離出表達產物。
[0012]本發(fā)明的技術方案具體如下:
[0013]一種來源于海洋放線菌的熱穩(wěn)定脂肪酶，是在對放線菌(Streptomycessp.strain W007)熱穩(wěn)定脂肪酶基因序列進行優(yōu)化的基礎上獲得，其氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示。
[0014]一種熱穩(wěn)定脂肪酶基因，序列如SEQ ID NO:1所示。
[0015]包含權利要求2所述脂肪酶基因的表達載體。
[0016]一種細胞，包含權利要求3所述的表達載體，或其基因組中整合有權利要求2所述的脂肪酶基因。
[0017]一種熱穩(wěn)定脂肪酶重組菌株的制備方法，包括如下步驟:
[0018](I)制備熱穩(wěn)定脂肪酶表達質粒:
[0019]a.人工合成權利要求2的基因序列；
[0020]b.將上述擴 增基因PCR產物經DNA純化后，限制性內切酶Kpn I和SalI分別對純化的基因片段和質粒PGAPZaA進行雙酶切消化，連接，轉化至大腸桿菌E.coli DH5 a感受態(tài)細胞，得到脂肪酶表達質粒；
[0021](2)利用表達質粒制備重組菌株:
[0022]a.將步驟⑴的脂肪酶表達質粒經限制性內切酶Bln I線性化后，電轉至宿主細胞；
[0023]b.將轉化液涂布于含有100mg/ml Zeocin的YPD平板中，30°C培養(yǎng)3天后，平板上長出酵母單菌落為熱穩(wěn)定脂肪酶重組菌株。
[0024]步驟⑴所述PCR的引物序列如下:
[0025]MASlFor5> -TACTGGTACCGCCACGCCAGCTGCTGAGGC-3’
[0026]MASlRev5’ -AGCTCTCGAGTCAGTGATGGTGGTGATGGTG-3’。
[0027]步驟(2)所述宿主細胞為巴斯德畢赤酵母X-33 (Pichia pastoris)。
[0028]一種生產上述脂肪酶的方法，包括:培養(yǎng)權利要求5所述的細胞，從培養(yǎng)物中分離出表達產物。
[0029]上述熱穩(wěn)定脂肪酶用于催化甘油酯的水解或合成甘油二酯。
[0030]與現有技術相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點:
[0031](I)本發(fā)明獲得的MASl是首個海洋微生物來源的具有熱穩(wěn)定性的中性甘油三酯酶，在pH7.0具有最適酶活性,其對橄欖油的水解反應中，最適溫度為70°C ;對大豆卵磷脂為底物的水解反應中，最適反應溫度為40°C。同時該脂肪酶還具有極好的熱穩(wěn)定性，60°C處理半小時仍然具有95%的酶活性剩余。對有機溶劑(甲醇、乙醇、異丙醇和丙酮)有較強的耐受性。
[0032](2)本發(fā)明所得畢赤酵母表達菌株具有良好地水解TAG和DAG等甘油酯的活性，可用于植物油催化甘油酯的水解、生成甘油二酯和制備新型結構脂。采用所述方法得到的重組脂肪酶，具有較高的催化活性和熱穩(wěn)定性。因此，MASl可作為生物催化劑，應用于食品化工、水解油和脂肪、洗滌劑生產和污水處理等領域中。【專利附圖】

【附圖說明】
[0033]圖1為來自放線菌W007的編碼脂肪酶的核酸序列MASl及其優(yōu)化后的編碼脂肪酶的核酸序列 MASl_optimum(SEQ ID NO:1)。
[0034]圖2為放線菌W007來源的脂肪酶MASl在質粒pGAPZ a A上的重組子結構圖。
[0035]圖3為巴斯德畢赤酵母X-33 (Pichia pastoris)表達放線菌W007來源的脂肪酶的最適反應溫度，以溫度對相對酶活力)作圖。
[0036]圖4為巴斯德畢赤酵母X-33 (Pichia pastoris)表達放線菌W007來源的脂肪酶的最適反應pH，以pH對相對酶活力(％ )作圖。
[0037]圖5為巴斯德畢赤酵母X-33 (Pichia pastoris)表達放線菌W007來源的脂肪酶的熱穩(wěn)定性，以溫度對殘余酶活力(％ )作圖。
[0038]圖6為巴斯德畢赤酵母X-33 (Pichia pastoris)表達放線菌W007來源的脂肪酶的pH穩(wěn)定性，以pH對殘余酶活力(％ )作圖。
[0039]圖7為巴斯德畢赤酵母X-33 (Pichia pastoris)表達放線菌W007來源的脂肪酶的溫度對脂肪酶酶活的影響。
[0040]圖8為巴斯德 畢赤酵母X-33 (Pichia pastoris)表達放線菌W007來源的脂肪酶的PH對脂肪酶酶活的影響。
[0041]圖9為巴斯德畢赤酵母X-33 (Pichia pastoris)表達放線菌W007來源的脂肪酶的溫度對磷脂酶酶活的影響。
[0042]圖10為巴斯德畢赤酵母X-33 (Pichia pastoris)表達放線菌W007來源的脂肪酶的PH對磷脂酶酶活的影響。
[0043]圖11為巴斯德畢赤酵母X-33 (Pichia pastoris)表達放線菌W007來源的脂肪酶純化后樣品的SDS-PAGE電泳圖。泳道一是蛋白分子量marker，泳道二是純化后的MASl。
[0044]圖12為脂肪酶的脂肪酸底物鏈長選擇性圖。
[0045]圖13為脂肪酶的催化植物油水解反應隨時間變化的圖，A為富含甘油三酯的茶油水解反應后的各脂類組成，B為富含甘油二酯的油脂水解反應后的各脂類組成。
[0046]圖14為脂肪酶催化植物油水解的標準色譜圖。
【具體實施方式】
[0047]下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步具體詳細描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此，對于未特別注明的工藝參數，可參照常規(guī)技術進行。
[0048]實施例1
[0049]脂肪酶MASl畢赤酵母表達載體的構建
[0050]根據Genbank的放線菌W007熱穩(wěn)定性脂肪酶mas I基因(GenBank登錄號:WP_007448656)，委托上海生工生物工程公司利用人工合成的方法，并根據畢赤酵母密碼子偏好性對序列進行優(yōu)化(序列SEQ ID NO:1)?；蚝铣珊?，利用引物MASlFor:5’-TACTGGTACCGCCACGCCAGCTGCTGAGGC-3’ (SEQ ID NO: 3)及MASlRev:5’-AGCTCTCGAGTCAGTGATGGTGGTGATGGTG-3’ (SEQ ID NO:4)擴增成熟肽序列，PCR 擴增條件:94°C 5min ；94°C 20s, 53°C 30s,72°C 80s，25個循環(huán)；72°C 7min。PCR擴增產物經DNA純化試劑盒純化后，限制性內切酶KpnI和Sal I分別對純化的基因片段和質粒pGAPZ a A (購自Invitrogen)進行雙酶切消化，連接，轉化至大腸桿菌E.coli DH5 α感受態(tài)細胞。涂布于LB (含25ug/ml Zeocin)平板。挑取陽性克隆通過Kpn I和Sal I雙酶切鑒定及基因測序，結果表明獲得了 pGAPZ a A-MASl表達質粒。
[0051]實施例2
[0052]脂肪酶MASl的重組表達及純化
[0053]將脂肪酶MASl表達質粒經限制性內切酶Bln I線性化后，電轉至畢赤酵母Χ_33(購自Invitrogen)感受態(tài)細胞。將轉化液涂布于YPD(100ug/mL Zeocin)平板，30°C培養(yǎng)3天后，挑取平板上單菌落于IOOmL YPD培養(yǎng)基中發(fā)酵72小時后，離心并濃縮發(fā)酵液進行SDS-PAGE檢測，獲得能夠表達脂肪酶MASl陽性重組菌株。
[0054]將重組菌株接種至IOOmL YPD培養(yǎng)基中，30°C，200rpm振蕩培養(yǎng)48-72小時后，收集發(fā)酵上清液(10, OOOrpm,離心20min,4°C )。
[0055]將MASl重組菌株的發(fā)酵上清液用0.45 μ m的濾膜抽濾。后用IOkD膜胞(Vivaflow200, Sartorius, Germany)將發(fā)酵液置換成 20mM ρΗ7.4 含 30mM 咪唑的憐酸鹽緩沖液，并將發(fā)酵液濃縮到大約30mL。濃縮發(fā)酵上清利用鎳螯合親和層析柱(HisTrap HPcolumn, GE Healthcare),流速lmL/min,最后用20mM pH7.4含500mM咪唑的磷酸鹽緩沖液洗脫目標蛋白。利用SDS-PAGE電泳對純化的重組蛋白進行純度鑒定(見圖11)。
[0056]實施例3
[0057]最適溫度及溫度穩(wěn)定性 [0058]溫度對MASl脂肪酶酶活的影響:在不同溫度(20°C -75°C )條件下，采用比色法測定MASl酶活。反應體系包括IOOmM Na2HPO4-NaH2PO4 (pH7.0)，ImM對硝基苯酚辛酸酯(p-nitrophenol caprylate, p-NPc), 10 μ L 酶液,各溫度下反應 5min,測定 405nm 處的吸光值0D4(i5。溫度對MASl酶活的影響用相對酶活表示，測定的最大酶活定為100%。所有實驗重復三次。結果表明MASl的最適反應溫度是40°C，在60°C達到了 90%的相對酶活(見圖3)。
[0059]測定MASl在不同溫度條件下的穩(wěn)定性時，首先將MASl在不同的溫度(30°C、40°C、50°C、60°C和70°C )條件下溫育，分別在0.5h、lh、l.5h、2h取樣，采用比色法測定其剩余酶活。溫度對MASl穩(wěn)定性的影響用相對酶活表示，測定的最大酶活定為100%。所有實驗重復三次。結果表明MASl在30°C -50°C處理2h后，MASl能保持95%以上的脂肪酶酶活力。在60°C處理Ih后，能保持80%的酶活。表明MASl是一個熱穩(wěn)定脂肪酶(見圖5)。
[0060]實施例4
[0061 ] 最適pH及pH穩(wěn)定性
[0062]pH對MASl酶活的影響:在不同ρΗ(5.0、6.0、7.0、8.0和9.0)條件下，采用比色法測定MASl酶活。酶活測定反應體系和反應條件參考實施例3。使用的各種pH溶液為:IOOmM NaAc-HAc 溶液(ρΗ3.0、ρΗ4.0、ρΗ5.0)，IOOmM Na2HPO4-NaH2PO4 溶液(ρΗ6.0, ρΗ7.0)，50mM Tris-HCl溶液(pH8.0)。pH對MASl酶活的影響用相對酶活來表示，測定的最大酶活定為100%。所有實驗重復三次。結果表明MASl的最適pH值是7.0 (見圖4)。
[0063]測定MASl在不同pH條件下的穩(wěn)定性時，首先將MASl在不同的pH(3.0、4.0、5.0、
6.0,7.0,8.0和9.0)條件下放置12h，測定MASl的剩余酶活力。酶活測定反應體系和反應條件參考實施例3。pH對MASl穩(wěn)定性的影響用相對酶活表示，測定的最大酶活定為100%。所有實驗重復三次。結果表明MASl在pH3.0-9.0處理2h后，MASl在pH6.0-9.0保持95%以上的脂肪酶酶活。表明MASl是一個偏堿性的脂肪酶(見圖6)。
[0064]實施例5
[0065]橄欖油乳化法測定脂肪酶酶活
[0066]在對照組和實驗組的IOOmL三角瓶中，各加底物溶液(4% PVA溶液:橄欖油，3:1)4.0OmL和相應pH值緩沖液5.0OmL,對照組中加入95%乙醇15.0OmL,在特定溫度下水浴預熱5min，然后，在兩瓶中各加待測酶液1.0OmL,在特定溫度水浴中準確反應15min，在實驗組中立即補加95%乙醇15.0OmL終止反應，取出。對照組和實驗組溶液在自動滴定儀下用0.05mol/L NaOH標準溶液滴定，以滴定曲線的拐點為滴定終點，記錄消耗NaOH標準溶液的體積，按下式計算酶活力。
[0067]X= (V — VO) X 1/15XηXc/0.05X50 = 200X (V - VO) XnXc/33-1
[0068]其中:X為樣品的酶活力(U/mL)；
[0069]V為滴定樣品時消耗NaOH標準溶液的體積(mL)；
[0070]VO為滴定空白時消耗NaOH標準溶液的體積(mL)；
[0071]c為NaOH標準溶液濃度(mol/L)； [0072]0.05為NaOH標準溶液濃度換算系數；
[0073]50為0.5mol/LNa0H標準溶液1.0OmL相當于脂肪酸50 μ mo I ；
[0074]15為反應時間(min)；
[0075]η為稀釋倍數。
[0076]脂肪酶活力的定義為:lmL酶液于特定溫度與pH值的條件下，水解脂肪每分鐘產生I微摩爾(ymol)的脂肪酸所需的酶量即為I個脂肪酶單位，以U/mL表示。
[0077]結果表明MASl在以橄欖油為底物的反應中的最適溫度為70°C，最適pH值是7.0(見圖7和圖8)。
[0078]實施例6
[0079]大豆卵磷脂法測定磷脂酶酶活
[0080]在對照組和實驗組的IOOmL三角瓶中，各加底物溶液(4 %無油磷脂溶于0.5 %PVA) 25.0OmL，對照組中加入95%乙醇15.00mL，在特定溫度下水浴預熱5min，然后，在兩瓶中各加待測酶液1.00mL，在特定溫度水浴中準確反應15min，在實驗組中立即補加95%乙醇15.0OmL終止反應，取出?？瞻缀蜆悠啡芤涸谧詣拥味▋x下用0.05mol/L NaOH標準溶液滴定，以滴定曲線的拐點為滴定終點，記錄消耗NaOH標準溶液的體積，按下式計算酶活力。[0081 ]計算公式 X = (V — V0) *c*50*n/ (0.05*t) = 103* (V — V0) *c*n/t 式 2-1
[0082]其中:X —樣品的酶活力，U/mL ；
[0083]V 一滴定樣品時消耗的NaOH標準溶液體積，ml ；
[0084]VO 一滴定空白時消耗的NaOH標準溶液體積，ml ；
[0085]c - NaOH標準溶液的濃度，mol/L ；
[0086]50 - 0.05mol/L NaOH 標準溶液 1.0Oml 相當于脂肪酸 50 μ mo I ；
[0087]η 一酶液樣品的稀釋倍數；
[0088]t 一測定酶活時的反應時間。
[0089]磷脂酶酶活力定義為:在特定條件下Imin水解磷脂產生I微摩爾(μ mol)量游離脂肪酸所需的酶量即為一個磷脂酶活力單位(U)。Lecitase? Ultra為液體酶制劑，其磷脂酶活力表示為每mL酶液所測得的磷脂酶活力單位，即U/mL。
[0090]結果表明MASl在以大豆卵磷脂為底物的反應中的最適溫度為40°C,最適pH值是
7.0(見圖9和圖10)。
[0091]實施例7
[0092]MASl的脂肪酸底物鏈長選擇性
[0093]不同脂肪酸鏈長的ImM對硝基苯酚酯作為底物，采用比色法測定MASl酶活。酶活測定反應體系和反應條件參考實施例3。不同鏈長底物對MASl酶活的影響用相對酶活表示，測定的最大酶活定為100%。所有實驗重復三次。結果表明MASl對C8底物的水解活性最大(見圖12)。
[0094]實施例8
[0095]富含TAG、DAG茶油的水解
[0096]在25mL具塞 三角瓶中加入3mL的茶油和來源于茶油的甘油二酯(純度達到96%以上)，加入經純化后的MAS1，加脂肪酶量為100U/mL(U/v，相對于油脂體積)酶液，酶液利用20mM pH7.4的磷酸鹽緩沖溶液稀釋至lmL，混合均勻后預熱20min。反應溫度為40°C，搖床轉速為200rpm,反應過程中分別在0.5h, lh, 2h, 3h, 4h, 5h, 6h, 8h及12h進行取樣。將所取10 μ L樣品溶于ImL的流動相中，流動相的比例為:正己烷/異丙醇/甲酸=15:1:0.003 (體積比)，震蕩均勻后，于10，OOOrpm下離心5min，除去下層水相，將上層有機相用0.45 μ m的有機相濾膜過濾后，取10 μ L進行HPLC分析。
[0097]HPLC 檢測的條件為:色譜柱為 Luna5u SilicalOOA, 250X4.60mm(phenomenex),流動相為正己烷:異丙醇:甲酸=15:1:0.003(體積比)；流動相流速為1.0mL/min，柱溫保持30°C;進樣量為10 μ L，每個樣品檢測時間約為30min，數據處理軟件為Breeze工作站。脂肪酶MASl對不同底物的水解反應后各脂類組分含量的變化(見圖13)。在脂肪酶MASl催化的水解甘油三酯(Triacylglycerol, TAG)反應中，甘油三酯的含量可顯著下降，同時生成1，3位甘油二酯和I, 2-位甘油二酯(I, 3-DAG和I, 2-DAG)及自由脂肪酸(free fattyacids, FFA)。表明脂肪酶MASl可催化水解甘油三酯。在脂肪酶MASl催化的水解甘油二酯(Diacylglycerol, DAG)反應中，甘油二酯含量顯著下降，同時生成I位或者3位單甘油酯(1/3-monoacylglycerol, 1/3-MAG)和自由脂肪酸,表明脂肪酶MASl可催化水解甘油二酯。
[0098]實施例9
[0099]有機溶劑耐受性
[0100]在MASl酶液中分別加入各種有機溶劑:甲醇、乙醇、異丙醇和丙酮，濃度為50%(v/v)，4°C，放置2h，采用比色法測定MASl剩余酶活。酶活測定反應體系和反應條件參考實施例3。各種有機溶劑對MASl穩(wěn)定性的影響用相對酶活表示，未經有機溶劑處理過的MASl的酶活定為100%。
[0101]表1.MASl對有機溶劑的耐受性
【權利要求】
1.一種來源于海洋放線菌的熱穩(wěn)定脂肪酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.一種熱穩(wěn)定脂肪酶基因，其特征在于，基因序列如SEQ ID N0:1所示。
3.包含權利要求2所述脂肪酶基因的表達載體。
4.一種細胞，其特征在于，其包含權利要求3所述的表達載體，或其基因組中整合有權利要求2所述的脂肪酶基因。
5.一種熱穩(wěn)定脂肪酶重組菌株的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)制備熱穩(wěn)定脂肪酶表達質粒: a.人工合成權利要求2的基因序列； b.將上述擴增基因PCR產物經DNA純化后，限制性內切酶KpnI和SalI分別對純化的基因片段和質粒PGAPZaA進行雙酶切消化，連接，轉化至大腸桿菌E.coli DH5 a感受態(tài)細胞，得到脂肪酶表達質粒； (2)利用表達質粒制備重組菌株: a.將步驟(1)的脂肪酶表達質粒經限制性內切酶BlnI線性化后，電轉至宿主細胞； b.將轉化液涂布于含有100mg/mlZeocin的YPD平板中，30°C培養(yǎng)3天后，平板上長出酵母單菌落為熱穩(wěn)定脂肪酶重組菌株。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟⑴所述PCR的引物序列如下:
MASlFor5，-TACTGGTACCGCCACGCCAGCTGCTGAGGC-3，
MASlRev5’ -AGCTCTCGAGTCAGTGATGGTGGTGATGGTG-3’。
7.根據權利要求5或6所述的方法，其特征在于，步驟(2)所述宿主細胞為巴斯德畢赤酵母 X-33 (Pichia pastoris)。
8.權利要求5或6或7所述的方法制備的重組菌株。
9.權利要求1所述的脂肪酶的制備方法，其特征在于，包括:培養(yǎng)權利要求5所述的細胞，從培養(yǎng)物中分離出表達產物。
10.權利要求1所述熱穩(wěn)定脂肪酶的應用，其特征在于，該脂肪酶用于催化甘油酯的水解或合成甘油二酯。
【文檔編號】C12R1/84GK103952385SQ201410182668
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年4月30日 優(yōu)先權日:2014年4月30日
【發(fā)明者】王永華, 元冬娟, 藍東明, 王方華, 楊博 申請人:華南理工大學